Molekularno-biološke tehnike. Osnovni principi

Transcript

1 Molekularno-biološke tehnike Osnovni principi

2 Osnovni principi: metoda koja se koriste u analizi ćelija molekularno bioloških tehnika imunohemijskih metoda

3 Šta je protočna citofluorimetrija? Istovremeno odreñivanje i merenje multiplih karakteristika pojedinačne ćelije Merenja se izvode po ćeliji sa uobičajenom brzinom od 500 do 4000 ćelija po sekundi Time Time Time Time Data Proces sor SSC FSC Orange Green FSC SSC Green Orange Time Red

4 Šta nam protočni citometar može reći o ćeliji? Njenu relativnu veličinu (rasipanje svetla unapred engl. Forward Scatter FSC) Njenu relativnu granuliranost ili unutrašnju složenost (rasipanje u stranu engl. Side Scatter SSC) Relativni intenzitet fluorescence date ćelije (FL1, FL2, FL3, FL4, i FL5) Rasipanje pod uglom (Side Scatter) Zavisi od granuliranosti ćelije i njene unutrašnje kompleksnosti Registruje se pod uglom od 90 u odnosu na laserski zrak Izvor fotona Detektor rasipanja pod uglom kompleksnost ćelije Detektor rasipanja unapred - Oblast površine ćelije Rasipanje unapred (Forward Scatter) Zavisi od veličine ćelije Registruje se duž ose upadnog zraka u smeru unapred

5 Šta je fluorescenca? λ = 488 nm Energija upadnog zraka svetlosti HO C CO 2 H Molecul Fluoresceina O Antitelo λ 530 nm Energija emitovanog fluorescentnog zraka Fluorohrom apsorbuje energiju od lasera Fluorohrom oslobaña apsorbovanu energiju: Vibriranjem i rasipanjem toplote Emisijom fotona duže talasne dužine

6 Fluorescenca Emitovani intenzitet fluorescence veznim mestima Laminarni tok tečnosti FITC FITC Laminar Flow Number of Events FITC FI ITC FITC FITC Tečnost Tečnost Fluorescent Intensity

7 Razdvajanje leukocita periferne krvi na subpopulacije na osnovu rasipanja svetlosti (FSc/SSc)

8 Propidijum jodid Struktura Vezan za DNK

9 DNK Histogram 250 G0/G1 200 Count ts S G2/M FL2-Area

10 Primena protočne citometrije HIV imunofenotipizacija Apsolutan broj CD4 pozitivnih ćelija Imunofenotipizacija leukemija i limfoma Analiza ćelijskog ciklusa i analiza ploidije tumora Odreñivanje broja retikulocita Odreñivanje unakrsne podudarnosti (transplantacija organa) Odreñivanje stem ćelija Odreñivanje funkcije Imunskog sistema Hematopoetične stem ćelije Stiduje multiple rezistencije na lekove (kancer) Kinetičke studije (ćelijska funkcija) Analiza trombocita (koronarna bolest) Detekcija mikroorganizama (bakterije, paraziti) FISH and Flow

11 Osnovni principi molekularno bioloških tehnika

12 Brz napredak molekularne biologije je uneo revolucionarne promene u laboratorijsku praksu. Mogućnosti primene ovih tehnika u dijagnostici i terapiji su velike. Molekularno biološke tehnike su se najpre koristile isključivo u istraživanju, u svrhu ispitivanja funkcije pojedinih gena. Danas se koriste za identifikovanje oštećenih gena koji se mogu dovesti u vezu sa pojavom bolesti, u sudskoj medicini za dijagnostiku virusnih infekcija sintezu rekombinantnih preparata

13 Dobijanje različitih uzoraka iz ćelija centrifugiranjem Mala brzina(1000g, 10 min) cele ćelije, jedra, citoskelet Srednja brzina(20 000g, 20 min) mitohondrije, lizozomi, peroksizomi Velika brzina(80 000g, 1 sat), mikrozomi, male vezikule Veoma velika brzina( g, 3 sata) ribozomi, virusi, veliki makromolekuli

14 Rekombinantne DNK tehnike (analiza fragmenata DNK) Rekombinantne DNK tehnike omogućavaju spajanje DNK sekvenci u nove kombinacije (rekombinantna DNK) Nakon početne primene u istraživanju, danas se koristi za identifikaciju oštećenih gena i popravljanje genetskih defekata. Prvi korak podrazumeva izolaciju kompletne DNK (ili RNK), izolovanje fragmenata DNK (jednog ili više gena) koji sadrže varijabilne sekvence i to u dovoljnoj količini

15 Principi ekstrakcije DNK/RNK Priprema uzorka (ekstrakcija DNK/RNK) često ključni korak od kojeg zavisi validnost analize Veliki broj različitih tehnnika, komercijalni kitovi. Opasnost od kontaminacije stranim nukleinskim kiselinama. Princip ekstrakcije: 1. Liziranje ćelija 2. Precipitacija oslobođenih molekula nukleinskih kiselina (izopropanol, etanol)

16 Postoji veliki broj različitih protokola Izbor protokola zavisi od: Vremena potrebnog za izdvajanje NK Dijagnostičke pouzdanosti Rizika od kontaminacije Prinosa ekstrahovane nukleinske kiseline

17 Ekstrakcija DNK podrazumeva: Liziranje ćelija u rastvoru deterdženta uz enzimsku digestiju Ekstrakciju pomoću organskih rastvarača Precipitaciju alkoholom Rastvaranje izolovane DNK u vodi ili puferima kao i spektrofotometrijsko određivanje čistoće i količine izolovane DNK

18 Ekstrakcija RNK Veća osetljivost molekula RNK zahteva primenu posebnih protokola (posebno važna eliminacija ribonukleaza). Metoda za ekstrakciju RNK mora da zadovolji dva kriterijuma: 1. Omogućava da se sačuva intaktna RNK 2. Dobijene RNK ne sadrže inhibitore reverzne transkriptaze.

19 Tehnike Tehnike za izolovanje i amplifikaciju gena i proučavanje i manipulaciju sekvencama DNKuključuju primenu: restrikcionihenzima, vektora za kloniranje, lančanu reakciju umnožavanja (polymerase chain reaction-pcr), elektroforezu na gelu, imunoblot i pripremuobeleženih probakoje hibridizuju za odgovarajuću ciljnu sekvencu DNK. Genskaterapija uključujeizolovanje normalnihgenainjihovo uključivanje u obolele ćelije tako da se eksprimiraju normalnigeni, omogućavajući oboleloj ćeliji da se vrati u fiziološko stanje.

20 Rekombinantna DNK tehnologija Rekombinantne DNKtehnologija uključuje niz tehnika, od kojih su najvažnije: 1.Prekidanje DNKnaspecifičnimmestimarestrikcionimnukleazama, što značajno olakšava izolaciju i manipulacijupojedinačnim genima. 2.Kloniranje DNKuz primenu vektora za kloniranje ili lančane reakcije umnožavanje (polymerase chain reaction PCR), čime se pojedinačni molekul DNK ili deo DNK može umnožiti nekoliko biliona puta. 3.Hibridizacija nukleinskih kiselina, što omogućava pronalaženje specifičnesekvencednkilirnksa velikom preciznošću i osetljivošću na osnovu sposobnosti da veže komplementarnu sekvencu. 4.Određivanje sekvencesvih nukleotida u fragmentu prečišćene DNK, što omogućava identifikacijugena odakle se može odrediti sekvenca AK uproteinu koji taj fragment kodira. 5.Istovremeno praćenje nivoa ekspresije svakog gena u ćeliji, korišćenjem mikročipovakoji omogućavaju istovremeno odvijanje desetina hiljada reakcija hibridizacije

21 Elektroforeza DNK na gelu agaroze Gel elektroforeza je metod koji se koristi za razdvajanje makromolekula (na osnovu njihove veličine/oblika i/ili naelektrisanja) na gelu kroz koji se propušta jednosmerna električna struja. Elektroforeza na gelu agaroze omogućava razdvajanje fragmenata u opsegu od Kb. Moć razdvajanja zavisi od veličine pora u gelu čija je veličina određena koncentracijom agaroze. 5Kb 1Kb

22 Elektroforeza na gelu agaroze Napajač i kadica za elektroforezu

23 Nakon završetka elektroforeze DNK se vizualizuje pomoću određenih boja koje se interkaliraju u DNK. Najčešće se koristi etidijum bromid (ekscitacija na 302nm) a ređe SYBR green (ekscitacija na 365nm). Gel agaroze nakon bojenja etidijum bromidom

24 Dobijanje DNK reverznom transkripcijom Ukoliko izolujemo irnk, ona može biti matrica za enzim reverznu transkriptazu, koja sa njega kopiju DNK (cdna). Ova DNK ne sadrži introne

25 Tehnike za identifikaciju sekvence DNK 1. Hibridizacija Primena proba jednolančane DNK ili RNK sekvence koje se vezuju za komplemetarnu sekvencu na većem jednolančanom DNK ili RNK molekulu (hibridizacija). Proba može biti sačinjena od cdnk, fragmenata genomske DNK ili hemijski sintetisanih oligonukleotida Proba je uvek obeležena (radioaktivnim fosforom, fluorohromom)

26 2. Elektroforeza na gelu Molekuli (fragmenti) se razdvajaju u električnom polju na osnovu veličine. DNK se kreće ka pozitivnoj elektrodi

27 3. Detekcija specifičnih DNK sekvenci 1. Elektroforeza NK 2. Transfer na čvrstu podlogu 3. Hibridizacija Southern blot- uzorak je DNK Northern blot- uzorak je RNK

28 Tehnike za amplifikaciju sekvence DNK 1. kloniranje

29 2. Reakcija lančanog umnožavanja (engl. polymerase chain reaction, PCR) Tehnika koja se koristi za enzimsko umnožavanje DNK fragmenata in vitro. Tokom umnožavanja DNK fragment se eksponencijalno umnožava tako da se od početnih nekoliko kopija dobija fragment koji je umnožen nekoliko miliona puta. Enzimi koji se koriste za umnožavanje su termostabilne DNK polimeraze koje kao gradivni materijal koriste dezoksinukleotid trifosfate (dntp). Početak sinteze komplementarnog lanca je određen oligonukleotidom koji se vezuje za taj lanac a termostabilna DNK polimeraza ga zatim izdužuje ugrađujući nukleotide tako da se dobija komplementarni lanac DNK.

30 Da bi se oligonukleotidi (prajmeri) vezali za komplementarne sekvence DNK molekula, neophodno je molekul DNK denaturisati, odnosno prevesti ga u jednolančani oblik. To se postiže zagrevanjem reakcione smeše i zbog toga je neophodno korišćenje termostabilnih polimeraza. Za uspešan PCR veoma je važan sastav reakcione smeše (sadrži oligonukleotide, dntp, DNK polimerazu, ciljne DNK sekvence koje se umnožavaju kao druge dodatke od kojih je najvažniji Mg 2+ ) kao i temperaturni ciklus kroz koji reakciona smeša prolazi i broj njegovih ponavljanja.

31

32 Lančana reakcija umnožavanja (PCR)

33

34 standard

35 Pretraživanje baza podataka u cilju pronalaženja sekvence željenog gena Da bi umnožili određeni gen moramo da znamo njegovu sekvencu kako bi mogli da dizajniramo i/ili proverimo da li se i kako prajmeri vezuju za tu sekvencu. Najbolji način za pribavljanje sekvenci je sa sajta NIH baze Prajmeri se mogu dizajnirati pomoću softvera koji imaju ugrađene algoritme za selekciju oligonukleotida prema zadatim kriterijumima.

36 Real time PCR Real time PCR, ili kvantitativni PCR ili kinetski PCR je tehnika koja se bazira na PCR metodologiji koja se koristi za umnožavanje i simultanu kvantifikaciju ciljanog molekula DNK. Ona omogućava i detekciju i kvantifikaciju (kao apsolutan broj kopija ili relativnu količinu normalizovanu prema količini DNK na početku reakcije ili nekog house keeping gena) specifične sekvence uzorka DNK. Postupak odgovara prinicipima PCR-a sa razlikom što se amplifikacija DNK prati tokom vremena i kvantifikuje posle svakog ciklusa amplifikacije. Dva metoda koja se koriste za kvantifikaciju su upotreba fluorescentih boja koje interkaliraju sa dvostrukim heliksom DNK ili modifikovane ologonukleotidne probe koje emituju fluorescencu pošto se vežu za komplementarnu DNK. Nekada se kombinuje sa reverznim PCR (RT PCR) (kvantifikacija relativne ekspresije gena u određenom vremenu).

37 Real time PCR

38 Amplifikacione krive real time PCR-a Gel-elektroforeza krajnjeg proizvoda umnožavanja dobijenog u analizi Specifičnost analize: proba korišćena u analizi emituje fluorescencu vezana za specifičnu ciljnu sekvencu dok nema emitovanja signala u slučaju nekomlementarnog povezivanja.

39 PCR i real time PCR Tradicionalni PCR detektuje krajnju tačku reakcije dok real time PCR detektuje ceo tok reakcije amplifikacije. Real-Time proces omogućava detekciju tokom ranih faza amplifikacije a obezbeđuje i upoređivanje i razlikovanje veoma finih razlika u ekspresiji (tradicionalni PCR na agaroznom gelu-uočljiva razlika mora biti veoma velika).

40 Primena u lečenju i prevenciji bolesti Primena u proizvodnji vakcina (hepatitis B) Dobijanje proteina koji se koriste u terapiji (insulin, hormon rasta, faktor VIII, tkivni aktivator plazminogena, eritropoetin, faktori rasta u hematologiji, rekombinantni interferoni) Genetsko savetovanje Genska terapija Transgene životinje

41 Klinička primena Polimorfizmi, nasleđene razlike u redosledu baza u DNK, su vrlo brojni u ljudskoj populaciji, i mnogealteracije u sekvencidnk se povezuju sa različitim oboljenjima. Testovi na varijacije u sekvenci DNK su osetljiviji od većine drugih tehnika (npr.enzimskiheseja) i omogućavaju prepoznavanje oboljenja u ranijem stadijumu. Ovim testovima se takođe mogu identifikovati nosioci naslednih bolesti tako da im se može pružiti genetičko savetovanje. DNK fingerprinting (analiza razlika u sekvencamadnk)se može koristiti da bi se odredio stepen srodstva ili u identifikaciji.

42 Nasledne bolesti predstavljaju fenotipske posledice oštećenih gena. Oštećenje gena može biti posledica novonastale mutacije ili, mnogo češće, nasleđivanjem od ranije prisutnih mutiranih genskih alela. Prvi korak u odgonetanju uzroka naslednog poremećaja je identifikacija gena koji je odgovoran, kao i proteina koji je njegov proizvod.

43 Primeri oboljenja koja nastaju kao posledica genetskog oštećenja Bolest Molekulski (ćelijski) deficit Incidenca Anemija srpastih ćelija Abnormalni hemoglobin 1/625 u sub-saharskoj Africi Cistična fibroza Oštećenje kanala za hloride u epitelnim ćelijama 1/2500 u Evropi Fenilketonurija Deficit tirozin hidtoksilaze 1/10000 u Evropi Tay-Sachs- ova bolest Deficit heksozaminidaze nagomilavanje sfingolipida 1/1000 u jevrejskoj populaciji u istočnoj Evropi

44 Primeri oboljenja koja nastaju kao posledica genetskog oštećenja Bolest Molekulski (ćelijski) deficit Incidenca Hantingtonova bolest Oštećenje hantingtina, što 1/10000 u Evropi dovodi do nastajanja njegovih agregata Hiperholesterolemija Deficit receptora za LDL 1/122 kod frankofonske populacije u Kanadi Dišenova distrofija Oštećenje sitoskeletnog proteina distrofina 1/3500 kod muškaraca Hemofilija A Deficit faktora VIII 1-1/10000 kod muškaraca

45 Osnovni principi imunohemijskih metoda u laboratorijskoj dijagnostici

46 IMUNOTESTOVI SA OBELEŽENIM ANTITELOM ILI ANTIGENOM Antigen i antitelo mogu se koristiti za međusobnu detekciju i merenje primenom širokogspektra raznih imunotestova za koje je karakteristično da se merenje rezultata testa zasnivana upotrebi reagensa (antigena ili antitela) za koji je vezan odgovarajući obeleživač čija sekoličina može precizno meriti. Koriste se različiti obeleživači, kao što su radioaktivni izotopi i enzimi. 125 Radioaktivni izotopi (naročito 125 I) su već dugo u širokoj upotrebi, ali se sve manjekoriste, pre svega zbog rizika po zdravlje i mogućeg radijacijskog oštećenja komponenata utestu. Sve više se kao obeleživači koriste enzimi. Reč je o enzimima kao štosu npr peroksidaza ili fosfataza, koji dejstvom na specifične supstrate daju obojene produkterazgradnje čija se količina može brzo i lako kolorimetrjski meriti. U poslednje vreme se uprocesu obeležavanja enzimom sve više koristi sistem avidin-biotin. Avidin je glikoproteinkoji se sa izuzetno visokim afinitetom vezuje za biotin (vitamin H). Zbog tako visokogafiniteta, avidin za koji je vezan enzim koristi se za veoma efikasno obeležavanje antitela za koje je vezan biotin.

47 KVALITATIVNE METODE Imunoelektroforeza- omogućava razdvajanje i identifikaciju različitih proteina koji su prisutni u istom uzorku (mešavina Ag) Western Blot (Imunoblot)- ispitivanje proteina razdvojenih elektroforezom 1. Elektroforeza 2. Transfer na nitroceluloznu/najlon membranu (elektroblot) 3. Inkubacija membrane sa primarnim At za protein od interesa 4. Inkubacija sa sekundarnim At koje je obeleženo enzimom/fluorohromom/luminiscentnim supstratom radi detekcije proteina

48 Western Blot ili Imunoblot:

49 Zašto analiza proteina? DNK -geni Oko 20,000 gena + regulatornih elementa Šta to govori o funkciji i interakciji Kako gen vrši funkciju? RNK -medi medijator informacije izmedju gena i proteina Broj? Šta to govori o funkciji i Interakciji Kako taj medijator vrši funkciju? PROTEIN krajni proizvod genske ekpresije Broj? Sigurno preko 100,000 mozda i 200,000 Izoforme, post-transla translacione modifikacije, kovalentne i nekovalentne, reverzibilne i ireverzibilne (permenantne)

50 Prednost analize proteina u poredjenju sa analizom DNK ili RNK 1. Manje manipulacije uzorkom pre analize 2. Nema potrebe za amplifikacijom početnog uzorka (mali rizik od kontaminacije) 3. Dobijeni podaci su na nivou supstrata, koji je obično predmet delovanja farmakoloških agenasa 4. U zavisnosti od primenjene tehnike, može se istovremeno analizirati od 1 do 20,000 proteina i njihovih modifikacija

51 Uzorci: Uopsteno, za analizu proteina se mogu koristiti tri vrste uzorka: 1. Eksperimentalni sistem ćelijske kulture 2. Mikrobiološki ki uzorak 3. Uzorak od pacijenta

52 WESTERN BLOT Western Blot-je tehnika koja se koristi za dokazivanje prisustva određenog proteina u uzorku a zasniva se na Ag-At reakciji (koriste se At specifična prema željenom proteinu koji predstavlja Ag) kao i kvantifikaciju proteina u uzorku (upotrebom odgovarajućih softverskih denzitometrijskih tehnika). Zajedničko koime imeza zaniz elektroforetskih procedura koje: vrše razdvajanje proteina po veličiniini poslerazdvajanja omogućavaju identifikaciju poznatih i nepoznatih proteina od interesa omogućavaju kvantifikaciju poznatih proteina omogućavaju identifikaciju nepoznatih proteina

53 Opšti principi izolacije proteina: Priprema Uzorka Liziranje ćelija hipotoni pufer sa deterdžentom (NP40 ili Triton X-100) izdvajanje citoplazme centrifugiranjem merenje koncentracije proteina (Bradford ili Lowry Assay) rastvaranjeproteinaupuferu Zatimseparacija proteina na akrilamidnom gelu

54 Razdvajanje proteina: PoliAkrilamid Gel Elektroforeza (PAGE)

55 SDS-PAGE: razdvajanje proteina po molekulskoj masi Primarna struktura: Linearni niz amino kiselina koje su međusobno povezane peptidnim vezama. Sekundarna struktura: Ograničena struktura koja nastaje kada se ne-susedne amino kiseline povežu vodoničnim vezama. Tercijerna struktura: Uvijanje jednog polipeptidnog lanca u globularnu strukturu.nastalo povezivanjem pojedinačnih udaljenih amino kiselina nekovalentnim vezama i jakim disulfidnim mostovima (S-S). Kvatenerna struktura: Kada je protein izgrađen od više od jednog polipeptidnog lanca.

56 SDS-PAGE: razdvajanje proteina po molekulskoj masi 1 SDS: Deterdžent: Natrijum dodecil sulfat (SDS) se koristi da obloži proteine u rastvoru. Jedan SDS molekul se vezuje za dve AK u rastvoru. SDS ima negativno naelektrisanje kojim se neutrališe naelektrisanje proteina tako da razdvajanje proteina zavisi isključivo od njihove mase.

57 SDS-PAGE: razdvajanje proteina po molekulskoj masi 2 β-merkaptoetanol Služi kao redukciono sredstvo za disulfidne mostove Neophodno sredstvo kad se vrši analiza denaturisanih polipeptida Bez β-merkaptoetanola dimeri spojeni disulfidnim mostovima bi migrirali kao jedan protein čija je masa većaod mase ispitivanog proteina

58 SDS-PAGE: razdvajanje proteina po molekulskoj masi 3 KLJUČNI KONCEPT: Zbog SDS-a i β- Merkaptoetanola, SDS-PAGE vrši separaciju proteina isključivo ivo na osnovu molekulske mase pojedinačnih polipeptida A B

59 Vizuelizacija proteina Popularne i jednostavne tehnike za vizuelizaciju zaciju proteina u gelu: Detekcija svih proteina u uzorku problem: nespecifičnost nost i mala senzitivnost Coomasie Blue Silver Staining

60 Vizuelizacija proteina Western Blotting (Immunoblotting): imunodetekcija individualnih proteina najsenzitivnija i najspecifičnija metoda

61 Western Blot ili Imunoblot: Opšti princip: Imunološka detekcija pojedinihproteina proteina posle separacije uzorka PAGE-om (Nativni PAGE ili SDS-PAGE) najčešć šće upotreblj ljavana tehnika za detekciju specifičnih proteina u ćeliji prednosti i razlozi velike upotrebe Western Blot-a: senzitivnost -5 pg proteina specifičnost izoforme proteina, lokalizacija u ćeliji, post- transkripcionemodifikacije itd.

62 Western Blot ili Imunoblot: Postupak: 1. Nativni PAGE ili SDS-PAGE 2. Elektroforetski ki transfer proteina na nitroceluloznu nu membranu 3. Blokiranje nespefičnih nih interakcija antitela i membrane mlekom 4. Inkubacija membrane sa primarnim (specifičnim antitelom) 5. Ispiranje viška primarnog antitela sa membrane 6. Inkubacija membrane mbrane sa sekundarnim antitelom za koje je prikačen enzim koji omogućava vizualizaciju lokacije proteina na membrani 7. Vizuelizacija produkta enzimske reakcijeposle dodavanja supstrat strata a za enzim(obi (obično hemiluminiscenca)

63 Klinička primena Western blot-a U dijagnostici: Potvrda prisustva anti-hiv antitela u serumu (proteini iz ćelija inficiranih HIV-virusom se razdvoje elektroforezom i prenesu na membranu. Ispitivani serumi se zatim nanesu analogno kao što se na membranu stavlja primarno antitelo; ne-vezano antitelo će se isprati, i dodaje se sekundarno antitelo na humani IgG, za koje je vezan enzim. Trake koje su se obojile pokazuju u kojem od ispitivanih seruma se nalaze antitela na HIV U dijagnostici sepse (prokalcitonin i njegovi razgradni proizvodi) U dijagnostici sepse (prokalcitonin i njegovi razgradni proizvodi) mada postoje i komercijalni kitovi (enzimski)

64 Western Blot ili Imunoblot:

65 Western Blot ili Imunoblot:

66 Klinička primena Western blot-a U dijagnostici: Detekcija prisustva C6 peptida Boreliae burgdorferi Lajmska bolest Detekcija oligoklonalnih traka porekla imunoglobulina u likvoru (multipla skleroza) Definitivna potvrda dijagnoze za prionske bolesti kao što je spongiformna encefalopatija (BSE, bolest ludih krava').

67 2D-SDS SDS-PAGE: Razdvajanje proteina po izoelektričnoj tački i molekulskojmasi: 1 Najmoćnija tehnika za razdvajanjeproteina zato što: 1. Proteini se prvo razdvajaju izoelektričnoj tački(pi) 2.Zatim se proteini razdvajaju pomoću SDS-PAGE po molekulskoj masi 3.Kombinacija te dve tehnike za separaciju proteina daje takvu rezoluciju da može da se simultano vizuelizuje do 20,000 proteina u nekim uzorcima Realno oko 1,000

68 2D-SDS SDS-PAGE: Razdvajanje proteina po izoelektričnoj tački i molekulskojmasi: 2 Šta je izoelektrična tacka(pi)? ph na kojoj je protein 100% neutralan proteini su kompleksni molekuli sa pozitivnim i negativnim nabojemna raznim mestima po dužini niza amino kiselina (npr. serini i glutamati) proteini se medjusobno razlikuju po broju i rasporedu pozitivnih i negativnih naboja pri ph koji odgovara pi ukupan zbirnegativnih ipozitivnih naboja na proteinu je nula naboj specifičnih amino kistelina zavisi donekle od ph uslova

69 2D-SDS SDS-PAGE: Razdvajanje proteina po izoelektričnoj tački i molekulskojmasi: 2 pi u separaciji proteina: imobilizovani ph gradijenti npr. Immobilon gel membrane i izoelektricno fokusiranje primer je samo jedan protein, ali naravno u uzorku su na 1000-e svaki sa drugačijimpi imolekulskom masom

70 IMUNOTESTOVI SA ČVRSTOM FAZOM (RIA i ELISA) Osnovna karakteristika ovih testova je da je jedan reagens (antigen ili antitelo) nerastvoran, odnosno u čvrstoj fazi (tj. vezan za zid epruvete ili zid bazenčića u polistirenskoj ploči za mikrotitraciju). Sadržaj antitela u nekom serumu (na primer, autoantitela na DNK kod bolesnika sasistemskim eritemskim lupusom) može se proceniti na osnovu njihove sposobnosti vezivanjaza antigen (DNK) koji je prethodno fizički adsorbovan za zid plastične epruvete ili zidove plastične ploče za mikrotitraciju. Količina vezanih antitela (autoantitela na DNK) može sepotom izmeriti dodavanjem radioaktivnim izotopom ( 125 I) ili enzimom obeleženog antitelaporeklom od druge vrste (miš, pacov, zec, ovca...), specifičnog za humane imunoglobuline, I merenjem radioaktivnosti, odnosno aktivnosti enzima.

71 Enzimski imunotest Enzimski imunotest -ELISA (engl. enzyme-linked immunosorbent assay) predstavljametod za detekciju i merenje antigena ili antitela u kome se koristi reakcija enzima sa supstratom, a pri čemu enzim služi kao obeleživač. Enzimi se najčešće vezuju za antitela, i toza antitela koja su ili specifična za neki antigen ili za antitela na imunogluobuline (Ig). Količinaenzima u antigen-antitelo kompleksu određuje se posredno merenjem količine produktarazgradnje odgovarajućeg supstrata koji se unosi u završnoj fazi testa. Koriste se enzimi čijisupstrati daju obojene produkte razgradnje i čija se količina lako može kolorimetrijski meriti. Na primer, enzim alkalna fosfataza i njen supstrat p-nitrofenil fosfat koji razgradnjom daje p-nitrofenol intenzivne žute boje. U načelu, ELISA je slična radioimunotestovima sa čvrstom fazom. Varijante ELISA tehnikedele se na tehnike u kojima je antigen u čvrstoj fazi i tehnike u kojima je antitelo u čvrstojfazi.

72 Uzorak: Eksperimentalni uzorak ćelijske kulture Uzorak pacijenta (Plazma, Serum, Likvor, Urin)

73 ELISA- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Izvodi se u ploči sa 96 bunara (mikrotitar pliča) Biohemijsko/imunološka tehnika koja omogućava detekciju antitela ili antigena u uzorku. Koristi se u dijagnostici. U ELISI dolazi do reakcije Antitelo-Antigen-Antitelo kojom se detektuje i kvantifikuje antigen prisutan u uzorku. Ukoliko je sekundarno antitelo vezano za enzim detekcija se završava dodavanjem enzimu specifičnog supstrata kako bi se razvila bolja čija se apsorbanca očitava na automatskom ELISA čitaču (spektrofotometru). Sekundarno antitelo može biti konjugovano i sa nekim fluorohromom pri čemu se detekcija završava merenjem intenziteta fluorescence. Izvođenje ELISA testa podrazumeva korišćenje jednog primarnog antitela koje je specifično za ispitivani antigen.

74 Postupak izvoñenja ELISA metode: 1. Nanošenje uzorka na ploču koja sadrži odgovarajuće primarno antitelo- inkubacija 2. Pranje 3. Nanošenje sekundarnog antitela (obeleženo sa enzimom ili fluorohromom)- inkubacija 4. Pranje 5. U slučaju korišćenja sekundarnog antitela obeleženog supstratom, nanošenje odgovarajućeg supstrata- inkubacija za razvijanje boje 6. Prekidanje enzimske reakcije

75 Shematski prikaz ELISA metode