Biologija ćelije. Vežba 3: Tehnike u molekularnoj biologiji

Transcript

1 Biologija ćelije Vežba 3: Tehnike u molekularnoj biologiji

2 Izolacija nukleinskih kiselina PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) Elektroforeza Blotting Tehnike sekvenciranja nukleinskih kiselina - SANGER (DIDEOKSI) sekvenciranje

3 Cilj molekularne biologije Makromolekuli: Nukleinske kiseline - DNK/RNK nosioci naslednih informacija Proteini realizatori tih informacija James Watson i Francis Crick (1953.) model sekundarne strukture DNK Centralna dogma molekularne biologije

4 Deoksiribonukleotid Ribonukleotid

5 Pojedine osobine NK: Polimeri primarna struktura (fosfodiestarska i N-glikozidna), sekundarna i tercijerna struktura Jednolančani, dvolančani, parcijalno dvolančani molekuli; linearni, cirkularni, superspiralizovani Funkcionalne grupe hidroksilne, amino, metil Iako su prisutne i bazne grupe u azotnim bazama, kod NK preovlađuje kiseli karakter molekula zbog prisustva fosfornih grupa i hidroksilnih grupa na šećeru. NK su polarni molekuli. Postoji i razlika u polarnosti između DNK i RNK Fizičko-hemijske osobine: - tačka topljenja je povećana zbog prisustva vodoničnih veza - Azotne baze imaju masksimum apsorpcije svetlosti talasne dužine 260 nm (A260)

6 Odakle izolujemo nukleinske kiseline? Izvor NK bakterije, vrusi, biljke, gljive i životinje Uzorak treba da sadrži što čistiju NK koja nam je porebna za dalje analize treba da bude oslobođen od različitih zagađivača : proteina, ugljenih hidrata, lipida, soli, alkohola, ali i neželjenih NK - kada izolujemo određenu NK npr. irnk

7 Stvaranje optimalnih uslova za izolovanje NK Priprema radne okoline pred izolaciju NK smanjiti rizik od dejstva nukleaza (DNases, RNases)! odvojen prostor Set pipeta samo za izolaciju NK, nastavci sa filterom Nositi rukavice jer ćelije kože proizvode jedan tip nukleaze posuđe od stakla, metala i keramike tretirati visokim temperaturama ( C) kako bi se uklonile nukleaze na njihovoj površini. Inhibitori nukleaza- komercijalno dostupni rastvori koji se mogu koristiti za tretiranje radne površine, pipeta i uređaja. Koristiti helatore (EDTA, EGTA) koji za sebe vezuju metalne jone (kofaktore) i tako inaktiviraju DNaze. 0.1% DEPC (engl. diethylpyrocarbonate) za tretiranje rastvora koji su pripremljeni u lab. Inaktivira Dnaze i većinu RNaza raditi na niskim temperaturama (na ledu), brzo i efikasno.

8 1. Vrsta DNK - hromozomska, plazmidna, mitohondrialna, fagna, vektorksa - Jednolančana ili dvolančana - Linearna ili cirkularna 2. Način izolacije - Ručno - Kompletom (kit) - Mešovito 3. Količina materijala - Mini (do 20μg) - Midi (do 350μg) - Maxi (do 1.2 mg)

9 Osnovni koraci u izolaciji NK 1. Prikupljanje materijala 2. Liza ćelije - enzimatska (proteinaze, mutanolizin (glikoprot.), glikozidaze, celulaze) - dovodi do ogoljavanja ćelija i razgradnje nepotrebnih molekula (proteina, UH, lipida) - deterdženti (SDS, triton X-100..) - razbijaju ćelijske membrane - mehanička (sonifikacija, homogenizeri) - osmotski - korišćenjem hipotoničnog rastvora 3. Prečišćavanje - zasoljavanjem - visokomolarni rastvori soli (Na-acetat, K-AC, NaCl) koji služe za denaturaciju i taloženje proteina - organskim rastvaračima (fenol:hloroform, neutralni i kiseli fenol) - hromatografiski kolona vezuje samo NK - Centrifugiranje u gradijentu: Cezijum hlorid, saharozni gradijent, glicerolski gradijent 4. Taloženje NK - taloženje DNK 100% EtOH ili izopropanolom i ispiranje u 70% etanolu 5. Finalno prečišćavanje - RNaza tretman ili DNaza tretman

10 Osnovni koraci u izolaciji NK: Ekstrakcija i taloženje 1 1. Homogenizacija - narušavanje integriteta organa, tkiva, ćelija (ćelijskog zida i membrane) kako bi se oslobodio saržaj iz ćelija 2. Liza ćelija u puferu za ekstrakciju Koji rastvara ćelijsku membranu (deterdženti, haotropne soli, CTAB), inaktivira nukleaze (helatori metala, proteinaza K) i uklanja nepotrebne elemente iz lizata (CTAB, PVP, soli) 2

11 3.Organska ekstrakcija - organski rastvarač fenol, koristi se za deproteinizaciju uzoraka fenol, hloroform ili fenol : hloroform, Fenol : hloroform : izoamilalkohol Kiseli ili neutralni fenol utiču na rastvorljivost DNK U kiselom fenolu DNK denaturiše i odlazi u fenolnu fazu, a samo RNK ostaje u vodenoj fazi. Grub lizat koji sadrži NK i ostatke ćelija Vodeni sloj sadrži hidrosolubilne molekule, uključujući i NK. Proteini i lipidi su zarobljeni u organskom sloju, i na taj način odvojeni od NK. Nerastvorni ostaci ćelija bivaju zarobljeni u međusloju.

12 4.Taloženje NK % etanol menja strukturu DNK, tako da DNK agregira i precipitira u rastvoru. U narednoj fazi, soli i organski molekuli, rastvorljivi u 70% etanolu, ostaju u rastvoru, dok se DNK izdvaja centrifugiranjem. Dodavanje % etanola i soli (natrijum acetat) Isprati talog sa 70% EtOH da bi se otklonio višak soli i drugih nepotrebinih ostataka Odliti višak EtOH i ostaviti uzorak da se osuši Rastvoriti talog u vodi (H2O, TE, itd)

13 PCR(engl. Polymerase Chain Reaction) Lančana reakcija polimeraze metoda kojom se za kratko vreme može dobiti ogroman broj kopija nekog fragmenta DNK, bilo kog porekla. Prevaziđen najveći problem u izučavanju gena In vitro replikacija željenog fragmenta DNK koji može biti deo većeg DNK molekula (genomska DNK, plazmidna) ili manji molekul određene zastupljenosti u smeši (cdnk, irnk) Neophodne komponente reakcije su: - matrica za sintezu (DNK/RNK) - termostabilna DNK Taq polimeraza (iz bakterije Thermus aquaticus) - Prajmeri (18-20 nukleotida) Forward i Reverse - dntp (sva četiri dezoksiribonukleozidtrifosfata) - Mg2+, služi kao neophodni kofaktor Taq polimeraze -Magnezijum hlorid: konc mM -Pufer: ph dntps: μM -Prajmeri: μM -DNK Polimeraza: jedinica -Target DNA: 1 μg

14 PCR reakcija se odvija u ciklusima (n=30-35): 1 ciklus traje 2min 1. Denaturacija ~94/95 C, 30 sec do 1 min 2. Prijanjanje prajmera (engl. annealing) C, temp 5 C niža od Tm prajmera, sec 3. Sinteza DNK (engl. extension) ~ 72 C, 1 min/kb produkta

15 Broj kopija DNK eksponencijalno raste i iznosi 2 n Gde je n=broj ciklusa Više ciklusa - više DNK Količina produkta raste eksponencijalno do dostizanja platoa u poslednjim ciklusima. Plato je faza u kojoj komponente reakcione smeše postaju deficitarne (utrošeni su nukleotidi ili prajmeri, oslabila je aktivnost polimeraze ili je došlo do akumulacije inhibitora reakcije). Neki od problema: I najmanja količina strane DNK može dovesti do umnožavanja pogrešnog molekula, pod uslovom da se prajmeri mogu vezivati za njega. Aktivnost polimeraze opada sa brojem ciklusa. Što je duži period izlaganja polimeraze na visokim temperaturama to njena aktivnost brže opada (poluživot Taq polimeraze na 95 C je ~30min u kontinuitetu). Optimum je ciklusa. Za veće fragmente potrebno je duže vreme elongacije kako bi polimeraza stigla da sintetiše polinukleotidne fragmente Temp.annealing-a uglavnom treba da bude oko 5 C niža od tačke topljenja prajmera (Tm) PCR metoda je osetljiva i zahteva pažljiv rad, visoku predostrožnost, kako bi se izblegli lažno pozitivni rezultati.

16 Provera uspešnosti PCR-a Elektroforeza Razdvajanje naelektrisanih čestica (makromolekula) u električnom polju, prema njihovoj veličini NK su polianjoni negativna naelektrisanja su ravnomerno raspoređena duž polinukleotidnog lanca, tako da je ukupna količina naelektrisanja, koju jedan molekul NK nosi, proporcionalna njegovoj veličini => NK se kreću ka anodi

17 NK se kreću kroz inertan i porozan matriks: - Agarozni gel (DNK većeg opsega veličina, manja moć razdvajanja) - Poliakrilamidni gel (uskog opsega veličina, visoka rezolucija) Gel služi kao sito, kroz čije pore veći molekuli NK prolaze teže i zato se kreću sporije, a mali prolaze lakše i kreću se brže. Za isto vreme prolaze različit put Kada se elektroforeza završi, molekuli različitih veličina formiraju razdvojene trake (bendove) na gelu Neophodno je trake učiniti vidljivim, što se najčešće tadi inkubiranjem glela u rastvoru fluorescentne boje EtBr (etidijum bromid)- interkalira između parova baza u dsdnk- fluorescira pod UV svetlošću

18 Horizontalna elektroforeza:

19

20 Vertikalna elektroforeza: SDS-PAGE (natrijum dodecil sulfat poliakrilamid) za razdvajanje proteina Sodium dodecil sulfat (SDS) - deterdžent koji se često koristi u biohemijiskim eksperimentima jer se izuzetno dobro vezuje za proteine. Kao posledica tog vezivanja proteini se denaturišu i postaju izduženi i štapićasti. Pri tome se jedan molekul SDS-a vezuje na svake dve AK. Veliko negativno naelektrisanje koje donosi SDS maskira naelektrisanje samog proteina tako da se prilikom elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) proteini razdvajaju samo po svojoj molekulskoj masi.

21

22 Blotting Southern blot (DNK) Nothern blot (RNK) Western blot (proteini)

23 Southern blot Southern blot (DNK) za detektovanje tačno određenog fragmenta molekula DNK u smeši DNK fragmenata različitih dužina i sekvenci, koji se dobijaju digestijom genoma neke ćelije.

24 Western blot Electroblotting tehnika uključuje upotrebu el. struje za transfer proteina iz jednog medijuma u drugi Koraci u Western blotting - imunobloting metodi: 1. SDS PAGE - razdvajanje proteina elektroforezom 2. Transfer proteina - prenos proteina sa gela na nitroceluloznu membranu 3. Blokiranje membrane i inkubacija sa antitelima - membrana se tretira sa tri različuta rastvora, prvi je blocking rastvor, drugi je rastvor primarnih antitela, treći je rastvor sekundarnih antitela 4. Vizualizacija - sekundarna antitela mogu biti na različite načine obeležena što omogućava vizuelizaciju

25

26 Tehnike sekvenciranja nukleinskih kiselina SANGER (DIDEOKSI) sekvenciranje Sekvenciranje DNK podrazumeva utvrđivanje redosleda nukleotida u molekulu DNK Frederick Sanger izumeo prvu metodu za sekvenciranje DNK molekula, koja se naziva PREKID SINTEZE LANCA, a poznata je i kao DIDEOKSI metoda. Bazira se na činjenici da se jednolančani molekuli DNK, koji se razlikuju u dužini za samo jedan nukleotid, mogu razdvojiti elektroforezom u poliakrilamidnom gelu - Bazira se na principu upotrebe deoksinukleotid fosfata bez 3 OH grupe tj. dideoksi nukleotid fosfata u in vitro sintezi DNK. U smešu sa deoksinukleotidima dodaju se i dideoksinukleotidi. - Na mestu gde se umesto deoksinukleotida ugradi dideoksinukleotid dolazi do prekida sinteze lanca jer odsustvo 3`OH grupe na ddntp-u onemogućava formiranje fosfodiesterske veze sa sledećim nukleotidom. - Na ovaj način nastaje niz fragmenata različite dužine, u zaivsnoti od mesta ugradnje dideoksinukleotida

27 Korišćenje 4 različita ddntp-a (ddatp, ddttp, ddgtp, ddctp) u četiri različite reakcije, za in vitro sintezu DNK, sintetišu se četiri grupe jednolančanih fragmenata, na čijim krajevima se nalazi odrađeni ddntp, radioaktivno obeležen. Razdvajanje familija jednolančanih fragmenata DNK elektroforezom Vizuelizacija dobijenih traka autoradiografijom

28 Imunohistohemija (IHC) Vizuelizacija antigena u tkivu Imunohistohemija (IHC) predstavlja kombinaciju histologije sa imunohemijskim i biohemijskim tehnikama identifikacije specifičnih tkivnih komponenti korišćenjem reakcija sa obeleženim antigen/antitelom. IHC omogućava vizuelizaciju distribucije i lokalizacije specifičnih ćelijskih komponenti u ćeliji ili tkivu. Koji ćelijski antigeni mogu biti ciljani? citosol jedro ćelijska membrana lipidi proteini

29 Procedura: 1. Skidanje parafina (histološki preparati) ksilol, 100%EtOH 96% EtOH 2. Retrival reakcija (razotkrivanje skrivenih antigena Ag) zagrevanjem u citratnom puferu. 3. Nakon hlađenja, pločice ispirati u 1xTBS puferu 4. Blokiranje reaktivnih mesta da ne bi došlo do nespecifičnog bojenja neophodni je blokirati moguće endogene enzime, koji mogu dovesti do stvaranja lažnih pozitivnih rezultata. 5. Ispiranje u 1xTBS puferu 6. Primarno antitelo specifično za antigen koji želimo da detektujemo 7. Ispiranje u 1xTBS puferu 8. Pojačivač antitela unkubacija u mraku 9. Ispiranje u 1xTBS puferu 10. Sekundarno antitelo sa enzimom (HRP - horseradish peroxidase) inkubacija u mraku 11. Ispiranje u 1xTBS puferu 12. Dodavanje hromogenog supstrata (npr. DAB) kao rezltat reakcije sa HRP enzimom, DAB oksidiše stvarajući precipitat braon boje 13.Bojenje hematoksilinom (dobijanje kontrasta) 14. Ispiranje vodom hematoksilin se u njoj diferencira i prelazi u plavu boju 15. => dh20 => etanol => ksilol => montiranje

30