Metode molekularne biologije

Transcript

1 Metode molekularne biologije

2 Metode za analizu hromozoma

3 Hromozom χρώμα (hroma) - boja i σώμα (soma) telo Sposobnost bojenja hromozoma je bila osnov na kojoj su se bazirale pionirske metode za analizu hromozoma Skup svih hromozoma u jednoj ćeliji, sa opisom njihovog broja i morfologije, predstavlja kariotip Hromozomi složeni po nekom sistemu, najčešće po veličini i morfologiji, čine kariogram Shematski prikaz kariograma označava se kao idiogram

4 Tehnike bojenja traka Uzorci: Sva tkiva čije se ćelije dele ili se mogu stimulisati na deobu Metode kariotipizacije Analiza hromozoma vrši se u metafazi ćelijske deobe korišćenjem svetlosnog mikroskopa

5 G trake - bojenje tripsinom i gimzom R trake reverzna tehnika suprotni kontrast od G traka Q trake bojenje kao i kod G traka a analiza fluorescentnim mikroskopom C trake - za bojenje konstitutivnog heterohromatina, za analizu stukturnih promena u okolini centromera

6 Tehnike bojenja traka Numeričke i strukturne aberacije hromozoma Detekcija hromozomskih rearanžmana većih od 2 Mb Široka primena za utvrđivanje hromozomskih rearanžmana u ćelijama fetusa (prenatalna dijagnostika) i u dijagnostici hematoloških neoplazmi

7 Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH Detekcija specifičnih regiona molekula DNK u citološkom materijalu fiksiranom na mikroskopskim pločicama Proces sparivanja jednolančanih polinukleotida iz dva različita izvora na osnovu komplementarnosti baza naziva se HIBRIDIZACIJA U mnogim tehnikama jedan polinukleotid je definisana sekvenca ili hemijski sintetisan molekul PROBA FLUORESCENTNO OBELEŽENE PROBE In situ znači u mestu (preseci tkiva ili citoloških uzoraka)

8 Gen-specifična proba Centromerna proba Telomerna proba Hromozom-specifična proba (Chromosome-painting probe) Probe za repetitivne DNK sekvence Različiti tipovi proba za fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH)

9 Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH Prednost u odnosu na tehniku bojenja traka: analiza i metafaznih hromozoma i interfaznih jedara FISH metodom detektuju se strukturne promene u genomu veće od 0,5kb Numeričke aberacije, strukturni hromozomski rearanžmani, genske mutacije

10 Komparativna genomska hibridizacija Konstruisana za analizu strukturnih promena u genomu tumorskih ćelija Metoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u Simultana hibridizacija dva različita uzorka genomskih DNK sa normalnim metafaznim hromozomima na mikroskopskoj pločici

11 Kontrolna genomska DNK izolovana iz tkiva zdrave osobe i genomska DNK tumorskog tkiva. Uzorci genomskih DNK obeležavaju se sa dve različite genomske probe. Zelena boja od biotina genomske proba kojom je obeležena tumorska DNK a crvena boja od digoksigena genomske probe kojom je obeležena kontrolna DNK.

12 Komparativna genomska hibridizacija Varijacije u intenzitetu boje čitavih metafaznih hromozoma odražavaju numeričke hromozomske aberacije, dok varijacije u intenzitetu fluoroboja u delovima istih hromozoma reflektuju promene u broju kopija delova hromozoma (duplikacije ili delecije delova hromozoma)

13 Metode za analizu nukleinskih kiselina

14 Načini sinteze i obeležavanja proba za hibridizaciju sa nukleunskim kiselinama

15 Probe Jednolančane DNK probe Dvolančane DNK probe RNK probe Oligonukleotidne probe Radioaktivno i neradioaktivno probe

16 Radioaktivno obeležene probe Sadrže inkorporisane nukleotide sa radioizotopima ( 32 P, 35 S ili 3 H) ili mogu biti obeležene na 5 -kraju sa radioaktivnim 32 P. Obeležavanje na 5 -kraju sa radioaktivnim 32 P zasnovano je na korišćenju bakteriofagnog enzima polinukleotid kinaze, koja obeleženu g fosfatnu grupu iz adenozintrifosfata (ATPa) prebacuje na 5 -kraj lanca DNK.

17 Radioaktivno obeležene probe Detekcija radioaktivnog signala vrši se autoradiografijom, koja podrazumeva dovođenje membrane sa radioaktivnom probom vezanom za odgovarajuću sekvencu u blizak fizički kontakt sa rentgen filmom. Mesta na kojima je film osvetljen radioaktivnošću vizuelizuju se kao crne trake nakon razvijanja filma.

18 Neradiaktivno obeležene probe Neradioaktivno obeležene probe sadrže inkorporisane nukleotide za koje su vezani reporterski molekuli, kao što su digoksigenin (DIG) ili biotin (vitamin H) Reporterski molekuli obično se kovalentno vezuju za pirimidinski prsten dutp-a ili ddutp-a. Prednosti korišćenja neradioaktivnih obeleživača

19 Neradiaktivno obeležene probe Detekcija signala neradioaktivno obeleženih proba zasnovana je na imunoesejima, originalno razvijenim za detekciju signala u Western blot analizama. U zavisnosti od tipa supstrata za enzim konjugovan na antitelo za reporterski molekul, vizuelizacija je kolorimetrijska ili hemiluminiscentna.

20 Načini sinteze i obeležavanja proba za hibridizaciju nukleinskih kiselina 1. Metoda nasumičnog sparivanja 2. Translacija sa prekidom 3. Obeležavanje DNK proba PCR-om 4. Obeležavanje DNK proba cdnk sintezom 5. Obeležavanje 3 kraja oligonukleotida 6. Obeležavanje oligonukleotida pomoću 3 repa

21 Metoda nasumičnog sparivanja Metoda za obeležavanje DNK proba zasnovana je na in vitro sintezi DNK korišćenjem smeše nasumičnih heksanukleotida kao prajmera i Klenovljevog fragmenta DNK polimeraze I E. coli koji nema 3-5 egzonukleaznu aktivnost Fragmenti DNK koji se obeležavaju veličine su od 100 bp do 10 kb.

22 Metoda nasumičnog sparivanja Smeša nasumičnih heksanukleotida sadrži različitih kombinacija heksanukleotida i obezbeđuje da za svaku sekvencu molekula DNK postoji odgovarajući prajmer. Obeleženi nukleotidi DIG 11 dutp Klenow fragment ugrađuje po jedan obeležen nukleotid na svakih 20 do 25 nukleotida.

23 Translacija sa prekidom Nick translacija Koristi se enzim DNazaI koja uvodi jednolančani prekid na dvolančanom DNK fragmentu koji se obeležava. Mesto jednolančanog prekida prepoznaje Kornebergov fragment DNK polimeraze I E. coli koji svojom 5-3 egzonukleaznom aktivnošću otklanja niz nukleotida sa 5 -kraja prekida i istovremeno nastalu prazninu popunjava de novo sintezom DNK koristeći 3 -kraj prekida kao mesto za otpočinjanje sinteze.

24 Translacija sa prekidom Nick translacija U toku sinteze DNK, Kornebergov fragment ugrađuje i obeleženi nukleotid, na primer DIG-11-dUTP. Translacijom sa prekidom obeležavaju se probe veličine od 200 do 500 bp koje se koriste za in situ hibridizaciju i FISH.

25 Obeležavanje oligonukleotida na 3'-kraju Zasnovano je na korišćenju enzima terminalne dezoksinukleotidil transferaze i jednog obeleženog dideoksinukleotida. U reakciji obeležavanja terminalna transferaza na 3 -kraj dodaje jedan DIG-11-ddUTP po jednom oligonukleotidu, s obzirom da dalja reakcija ugradnje nije moguća jer je reč o dideoksi-nukleotidu.

26 Obeležavanje pomoću 3 -repa Podrazumeva dodavanje niza od 10 do 100 nukleotida na 3 - kraj sintetičkih oligonukleotida. U reakciji obeležavanja terminalna transferaza dodaje smešu neobeleženih nukleotida i DIG-11-dUTP-a, praveći na taj način rep koji sadrži veliki broj DIG-11-dUTP-a. Oligonukleotidi sa 3 obeleženim repom najviše se koriste kao probe za in situ hibridizaciju.

27 Southern blot hibridizacija

28 Southern blot hibridizacija Metoda za identifikaciju specifičnih sekvenci molekula DNK Metodu konstruisao Edwin Mellor Southern (r.1938) 70tih godina 20. veka

29 Southern blot hibridizacija Zasniva se na razdvajanju fragmenata molekula DNK elektroforezom u gelu na osnovu veličine, prenosu razdvojenih fragmenata DNK sa gela na membranu i hibridizaciji sa specifičnom probom

30 Southern blot hibridizacija Digestija genomske DNK (najčešći uzorak za Southern blot hibridizaciju) sa jednim ili više restrikcionih enzima, kako bi fragment DNK od interesa bio dostupniji za hibridizaciju sa specifičnom probom. Fragmenti DNK se in situ denaturišu u agaroznom gelu Razdvajanje fragmenata DNK, na osnovu njihove dužine, elektroforezom u agaroznom gelu

31 Southern blot hibridizacija Gel je inertna podloga koja obezbeđuje kretanje makromolekula pod dejstvom jednosmerne struje. Po sastavu razlikujemo agarozni i poliakrilamidni gel. Za elektroforetsko razdvajanje makromolekula konstruisani su aparati za gel elektroforezu. Po položaju gela u aparatu razlikujemo horizontalnu i vertikalnu gel elektroforezu.

32 Southern blot hibridizacija Kako se sa fragmentima DNK koji se nalaze u agaroznom gelu ne može direktno manipulisati, ključni korak za identifikaciju određene sekvence DNK je njihov transfer sa gela na membranu kako bi se omogućila hibridizacija sa specifičnom probom.

33 Membrane NITROCELULOZNE Nukleinske kiseline vezuju se hidrofobnim interakcijama za ove membrane i direktno zavisi od jonske jačine pufera NAJLONSKE Fragmenti DNK vezuju se kovalentno (ireverzibilno) za najlonsku membranu

34 Transfer fragmenata DNK sa gela na membranu Dobijeni jednolančani fragmenti DNK u toku transfera prelaze sa gela na membranu zadržavajući svoje relativne položaje Kapilarni transfer Elektroforetski transfer Vakuum transfer

35 Kapilarni transfer

36 Elektroforetski transfer Vakuum transfer Odvija se između dva seta paralelnih elektroda u posebnoj aparaturi Nije praktičan za nitrocelulozne membrane jer puferi velike jonske jačine provode struju Za transfer koristi vakuum u posebnom aparatu Veoma brz transfer Za dobro denaturisanu DNK iz 1% agaroznog gela potrebno 30 minuta

37 Southern blot hibridizacija In situ hibridizacija DNK fragmenata sa specifičnim probama Detekcija i vizuelizacija stvorenih hibrida DNK-proba

38

39 Lančana reakcija polimeraze Lančanu reakciju polimeraze (eng. Polymerase Chain Reaction, PCR) godine osmislio je Kary Mullis (r.1944) i za ovo otkriće dobio Nobelovu nagradu za hemiju godine.

40 PCR je in vitro amplifikacija definisane sekvence DNK i predstavlja imitaciju procesa replikacije DNK. Reakcija koristi dva oligonukleotida (prajmera) koji su komplementarni krajevima sekvence DNK koja se umnožava i međusobno su suprotno orijentisani. Sinteza DNK je katalizovana termostabilnom DNK polimerazom.

41 PCR reakciona smeša je volumena od 5 do 100 l i sadrži komponente potrebne za in vitro sintezu DNK uzorak DNK, matrica koja se kopira; Prajmere, oligonukleotide komplementarane krajevima sekvence koja se kopira; Nukleotide, gradivne elemente DNK (dntp-ovi); Taq polimerazu, termostabilnu DNK polimerazu koja katalizuje ugradnju nukleotida po principu komplementarnosti sa DNK matricom; Jone Mg (Mg2+), neophodne za aktivnost Taq polimeraze i sintezu DNK; Pufer, koji obezbeđuje optimalnu aktivnost Taq polimeraze.

42 DNK uzorak - matrica koja se kopira Periferna krv Bris bukalne sluznice Biološki tragovi Amnionska tečnost Horionske čupice Tkivo dobijeno biopsijom Autopsijsko tkivo

43 Prajmeri Sintetisani jednolančani oligonukleotidi komplementarni krajevima sekvence DNK koja se kopira. Unikalnost sekvenci prajmera omogućava specifičnost same PCR reakcije. Tokom PCR reakcije, krajevi amplifikovanog fragmenta molekula DNK definisani su 5'-krajevima prajmera, a njihova veličina određena je rastojanjem između sekvenci koje prajmeri prepoznaju. Prajmeri u optimalno dizajniranoj PCR reakciji dužine su od 18 do 22 nukleotida sa balansiranim GC sastavom i temperaturom topljenja (T m ) u granicama od 55 o C do 65 o C.

44 5' 5' 5' Prajmer 1 Prajmer 3' 3' Prajmer 2 Palindromska sekvenca 5' 3' Struktura ukosnice 5' 3' 5' 5' 5' Sparivanje 3' komplementarnih krajeva prajmera Elongacija Prajmer-dajmer artefakt Prajmeri Ne sadrže 3 - kraj komplementaran 3 - kraju drugog prajmera u PCR jer mogu međusobno hibridizovati i poslužiti kao matrica što za rezultat ima prajmer dajmer artefakt. Ne sadrži palidromske sekvence koje na nižim temperaturama stvaraju strukture ukosnice stabilizovane intralančanim vodoničnim vezama. Smanjena efikasnost ili inhibicijapcr

45 Taq polimeraza Termostabilna DNK polimeraza od 94 kda. Izolovana iz Archaea Thermus aquaticus. Na temperaturi od 95 o C ima poluživot od 40 minuta. Optimalna temp. za njenu aktivnost od 72 o C do 75 o C. DNK zavisna DNK polimeraza sa brzinom polimerizacije od nukleotida/sekundi DNK polimeraza bez 3-5 egzonukleazne aktivnosti.

46 Komponente PCR reakcione smeše Matrica DNK, par prajmera, Taq polimeraza Nukleotidi gradivni elementi DNK datp, dctp, dgtp, dttp, ekvimolarni i svaki 200 mm. Joni Mg 2+ - grade komplekse sa dntp koji kao takvi predstavljaju supstrat za Taq polimerazu i neophodni za rad same Taq polimeraze. Pufer obezbeđuje optimalan ph za rad termostabilnih polimeraza od 8.3 do 9.2. Aditivi u cilju da se izvrši kompletna denaturacija molekula DNK, eliminacija sekundarnih struktura matrice i/ili prajmera, snižavanje tačke topljenja prajmera, stabilizacija Taq polimeraze i eliminacija dejstva raznih inhibitora PCR-a. Mineralno ulje u zavisnosti od tipa mašina za PCR.

47 PCR reakcija PCR reakcija izvodi se u mikrotubi zapremine 0,2 ml gde se u PCR mašinama (eng. thermocycler) podvrgava preciznim, cikličnim promenama temperature. Reakcija se odvija u ponovljenih ciklusa sinteze DNK.

48 Ponavljanje ciklusa, od kojih se svaki sastoji od denaturacije DNK, hibridizacije prajmera i ekstenzije hibridizovanih prajmera termostabilnom DNK polimerazom, za rezultat ima eksponencijalnu amplifikaciju specifičnog fragmenta DNK.

49 Svaki PCR ciklus sastoji se iz tri koraka Denaturacija DNK koja se izvodi se inkubacijom PCR reakcione smeše na 95 C; Hibridizacija prajmera sa matricom na temperaturi od 42 C do 65 C u zavisnosti od dužine i nukleotidne sekvence prajmera; Elongacija (ekstenzija) prajmera je proces ugradnje nukleotida na 3 -krajevima prajmera (sinteza DNK) katalizovan termostabilnom DNK polimerazom. Odvija se na temperaturi od 72 C (optimalna temperatura za rad Taq polimeraze).

50 Pre otpočinjanja prvog ciklusa PCR reakcije, PCR reakcione smeše inkubiraju se 5 min na temperaturi od 95 o C da bi se izvršila inicijalna denaturacija molekula DNK matrice. Nakon poslednjeg ciklusa PCR reakcije, najčešće se izvodi korak u kome se tokom 5 do 15 min PCR reakciona smeša inkubira na 72 o C u cilju kompletiranja parcijalno sintetisanih produkata - finalna elongacija.

51 Rezultat PCR reakcije Broj umnoženih fragmenata u PCR reakciji eksponencijalno raste jer svaki novosintetisani lanac u sledećem ciklusu služi kao matrica za sintezu DNK. Za 2 sata dobija se kopija određenog fragmenta DNK. PCR metodom uspešno se amplifikuju fragmenti DNK dugi do 1 kb (i do 5 kb i 40 kb ali zahteva modifikaciju standardne PCR metode).

52 Prednosti PCR metode Visoka senzitivnost koja se pre svega odnosi na minimalnu količinu matrice DNK neophodne za amplifikaciju određenog fragmenta; Visoka specifičnost PCR reakcije određena je selektivnom hibridizacijom prajmera sa komplementarnim sekvencama DNK koje ograničavaju fragment DNK koji se amplifikuje; Metoda je jednostava, bezbedna, brza i jeftina.

53 Primena PCR metode U bazičnim eksperimentima mol. biologije Molekularna filogenija Molekularna arheologija Forenzička genetika Molekularna dijagnostika bolesti čoveka

54 PCR u realnom vremenu real time PCR

55 PCR u realnom vremenu Modifikacije klasične PCR reakcije. Zahvaljujući upotrebom fluorescentno obeleženih proba, moguće je odrediti količinu PCR produkata u realnom vremenu odnosno nakon svakog pojedinačnog ciklusa PCR reakcije. Na ovaj način omogućena je precizna kvantifikacija PCR produkata a samim tim i precizna informacija o količini DNK matrice koja je bila predmet umnožavanja.

56 PCR u realnom vremenu Količina PCR produkata zavisi od broja izvršenih ciklusa PCR reakcije Plato Linearna faza Eksponencijalna faza

57 SYBR green I Prva proba korišćena u real-time PCR-u. Molekulu SYBER green-a i njenih derivata vezuju se za dvolančanu DNK i na određenoj talasnoj dužini emituju zelenu svetlost. Probe koje se hibridizuju za dvolančanu DNK nisu visoko specifične za sekvencu i količina emitovane svetlosti zavisi kako od količine DNK matrice tako i od njene dužine.

58 Hidrolizne probe Sintetisani oligonukleotidi Taqman probe Probe su dužine od 20 do 30 nukleotida. Poseduje sekvencu komplementarnu sekvenci fragmenta DNK (nizvodno od prajmera) koji se umnožava PCR reakcijom Obeležene su sa dve fluoroboje: na 5' kraju jednom koja se naziva reporter i na 3' kraju drugom koja se naziva prigušivač. Transfer fluorescentne rezonantne energije (eng. Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) predstavlja inhibiciju jedne boje drugom bez emitovanja fotona.

59 Hibridizacija probe, tokom PCR reakcije, dešava se nakon denaturacije ciljne DNK. Kada tokom svoje aktivnosti Taq polimeraza naiđe na hibridizovanu probu vrši njenu razgradnju. Nakon razgradnje probe fluoroboje se ne nalaze na rastojanju koje blokira emitovanje boje reportera.

60 Molekularni svetionici Jednolančane oligonukleotidne probe koje formiraju strukturu drške i petlje (eng. stem-and-loop). Sekvenca koja formira petlje komplementarna je ciljnoj sekvenci i obično je dugačka od 18 do 30 nukleotida. Krajevi petlje su međusobno komplementarni u dužini od 5 do 7 bp i, u nastavku, formiraju dršku. Na 5'-kraju probe nalazi se boja reporter, a na 3'-kraju boja prigušivač. Vezivanje probe za komplementarnu sekvencu u ciljnim molekulim DNK uzokuje konformacionu promenu probe

61 Prikaz intenziteta fluorescencije u zavisnosti od broja ciklusa u PCR reakciji u realnom vremenu

62 Tokom vremena kroz povećanje broja ciklusa intenzitet fluorescencije raste. Trenutak kada se intenzitet fluorescencije statistički značajno poveća iznad osnovnog nivoa fluorescencije označava se kao C T vrednost. Vrednost C T je obrnuto proporcionalna količini početne DNK u uzorku: što je količina veća manje će ciklusa biti potrebno da fluorescentni signal postane statistički veći od osnovnog nivoa fluorescencije.

63 PCR u realnom vremenu Za određivanje količine DNK uzorka tokom PCR u realnom vremenu potrebno je utvrditi standardnu krivu reakcije. Standardna kriva se konstruiše na osnovu određivanja C T vrednosti uzoraka sa poznatom količinom DNK. Korišćenjem konstruisane standardne krive i određivanjem C T vrednosti moguće je odrediti i početnu količinu molekula DNK u analiziranim uzorcima.

64 Upotreba TaqMan proba u esejima za genotipizaciju polimorfizama

65 Upotreba TaqMan proba u esejima za genotipizaciju polimorfizama Predstavljanje rezultata genotipizacije polimorfizma u vidu dijagrama sa determinisanim genotipovima uzoraka koji konstruiše 7500 Fast System SDS Software (Applied Biosystems, SAD).

66 animacija procedura Primena PCR u realnom vremenu Metoda za analizu i molekula DNK i RNK U molekularnoj biologiji, medicini i drugim prirodnim naukama

67 Molekularno-biološke metode za analizu molekula RNK Northern blot hibridizacija RT-PCR Analiza na genskim čipovima (eng. gene array)

68 Northern blot hibridizacija Metoda za detekciju i kvantifikaciju ciljnog molekula RNK. Osmišljena je godine, a ime je dobila igrom reči kao odgovor na naziv Southern blot metode za analizu molekula DNK. To je metoda kojom se vrši razdvajanje denaturisanih molekula RNK iz totalne ćelijske RNK ili poli-a frakcije RNK.

69 Northern blot hibridizacija Razdvajanje molekula RNK elektroforezom u denaturišućem agaroznom gelu. Transfer razdvojenih molekula RNK sa gela na membranu. Hibridizacija sa obeleženom probom. Detekcija hibrida molekul RNK proba.

70 Northern blot hibridizacija Uzorke RNK, pre nalivanja na gel, neophodno denaturisati kako bi se razbile sekundarne strukture RNK te omogućilo njihovo razdvajanje u gelu isključivo na osnovu veličine. Glioksalom i dimetilsulfoksidom (DMSO) na 50 C (pre nanošenja uzoraka na nedenaturišući agarozni gela). Formaldehidom i formamidom na 65 C (pre nanošenja uzoraka na denaturišući agarozni gel koji takođe sadrži formaldehid i formamid).

71 Transfer RNK sa gela na membranu Kapilarni, vakuum i elektroforetski transfer. Nakon transfera, molekuli RNK se za membranu fiksiraju primenom visoke temperature ili ultravioletnim zracima na =254 nm. Hibridizacija molekula RNK na membrani sa specifičnim probama u hibridizacionom rastvoru. Detekcija nagrađenih hibrida RNK-proba.

72 Primena Northern blot hibridizacije Detekcija i relativna kvantifikacija specifične irnk Određivanje veličine transkripta Detekcija alternativno splajsovnih transkripata Metoda koja se sve češće zamenjuje drugim metodama za analizu molekula RNK

73 PCR kome prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR)

74 RT-PCR PCR kome prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR) predstavlja adaptaciju PCR metode kojom je omogućeno kvalitativno i kvantitativno izučavanje molekula RNK, što se pre svega odnosi na analizu retkih irnk ili drugih RNK prisutnih u maloj količini.

75 RT-PCR Prvi korak u RT-PCR-u je proces reverzne transkripcije (RT reakcija) tokom kojeg molekul RNK služi kao matrica za sintezu komplementarne DNK (cdnk). Enzim reverzna transkriptaza. U drugom koraku, cdnk služi kao matrica za klasičnu PCR reakciju.

76 RT-PCR Nasumični heksameri - niz od 6 nukleotida nasumičnog redosleda. Ako se oni koriste kao prajmeri i totalna RNK kao matrica rezultat reakcije biće smeša velikog broja cdnk. oligo-dt - niz od 12 do 20 dt, koji se koristi za reverznu transkripciju eukariotskih irnk koje imaju poli-a rep na 3'-kraju. Specifični nizvodni prajmeri - izabran tako da bude komplementaran samo ciljnoj irnk koju želimo da amplifikujemo. Rezultat je amplifikacija molekula cdnk koji su komplementarni specifičnom molekulu irnk.

77 Prajmeri PCR reakcije Ako su se u RT reakciji koristili specifični nizvodni prajmeri, u PCR reakciju se uključuju specifični uzvodni prajmeri. Ako su se u RT reakciji koristili nasumični hekasameri ili oligo-dt prajmeri, PCR reakcija zahteva par specifičnih prajmera.

78 Primena RT-PCR-a Molekularna dijagnostika (za detekciju RNK virusa i za analizu mutacija na nivou irnk kod malignih i drugih bolesti čoveka). Primena u osnovnim molekularnobiološkim istraživanjima za ekspresione analize na novou irnk.

79 Analize na genskim čipovima

80 Analize na genskim čipovima Čvrste podloge na kojima je kolekcija specifičnih nukleinskih kiselina smeštena na definisanim pozicijama. To se postiže njihovim istačkavanjem (eng. spotting) ili direktnom sintezom na podlozi čipa. Jedan genski čip poseduje hiljade tačaka čiji su dijametri manji od 200 mikrona.

81 Analize na genskim čipovima Istačkavanje sekvenci cdnk dužine od 500 bp do 5 kb ili sintetičkih oligonukleotida dužine od 20 do 80 nukleotida vrši se za tu svrhu konstruisanim robotima.

82 Analize na genskim čipovima Kod analiza na genskim čipovima, uzorak koji sadrži nukleinske kiseline obeležava se i onda hibridizuje sa specifičnim nukleinskim kiselinama na podlozi čipa. Na osnovu količine obeleženih uzorka koja hibridizuje za svaku tačku (eng. spot) na čipu dobija se informacija o specifičnom sastavu nukleinskih kiselina u ispitivanom uzorku.

83 Analize na genskim čipovima Glavna prednost genskih čipova jeste da oni mogu dati informacije o hiljadama gena ili irnk u samo jednom eksperimentu. Tako je njihovim korišćenjem moguće analizirati ekspresiju hiljade gena istovremeno.

84 Analize na genskim čipovima Svaku analizu zasnovanu na korišćenju genskih čipova karakteriše veliki broj rezultata za čiju analizu su neophodni specifični softverski paketi

85 Primena analize na genskim čipovima Za identifikaciju sekvenci (npr. analizu mutacija) Za analizu diferencijalne ekspresije gena u dva ili više uzorka