Regulacija ekspresije gena kod prokariota

Regulacija ekspresije gena kod prokariota

Bakterije Jednoćelijski organizmi koji nemaju jedro i druge organele. Geni u najvećem broju slučajeva ne poseduju introne i većina gena organizovana je u operone. Operon - grupa gena čiji proteinski produkti imaju srodnu funkciju ili učestvuju u istom metaboličkom procesu, pri čemu se prepisuju sa istog promotora i zajednički su regulisani. Policistronska irnk - prepisana je sa operona i nosi informaciju za sintezu većeg broja proteina.

Transkripcija prokariotskih gena Konstitutivni i inducibilni proteini Ekspresija inducibilnih proteina indukovana signalima (najčešće spoljašnjim signalima).

Ekspresija prokariotskih gena Transkripcija i translacija kuplovani procesi kod prokariota. Ekspresija gena je usklađena sa ćelijskim potrebama za određenim proteinom i strogo je regulisan proces. Regulacija ekspresije gena moguća je na svakom koraku ekspresije gena, ali najčešće se odvija na nivou transkripcije.

Regulacija ekspresije gena Izbor promotora glavni mehanizam regulacije ekspresije gena i kod prokariota i kod eukariota. Sigma faktor RNK polimeraza Promotor

Regulatorni proteini Proces ekspresije gena kod prokariota regulisan je posebnom klasom proteina - regulatornim proteinima transkripcije. Oni predstavljaju vezu gena sa signalima koji kontrolišu proces transkripcije. Kada se bakterije kultivišu u in vitro uslovima spoljašnji signali su..

Regulacija ekspresije gena kod prokariota I u odsustvu regulatornih proteina RNK polimeraza ima mogućnost vezivanja za promotor i prepisivanja gena. Ovaj proces zove se konstitutivna ekspresija i on obezbeđuje bazalni nivo ekspresije gena. Promotor

Regulatorni proteini transkripcije Aktivatori transkripcije proteini koji imaju pozitivan efekat na ekspresiju gena. Represori transkripcije proteini koji imaju negativan efekat na ekspresiju gena, odnosno na njenu redukciju ili potpunu blokadu.

Regulatorne sekvence Aktivatori i represori transkripcije vezuju se za molekul DNK na način koji je specifičan za sekvencu. Sekvence koje ovi proteini prepoznaju i za koje se vezuju u molekulu DNK nazivaju se regulatorne sekvence. Regulatorni proteini sa suprotnim efektom na transkripciju kod prokariota poseduju različite regulatorne sekvence. One se nalaze u blizini ili u samom promotoru.

Represori transkripcije Regulatorne sekvence u okviru promotora za koje se vezuju represori transkripcije nazivaju se represorne sekvence. Represorne sekvence u okviru promotora operona nazivaju se operatori. Vezivanjem za represornu sekvencu, represor blokira vezivanje i/ili aktivnost RNK polimeraze.

Aktivatori transkripcije Aktivator pomaže vezivanje RNK polimeraze za promotor (jednom svojom površinom aktivator se vezuje za mesto vezivanja na molekulu DNK, a drugom površinom za enzim RNK polimerazu). Mehanizam kojim aktivator transkripcije pomaže vezivanje RNK polimeraze za promotor naziva se regrutovanje.

Aktivatori transkripcije U slučajevima kada svoje dejstvo ispoljavaju nakon vezivanja RNK polimeraze za promotor, aktivatori dovode do konformacione promene RNK polimeraze. Konformaciona promena RNK polimeraze omogućava tranziciju zatvorenog u otvoreni kompleks transkripcije. Ovaj način aktivacije transkripcije naziva se alosterična aktivacija enzima RNK polimeraze.

Ekspresija gena može biti regulisana i većim brojem spoljašnjih signala. Svaki signal može komunicirati sa posebnim regulatornim proteinom. Međusobnom interakcijom regulatorni proteini omogućavaju integraciju različitih signala koja utiče na ekspresiju jednog gena.

Kooperativan način vezivanja regulatornih proteina Proteini koji menjaju arhitekturu molekula DNK su DNK vezujući proteini koji pomažu u kooperativnom načinu vezivanja drugih DNK vezujućih proteina

Regulatorni proteini transkripcije Pored alosterične promene enzima RNK polimeraze i regulatorni proteini mogu menjati svoju konformaciju. Tipičan prokariotski regulatorni protein javlja se u dve konformacije: jedna koja omogućava i druga koja blokira njegovo vezivanje za molekul DNK. Konformacija regulatornih proteina zavisi od interakcije sa signalom kojim je i regulisana njegova aktivnost i ekspresija gena.

Laktozni operon

Laktozni operon Glukoza je glavni izvor energije za ćeliju E. coli. U situacijama kada glukoze nema u ćeliji, bakterija kao izvor energije koristi druge dostupne šećere. Laktozni operon je skup gena čiji proteinski produkti učestvuju u transportu i razgradnji disaharida laktoze.

lacz gen kodira protein β-galaktozidazu koji razlaže laktozu na galaktozu i glukozu. lacy gen kodira protein laktoznu permeazu koji je lokalizovan u ćelijskoj membrani i učestvuje u transportu laktoze. laca gen kodira enzim koji učestvuje u procesima oslobađanja toksičnih tiogalaktozida iz ćelije.

Laktozni operon Bazalni nivo ekspresije operona registrovan je u bakterijskim ćelijama u kojima je prisutna i laktoza i glukoza. Lac operon eksprimira se u visokom nivou kada je u ćeliji prisutna laktoza, a odsustvuje glukoza.

Regulatorni proteini laktoznog operona Ekspresija laktoznog operona regulisana je sa dva regulatorna proteina (aktivatorom i represorom transkripcije). Oba regulatorna proteina su DNK vezujući proteini a njihova aktivnost koordinisana je različitim signalima.

Lac represor Represor laktoznog operona naziva se Lac represor i njega kodira gen laci koji se nalazi u blizini operona, ali poseduje sopstveni promotor i samostalno se eksprimira. U uslovima kada se u ćeliji ne nalazi laktoza, Lac represor blokira ekspresiju laktoznog operona.

Protein CAP Laktozni aktivator poznat je pod skraćenicom CAP (eng. Catabolite Activator Protein). Neki autori ga nazivaju i protein CRP (eng. camp Receptor Protein). U prisustvu laktoze i odsustvu glukoze, CAP aktivator stimuliše ekspresiju laktoznog operona.

Šećer laktoza je signal koji je povezan sa Lac represorom Prisustvo laktoze je signal koji dovodi do inaktivacije Lac represora čime se blokira njegovo vezivanje za operator i na taj način se omogućava transkripcija laktoznog operona. https://www.youtube.com/watch?v=obwtxdi1zvk

Protein CAP aktivator transkripcije Kada u ćeliji nema glukoze dolazi do aktivacije proteina CAP. Mesto vezivanja aktivatora CAP nalazi se 60 bp uzvodno od mesta starta transkripcije. Aktivator se u formi dimera vezuje za svoje mesto vezivanja i regrutuje enzim RNK polimerazu.

Samo vezivanje CAP aktivatora za CAP mesto na molekulu DNK nije dovoljno za njegov pozitivan efekat na ekspresiju laktoznog operona. Pored domena za vezivanje za molekula DNK, aktivatori poseduju i tzv. aktivirajući domen. Aktivirajući domen omogućava kontakt (protein-protein interakciju) aktivatora i enzima RNK polimeraze. Zahvaljujući aktivirajućem domenu aktivator ima sposobnost regrutovanja RNK polimeraze. Ispitivanjem mutiranih RNK polimeraza utvrđeno je C- terminalni domen α subjedinice RNK polimeraze koji se naziva CTD odgovoran za kontakt sa aktivatorom.

Integracija signala Kombinacija aktivnosti ova dva regulatorna proteina opredeljuje nivo ekspresije Lac operona. Kod Lac operona odsustvo glukoze i prisustvo laktoze je kombinacija signala koja omogućava efikasnu ekspresiju laktoznog operona.

Laktozni operon Nakon ulaska u ćeliju, laktoza prelazi u formu alolaktoze. Konverzija laktoze u alolaktozu katalizovana je enzimom čiji se gen nalazi u okviru Lac operona - β- galaktozidaza. Ovaj enzim je prisutna u ćeliji zahvaljujući bazičnom nivou ekspresije Lac operona.

Signal represor Lac Alolaktoza ima mogućnost interakcije sa Lac represorom i indukuje njegovu alosteričnu promenu. Konformacionom promenom Lac represor gubi sposobnost vezivanja za laktozni operator a time gubi i svoj negativni efekat na ekspresiju lac operona.

Signal aktivator CAP U uslovima niskog nivoa glukoze, količina camp u ćeliji raste. camp vezuje se za protein CAP koji trpi konformacionu promenu. Zadobijena konformacija CAPa omogućava njegovo vezivanje za CAP mesto na molekulu DNK u blizinu promotora.

Laktozni operon Obrnuto, u uslovima visokog nivoa glukoze, kada ćelija nema potrebu za sintezom proteina koji učestvuju u metabolizmu drugih šećera osim glukoze, količina camp opada usled smanjenja aktivnosti enzima adenilat ciklaze.

Regulacija ekspresije gena i enzim RNK polimeraza

Regulacija ekspresije gena i enzim RNK polimeraza Enzim RNK polimeraza prepoznaje promotor svojom sigma (σ) subjedinicom. Kod bakterije E. coli za većinu promotora, RNK polimeraza vezuje se zahvaljujući σ 70 subjedinici. Međutim, u ćeliji se kodira veći broj σ subjedinica koje imaju mogućnost da zamene σ 70 omogućavajući ekspresiju sa alternativnih promotora.

Regulacija ekspresije gena i enzim RNK polimeraza Alternativni sigma faktori Sigma faktori 70, 28 i 34.

Alosterične promene enzima RNK polimeraze ili molekula DNK

Regulatorni protein NtrC Reguliše ekspresiju gena glna Metabolizam azota Signal nizak nivo azota Fosforilacija Regulatorna sekvenca 150bp uzvodno od promotoa Proteini koji menjaju arhitekturu molekula DNK IHF Konformaciona promena RNK polimeraze i tranziciju iz zatvorenog u otvoreni komples Ekspresija gena

Regulatorni protein MerR Regulatorni protein MerR kontroliše ekspresiju gena mert koji kontrolišu otpornost bakterijske ćelije na toksično dejstvo žive. MerR je regulatorni protein koji takođe ima sposobnost alosterične promene. Za razliku od proteina NtrC, aktivnošću proteina MerR alosteričnu promenu trpi molekul DNK.

Regulatorni protein MerR Mesto vezivanja ovog aktivatora nalazi se unutar samog promotora i to između konsenzusnih sekvenci -10 i -35. U uslovima odsustva žive, protein MerR vezan je za svoje vezujuće mesto u okviru promotora gena mert.

Konformacija samog promotora je takva da ne sprečava vezivanje RNK polimeraze ali to vezivanje onemogućava otpočinjanje transkripcije. Konsenzusne -35 i -10 sekvence nalaze se na suprotnim stranama DNK heliksa tako da se RNK polimeraza vezuje samo za -35 konsenzusnu sekvencu promotora.

Živa je signal aktivacije regulatornog proteina MerR. Aktivirani protein MerR vrši alosteričnu promenu promotorske DNK sekvence i to u smislu njenog uvrtanja.

Regulatorni protein MerR Ovom alosteričnom promenom konsenzusne sekvence -35 i -10 dovode se na istu stranu DNK heliksa čime je omogućeno pravilno vezivanje RNK polimeraze za promotor gena.

Kontrola ekspresije gena mehanizmom antiaktivacije Operon arabad kod E. coli sadrži gene koji kodiraju enzime uključene u metabolizam L-arabinoze. Promotor arabad operona E. coli aktivira se u prisustvu arabinoze i u odsustvu glukoze. Regulacija ekspresije operona vrši se posredstvom dva aktivatora AraC (proteinski produkt gena arac) i proteina CAP.

Protein AraC i aktivator i represor transkripcije U uslovima kada je L-arabinoza prisutna u bakterijskoj ćeliji, regulatorni protein AraC vezuje se za ovaj šećer. Protein AraC zadobija konformaciju koja mu omogućava vezivanje za DNK u obliku dimera. Mesto vezivanja proteina AraC na molekulu DNK naziva se arai i sadrži dva polu-mesta arai1 i arai2.

Protein AraC i aktivator i represor transkripcije Kada L-arabinoza nije prisutna u bakterijskoj ćeliji, nema ni ekspresije operona arabad. U odsustvu L-arabinoze, protein AraC ima konformaciju koja omogućava da se jedan monomer veže za arai1 mesto a drugi monomer vezuje se za udaljeno polumesto koje se naziva arao2. S obzirom na to da je polumesto arai2 za vezivanje monomera proteina AraC prazno nema ni ekspresije arabad operona.

Regulacija ekspresije gena kod prokariota nakon inicijacije transkripcije

Prevremena terminacija transkripcije - atenuacija

Ekspresija gena koji kodiraju enzime uključene u proces biosinteze ak triptofana kod E. coli. Pet gena za ove enzime nalazi se u okviru trp operona i eksprimiraju se kada u ćeliji postoji mala količina triptofana. Ekspresija operona regulisana je regulatornim proteinom - triptofanskim represorom represor Trp. Vezivanjem za triptofan (ko-represor), represor Trp trpi konformacionu promenu koja mu omogućava da se veže za operator u okviru promotora. Vodeća sekvenca

Prevremena terminacija transkripcije - atenuacija Kada u ćeliji postoji visoka količin triptofana RNK polimeraza započne prepisivanje trp operona, često ne dolazi do prepisivanja kompletne policistronske irnk već se prepisuje kratki transkript tzv. vodeće (leader) sekvenca.

5' kraj policistronske irnk trp operona Vodeća sekvenca

Ukosnice vodeće sekvence Ukosnice mogu formirati region 1 i 2, region 2 i 3 kao i region 3 i 4. Ukosnica koju formiraju regioni 3 i 4 naziva se atenuatorska ukosnica (petlja).

Na poslednji region koji ima mogućnost formiranja ukosnice nastavlja se niz od osam uracila koji se naziva atenuator. U okviru ovog niza nalazi se mesto atenuacije na kome se završava transkripcija vodeće sekvence RNK dužine od 139 nukleotida. Vodeći peptid Trp polipeptid Kraj vodeće sekvence

Atenuacija U okviru otvorenog okvira čitanja vodeće sekvence (u regionu 1 koji je odgovoran za formiranje ukosnice) nalaze se dva uzastopna kodona za triptofan. Njihova funkcija je da zaustave ribozom za vreme translacije leader peptida.

Mala količina triptofana u ćeliji Kada je u ćeliji prisutna mala količina triptofana, postoji i mala količina trnk koja nosi triptofan. Tokom translacije se na dva kodona za tritofan zaustavlja ribozom koji maskira region 1. Ribozom fizički sprečava formiranje ukosnice između 1. i 2. regiona.

Mala količina triptofana u ćeliji Tako je region 2 slobodan za formiranje ukosnice sa regionom 3. Pošto se formira petlja između 2. i 3. regiona, ne dolazi do formiranja atenuatorske petlje. Bez formiranog atenuatorske petlje RNK polimeraza prepisuje kompletan trp operon i sinteza svih proteina čiji se geni naleze u okviru operona.

Visoka količina triptofana u ćeliji Ne dolazi do zaustavljanja ribozoma na dva kodona triptofana u okviru regiona 1 vodeće sekvence. Ribozom prelazi preko regiona 1 i blokira region 2 u trenutku kada se kompletira transkribovanje regiona 3 i 4 vodeće sekvence. Regioni 3 i 4 imaju sposobnost formiranja atenuatorske ukosnice.

Visoka količina triptofana u ćeliji Kao posledica formiranja atenuatora dolazi do zaustavljanja transkripcije na kraju vodeće sekvence. Translatirani leader peptid nema funkciju u ćeliji i biva brzo degradovan od strane enzima proteaza.

Uslovi u kojima ne dolazi do sinteze proteina U uslovima kada nema sinteze proteina, ribozom se ne vezuje za transkript triptofanskog operona, tada se formiraju dve ukosnice u okviru vodeće sekvence i to jedna između regiona 1 i 2 i druga između regiona 3 i 4.

Regulacija ekspresije gena translacionom represijom

Regulacija ekspresije gena translacionom represijom Regulacija ekspresije gena translacionom represijom podrazumeva postojanje neke vrste represora koji blokira proces translacije. Primer ove vrste regulacije ekspresije gena su ribozomski proteini (r-proteini) koji su translacioni represori sopstvene sinteze.

Regulacija ekspresije gena translacionom represijom r-proteini funkcionišu kao represori sopstvene translacije i to vezivanjem jednog ili dva ribozomska proteina za irnk blizu mesta vezivanja ribozoma u toku inicijacije translacije. Sličnost sekundarne strukture rrnk i irnk. Kako ribozomski proteini imaju veći afinitet vezivanja za rrnk, vezivanje za irnk i blokada translacije odvija se samo u situacijama kada su svi potrebni ribozomi formirani.

Uloga molekula RNK u regulaciji ekspresije kod prokariota

Mali molekuli RNK kod prokariota U bakterijama je detektovano prisustvo molekula RNK koji po svojoj strukturi i funkciji ne pripadaju ni jednoj od tri najčešće grupe molekula RNK (irnk, rrnk i trnk). To su mali molekuli RNK (eng. small RNA, srna) veličine od 80 do 110 nukleotida. Nazivaju se i nekonvencionalne, funkcionalne ili regulatorne RNK. Samo je u genomu E. coli detektovano preko 100 gena koji kodiraju za srnk.

Mali molekuli RNK kod prokariota srnk učestvuju u procesima degradacije irnk i kontroli translacije. Neke srnk inhibiraju dok druge aktiviraju proces translacije. Bazno sparivanje srnk i irnk je potpomognuto proteinom Hfq koji se naziva i proteinski pratilac (šaperon) srnk.

Riboprekidači U bakterijama, otkrivena je još jedna posebna klasa molekula RNK koji imaju ulogu u regulaciji ekspresije gena na nivou transkripcije ili inicijacije translacije. To su regulatorni elementi RNK, specifične sekundarne strukture, koji se nazivaju riboprekidači (eng. riboswitch).

Riboprekidači Riboprekidači svoju ulogu u procesima regulacije ekspresije gena postižu upravo promenom svoje sekundarne strukture. Promena njihove sekundarne strukture je posledica njihovog vezivanja za direktne senzore, male molekule (metabolite) koji kontrolišu terminaciju transkripcije ili inicijaciju translacije.

Riboprekidači Riboprekidači obično se nalaze u 5 netranslatirajućem regionu gena čiju ekspresiju kontrolišu i sastoje se iz dva regiona: aptamera i ekspresione platforme. Riboprekidače karakteriše specifična sekundarna struktura, ukosnica koju formiraju komplementarni regioni. APTAMER EKSPRESIONA PLATFORMA

Vezivanje malog molekula za aptamerni region indukuje promenu sekundarne strukture riboprekidača koji može dovesti do terminacije transkripcije. Ukosnica koja uslovljava terminaciju transkripcije

Uloga riboprekidača u inhibiciji translacije U odsustvu senzornog molekula, riboprekidač poseduje sekundarnu strukturu koja omogućava nesmetano odvijanje translacije.

Prisutvo senzornog molekula uzrokuje aktiviranje riboprekidača u smislu promene njegove sekundarne strukture. Promena strukture uslovljava raskidanje jednih i formiranje drugih ukosnica. Formirana ukosnica između regiona 3 i 4 čini mesto vezivanja ribozoma nedostupno za formiranje ribozoma. Na ovaj način blokirana je inicijacija translacije.