ENZIMI KOJI UČESTVUJU U "PLANT GROWTH PROMOTING" POTENCIJALU BAKTERIJA
Klimatske promene Porast broja ljudi na planeti ZAŠTO JE OVO VAŽNO Veći zahtevi za poizvodnjom hrane, hrane za životinje, goriva posebno biodizela Sve to na zemljištu koje ima povećan sadržaj metala (i teških metala), soli, smanjenu koncentraciju vode Interdisciplinarni pristup je jedini koji može da da odgovore Izučavanje Plant growth promoting bacteria PGPB
RIZOSFERA Rizosfera je zona oko korena biljke koju naseljavaju različite bakterijske populacije specifične za svaku biljku. Danas je definicija proširena i rizosferu čini: Endorizosfera, rizoravan i ektorizosfera. Shema dela korena koja pokazuje strukturu rizosfere (htpp://cse.naro.affrc.go.jp/)
RIZOSFERA
RIZOSFERA
INTERAKCIJA BAKTERIJA SA KORENOM BILJAKA Najčešći su predstavnici rodova koji ulaze u sastav rizofita i/ili endofita: Pseudomonas Bacillus Azotobacter Rhizobium Azospirillum Arthrobacter Agrobacterium Desulfovibrio Clostridium, i drugi.
CIKLUS AZOTA U ŽIVIM SISTEMIMA AMINOKISELINE VIŠE BILJKE ŽIVOTINJE Nitrati BAKTERIJE FIKSATORI AZOTA Amonijak Urea Nitrificirajuće bakterije Nitrobacter N 2 Nitrificirajuće bakterije Nitrosomonas Nitriti
ENZIMI BAKTERIJA KOJI SU UKLJUČENI U SIMBIOTSKU FIKSACIJU MOLEKULSKOG AZOTA Azotofiksirajuće bakterije i arhee jedine poseduju enzime za fiksaciju N 2 Biosintetski proces zapocinje redukcija N 2 u NH 3 (fiksacija azota), NH 3 se prvo ugrađuje u glutamat a zatim u ostale aminokiseline Kvržic na korenu biljke Lotus pedunculatus formiran od strane Rhizobium (htpp://de.academia.ru/) Dizotrofi je termin za sve bakterije i arhee koje imaju sposobnost fiksacije azota. Diazotrofi mogu biti slobodnoživeći i simbiotički. Simbiotički diazotrofi su bakterije (familija Rhizobiaceae, rodovi Rhizobium, Bradyrhizobium i Azorhizobium) i aktinomicete (rod Frankia) koje žive u simbiozi sa višim biljkama Kvržica na korenu biljke Pisum Sativum formiran od strane Rhizobium (www.sciencephoto.com)
FORMIRANJE KVRŽICA KOD RHIZOBIUM - sinteza triptofana privlačenje bakterija - triptofan u IAA koji dovodi do uvijanja korenove dlake i aktiviranja nod gena - poligalaktonuronaza vrši depolimerizaciju ćelijskog zida, infekciona nit - bakterije formiraju bakteroid, luče citokine koji dovode do deobe ćelija korena i formiranja kvržice - Kvržica se ispunjava bakteroidima koji aktiviraju nitrogenazu i proces azotofiksacije
ENZIMI BAKTERIJA KOJI SU UKLJUČENI U SIMBIOTSKU FIKSACIJU MOLEKULSKOG AZOTA Najznačajnije azotofiksatori: - Rhizobium formira nodule na korenu: Trifolium, Lotus, Melilotus, Vicia, Pisum - Azorhizobium na stablu tropskih leguminoza (Sesbania rostrata) - Bradyrhizobium na tropskim Fabales (Glycine max, Vigna spp.) Slobodnoživeći diazotrofi obuhvataju grupe: 1. obligatno aerobnih bakterija (Azotobacter, Beijerinckia) 2. aerobnih mikroaerofilnih bakterija koje fiksiraju N 2 samo pri niskoj koncentraciji O 2 (Azospirillum, Thiobacillus ferro-oxidans) 3. fakultativno anaerobnih bakterija koje žive u prisustvu ili odsustvu O 2, a N 2 fiksiraju samo u odsustvu O2 (Klebsiella, Bacillus) 4. obligatno anaerobnih bakterija (Clostridium, Desulfovibrio, Methanobacterium) Do danas nije poznat nijedan eukariotski organizam sa sposobnošću azotofiksacije
Nitrogenaza Enzimski kompleks koji čine homodimer dinitrogenazna reduktaza (Fe-protein) i heterotetramer dinitogenaza (FeMo-protein) Trostruka veza u molekulu N 2 ga čini inertnim, izuzetno skupa kataliza i jedan od najtežih kataliza u biološkim sistemima Svi koraci redukcije direktno na nitrogenazi bez slobodnih intermedijera Može katalizovati redukciju različitih supstrata sa dvostrukom i trostrukim vezama (acetilena do etilena, azida do N 2 i amnijaka, CO 2 do CO, itd.) Enzimski kompleks nitrogenaza (preuzeti i modifikovano iz Cheng 2008)
Dinitrogenaza je α2β2 heterotetramer (FeMo-protein), proizvod nifd i nifk gena, 240 kda i ne menja se prilikom vezivanja za drugu komponentu nitrogenaznog kompleksa ona je mesto redukcije supstrata i sadrži dva metalna klastera P i FeMo-kofaktor P klaster sadrži centralni S atom vezan za 8 atoma Fe FeMo-kofaktor čini MoFe7S9 i organska kiselina sa 7 C atoma - homocitrat FeMo-kofaktor dinitrogenaze (preuzeto i modifikovano iz Ludden 2001) P klaster dinitrogenaze (preuzeto i modifikovano iz Ludden 2001)
Dinitrogenaza reduktaza je α2 dimer (Fe-protein), proizvod nifh gena, 250 kda i menja se prilikom vezivanja za drugu komponentu nitrogenaznog kompleksa; specifično vezuje dva molekula Mg-ATP sadrži Fe4S4 klaster koji spaja dve subjedinice proteina preko ostatka cisteina svojstva nitrogenaznih proteina su izuzetno konzervirana, sekvenca obe komponente nitrogenaznog kompleksa se >70% poklapaju medju vrstama i domenima (Bacteria, Archea) Fe4S4 klaster dinitrogenazne reduktaze (preuzeto i modifikovano iz Ludden 2001)
nif regulon Klebsiela pneumonie (preuzeto i modifikovano iz Madigan 2011)
TOK ELEKTRONA, MEHANIZAM I KINETIKA REDUKCIJE SUPSTRATA Redukcija supstrata obuhvata: 1. Formiranje kompleksa između redukovanog Fe-proteina i dva MgATP i FeMo-proteina. 2. Transfer e - izmedju dva proteina i hidroliza ATP. 3. Diocijacija Fe-proteina. 4. Ponavljanje prva tri koraka dok se ne skupi dovoljan broj e - (i protona) da bi se supstrati redukovali. 6 e - za redukciju N 2 do 2NH 3, ali još 2 se gube u obliku H 2 Tok elektrona kroz nitrogenazni kompleks (preuzeto i modifikovano iz Ludden 2001) N 2 + 8e - + 16ATP + 8H + 2NH 3 + H 2 + 16ADP + 16Pi
Nitrogenaza U procesu prenosa elektrona na nitrogenazu uključeni su citohromi i ferodoksin Kranji produkti redukcije su NH 3 i H 2, NH 3 se prenosi u citoplazmu biljne ćelije - služi kao aminodonor u sintezi aminokiselina i nukleotida Nitrogenaza pored N 2 može da redukuje i druge elemente (H + do H 2 ), hidrogenaza reciklira nastali vodonik uključujući ga ponovo u nitrogenaznu reakciju Ušteda 3 od 16 ATP-a Produkciju nitrogenaze inicira i kontroliše biljna ćelija Fiksacija azota je inhibirana prisustvom O 2, fiksiranih oblika azota i nekih AK Enzimi i kofaktori u kompleksu nitrogenaze dinitrogenaze ljubičasto i sivo dinitrogenazna reduktaza plavo i zeleno vezani ADP crveno 4Fe-4S kompleks (Fe atomi narandzasti, S atomi žuti) Fe-Mo kompleksu Mo - crno, S - žuti, Fe narandžasti homocitrat - siv
ENZIMI BAKTERIJA KOJI UČESTVUJU U TRANSFORMACIJI NEPRISTUPAČNIH JEDINJENJE FOSFORA Biljke koriste P u formi H 2 PO 4 - i HPO 4 2- koja je izuzetno ne rastvorljiva u zemljištu Neke bakterije mogu da rastvaraju nerastvorljiva neorganska fosfatna jedinjenja (trikalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, hidroksil apatit) Rhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Erwinia, Microcobacterium, Flavobacterium, Bijerinckia i Burkholderia Kisela, neutralna i alkalna fosfomonoesteraza Fitaza dominira u većini zemljišta (10-50% od ukupnog P) Bakterije proizvode fitazu koja hidrolizuje fitat, fitat teži da formira nerastvorne komplekse sa Fe, Al i Ca i da se akumulira u zemljištu
ENZIMI BAKTERIJA KOJI UČESTVUJU U TRANSFORMACIJI NEPRISTUPAČNIH JEDINJENJE FOSFORA Kretanje fosfora kroz zemljište (preuzeto od Ahemad i Kibret 2014)
ENZIMI BAKTERIJA KOJI UČESTVUJU U TRANSFORMACIJI NEPRISTUPAČNIH JEDINJENJE FOSFORA Različita organska i neorganska jedinjenja koja sintetišu bakterije sposobne da oslobađaju fosfor iz nepristupačnih jedinjenja (preuzeto od Ahemad i Kibret 2014)
BAKTERIJSKI ENZIMI KOJI UČESTVUJU U BIOSINTEZI AUKSINA Auksini su grupa biljnih hormona; stimulišu rast biljnih organa Sintetišu ih biljke, ali i bakterije rizosfere fitopatogene (Agrobacterium tumefaciens) i PGPB indol-3-sirćetna kiselina (IAA) Biosinteza IAA kod bakterija obuhvata do sada okarakterisanih pet različitih biosintetskih puteva
SINTEZA INDOL-3-SIRĆETNE KISELINE (IAA) preuzeto od Saepen i saradnici 2007
1-aminociklopropan-1-karboksilat (ACC) deaminazna aktivnost Etilen je jedini gasoviti biljni hormon, sintetišu ga biljke, ali i različiti biotički i abiotički procesi. Poznat je i kao hormon stersa jer pomaže biljkama da pržive sušu, visoku koncentraciju soli, metala, teških metala (Ni, Pb, Zn i Cd), poplave, prisustvo patogenih bakterija. ACC deaminaza katalizuje sečenje aminociklopropan-1 karboksilata (ACC) koji koji je prekursor za sintezu etilena do α-ketobutirata i amonijaka
1-aminociklopropan-1-karboksilat (ACC) deaminazna aktivnost Multimerni enzim, molekulske mase 35-42 kda, pronađen je samo kod mikroorganizama, koristi piridoksal fosfat kao kofaktor, ACC deaminaza ima dva domena od kojih svaki ima uvrnutu, otvorenu α/β strukturu koja je slična β subjedinici enzima triptofan sintaze ACC deaminaza katalizuje sečenje ACC koji uključuje fragmentaciju prstena ciklopropana i deaminaciju ACC
1-aminociklopropan-1-karboksilat (ACC) deaminazna aktivnost
ULOGA PGPB U PREŽIVLJAVANJU SUŠE
ZAKLJUČAK Primena PGPB kao biofertilizatora je našla široku primenu u poljoprivredi Prednosti: - smanjuje se upotreba skupih azotnih đubriva - biljke lakše usvajaju hemijske elemente - utiče se na dinamiku i pravac mikrobioloških procesa koji posredno utiču na određivanje i povećanje plodnosti zemljišta - biološka kontrola U cilju odabira optimalnih sojeva bakterija, ubuduće je potrebno jasno definisati koje bakterijsko svojstvo je korisno i neophodno za određene uslove sredine i različite biljke a u skladu sa tim i koja enzimska aktivnost ovih bakterija je korisna u datim uslovima