Doc. dr Snežana Marković

TRANSKRIPCIJA Doc. dr Snežana Marković Institut za biologiju i ekologiju Prirodno-matematički fakultet Univerzitet u Kragujevcu

RIBONUKLEINSKE KISELINE VRSTE I FUNKCIJE RNK irnk trnk rrnk snrnk male nuklearne RNK (za splajsovanje primarnog transkripta, formiranje ribozoma) ncrnk - male nekodirajuće RNK: mirnk mikro RNK (kodirane intronima); sirnk - male interferentne RNK (dvolančane RNK)... Procesi RNK interferencije (RNAi) koriste nekodirajuće male RNK da bi se regulisali procesi transkripcije, splajsovanja i translacije. Linearni nizovi nukleotida (A, G, C, U), riboza i fosfat Jednolančani molekuli, javlja se sekundarna struktura Tri glavne kategorije RNK se razlikuju po baznom sastavu, sekundarnoj strukturi i veličini irnk raznorodne trnk oko 80 nukleotida, 4S, sek. struktura rrnk 1600 n. 16S, 3200 n. 23S, 2500 n. 18S, 5500 n. 28S Sve RNK nastaju u procesu prepisivanja informacija sa DNK transkripcija.

TRANSKRIPCIJA Sinteza RNK kao kopije ograničenog regiona DNK, koju katalizuje RNK polimeraza Terminologija: matrični i kodirajući lanac DNK; mesto početka transkripcije (uzvodno, nizvodno); promotor; RNK polimeraze Mehanizam: Inicijacija: RNK polimeraza se vezuje za promotor na DNK; mesto početka transkripcije Elongacija: RNK polimeraza odvija jedan zavoj DNK, a zatim povezuje prva dva ribonukleozid trifosfata 3-5 fosfodiestarskom vezom; transkripcija u smeru 5-3 Terminacija: terminacioni signal, zaustavlja se transkripcija, RNK se oslobađa sa matrice Bilo koji lanac DNK kao matrica, ali se transkribuje samo jedan određen orijentacijom promotora.

TRANSKRIPCIJA KOD PROKARIOTA E. coli Istovremeno sa translacijom Jedna RNK polimeraza: β, β, α, ω, σ subjedinice; α od dva polipeptida, a ostale od po jednog σ subjedinica prepoznaje vezivno mesto u okviru promotora, lako disosuje od ostalog dela proteina; 6 različitih σ subjedinica β i β subjedinica rakova klešta i katalitički centar enzima RNK pol -dve korektivne uloge. pirofosforilitički editing; enzim katališe uklanjanje nekorektno ugrađenog ribonukleotida preko ponovne ugradnje PP. hidrolitička provera (kao DNK pol); stimulišu ga faktori koji su i elongacioni faktori (Gre faktor).

Субјединице Улога алфа (α) неопходна за повезивање ензима, реагује са неким регулаторним протеинима, укључена је у катализу бета (β) укључена у катализу, иницијација и елонација бета' (β') везује се ДНК матрицу сигма (σ) усмерава ензим ка промотору омега (ω) неопходна је за обнову денатурисане РНК пол у in vitroусловима и да оствари потпуну функционалну форму σфактор Улога σ 70 основни сигма фактор σ 54 азотом-регулисана генска транскрипција σ 32 температурни шок генска транскрипција σ S генска експресија у стационарном стању ћелије σ F експресија флагеларног оперона σ E укљученост протеина топлотног стреса и одговора на оксидативни стрес,регулација експресије екстрацитоплазматских протеина σ FecI регулација fecгена за транспорт гвожђа субјединице РНК полимеразе прокариоти еукариоти бактерије РНК пол I РНК пол II РНК пол III β β α α ω РПА1 РПА2 РПЦ5 РПЦ9 РПБ6 +9 субјединица РПБ1 РПБ2 РПБ3 РПБ11 РПБ6 +7 субјединица РПЦ1 РПЦ2 РПЦ5 РПЦ9 РПБ6 +11 субјединица

PROMOTORSKI REGIONI Promotor sekvenca(e) DNK za koju se vezuje RNK polimeraza Konsenzusna sekvenca - dva niza od po 6 nukleotida na rastojanju od oko 20 bp prepoznaje σ subjedinica Prvi na poziciji -35 (TTGACA) Drugi na poziciji -10 (TATAAT) Pribinovljev blok Njihov međusoban položaj određuje orijentaciju promotora, izbor lanca za transkripciju; sens (matrični) i antisens (kodirajući) lanac. Jaki promotori između konsenzusnih sekvenci imaju kraće nizove promenjljivih nukleotida Slabi promotori imaju duže spejsere, između konsezusnih nizova. TTGATA -- 16 -- TATAAT TTGACA -- 17 TATAAT CTGACG -- 18 -- TACTGT TTGACA -- 17 -- TATAAT Jačina promotora - količina transkripata koja se inicira u datom trenutku; zavisi koliko promotor jako vezuje polimerazu, koliko uspešno podržava izomerizaciju i kako brzo polimeraza može da ga napusti. UP elementi, produženi, diskriminator - dopunski DNK elementi koji vezuju RNK pol kod nekih jakih promotora; pojačavaju specifičnost enzima prema promotoru

INICIJACIJA Prva faza: RNK pol se pomoću σ subjedinice vezuje na poziciji -35 = zatvoreni kompleks Druga faza: helikaza lokalno denaturiše DNK u dužini od 17 nukleotida od pozicije -10 = otvoreni kompleks Izomerizacija prelaz iz prve u drugu fazu σ subjedinica disosuje Prvi ribonukelotid je A Abortivna transkripcija ELONGACIJA 20-50 ribonukleotida/sec DNK žiraza Do terminacionog signala

TERMINACIJA Terminacioni signal: jedan invertovani ponovak, a zatim niz od nekoliko A na matričnom lancu DNK u irnk invertovan ponovak će nagraditi interlančanu zavojnicu, a nakon toga je rep od UUU Od matričnog lanca se odvajaju i RNK pol i irnk Intralančane sekundarne strukture atenuatori ρ faktor protein, terminacioni faktor kad ne postoje prethodni terminacioni signali; ima ATPaznu aktivnost i klizi duž nascenentne RNK, odvaja je od DNK kada pol zastane na ukosnici

TRANSKRIPCIJA KOD EUKARIOTA Modifikacija (obrada primarnih transkripata) RNK Transkripcija i translacija vremenski i prostorno odvojeni procesi

U jedrima eukariota: RNK pol I, RNK pol II i RNK pol III (po 2 velike i 12 malih subjedinica) RNK pol u organelama RNK pol II transkribuje strukturne gene; RNK pol kvasca (RPB1-10; RPB1 sadrži CTD rep bogat OH grupama na Ser) RNK pol I transkribuje velike rrnk (18S, 28S i 5.8S) RNK pol III transkribuje trnk, malu rrnk (5S) i snrnk Različiti promotori za RNK pol Transkripcioni faktori specifično prepoznaju nizove nukleotida u promotoru, vezuju RNK pol za promotor, tačna inicijacija transkripcije Promotori za RNK pol I i II su uzvodno od mesta početka transkripcije, a za RNK pol III unutar strukturnih gena

Хумане РНК полимеразе Полимеразе Локација Продукт РНК пол I Нуклеолус 18S, 28S, 5.8S ррнк РНК пол II Нуклеоплазма хнрнк/ирнк У1, У2, У4, У5 снрнк РНК пол III Нуклеоплазма трнк 5SРНК, У6 снрнк, 7SL РНК Мит РНК пол Митохондрије Све мит РНК

PROMOTORI ZA RNK POL II Konstitutivni geni sadrže GC blok Geni koji se eksprimiraju samo u nekim tkivima najčešće ne sadrže GC blok, već imaju TATA blok na -20 do 30 nukleotida (tačnost inicijacije i efikasnost transkripcije) CCAAT blok na -70 do -90 nukleotida Četiri elementa konsenzusne sekvence u sastavu osnovnog promotora za Pol li BRE element prepoznaje TFIIB faktor TATA element prepoznaje TBP Inicijator (Inr) - prepoznaju TAF proteini TFIID kompleksa. Nizvodni promotorski element DPE - prepoznaju TAF proteini TFIID kompleksa. Regulatorne sekvence : pojačivači, prigušivači i insulatori

PROMOTORI RNK POL I Strukturno specificni za vrstu organizma rrnk geni u više kopija Dva niza nukleotida +6 do -31 nukleotid -187 do -107 nukleotid

PROMOTORI ZA RNK POL III Unutar strukturnih gena 5S geni promotor u okviru +40 do +80 nukleotida Geni za trnk A i B blok od po 10-tak nukleotida

U ćelijama eukariota se nalazi oko 40000 molekula RNK pol I i isto toliko RNK pol II i oko 20000 molekula RNK pol III; koncentracija je promenljiva TRANSKRIPCIONI APARAT EUKARIOTA Postoje inicijacioni i terminacioni signali Dužina transkripta RNK pol II je 10000-20000 nukleotida Različiti promotori funkcionišu sa različitom efikasnošću U ćeliji postoji mnogo vrsta irnk Za inicijaciju transkripcije neophodno je otvaranje hromatina hipersenzitivna mesta

DNK se u toku transkripcije namotava oko nukleozoma (kao oko kalema) omogućavajući pristup RNK pol Destabilizacija nukleozoma ispred RNK pol, a njihovo formiranje iza enzima remodeliranje histona

Transkripcija kod eukariota Inicijacija Osnovni transkripcioni faktori (TFIIB, D, E, F, H, A) vezuju RNK pol II za promotor Preinicijacioni kompleks ( zatvoreni kompleks ) otvoreni kompleks topljenje promotorskog regiona helikazna aktivnost TFIIH; abortivna inicijacija RNK pol II čiji CTD nije fosforilisan može da inicira transkripciju. Elongacija Elongacija transkripcije nakon fosforilacije CTD (kinazna aktivnost TFIIH) Elongacioni faktori P-TEFb stimuliše elongaciju; poseduje kinaznu aktivnost, stimuliše elongaciju preko fosforilacije CTD repa Pol II. hspt5 regrutuje enzime za dodavnje 5 kape TAT-SF1 protein regrutuje komponente splajsozoma. Terminacija Specifični nizovi nukleotida ili specifične sekundarne strukture Signal za adenilaciju AAUAAA, transkripcija se nastavlja i do više 1000 nukleotida nakon toga PoliA polimeraza dodaje polia rep Nakon terminacije transkripcije fosfataze recikliraju RNK pol II u nefosforilisani oblik.

PRODUKTI TRANSKRIPCIJE RNK POLIMERAZOM II Heterogene nuklearne RNK (hnrnk) primarni transkript prekursor irnk (pre-irnk) od egzona i introna obrada zrela irnk Ribonukleoproteinski kompleksi (RNP) Male jedarne RNK (snrnk ili U-RNK) Proteini Pre-iRNK ili irnk OBRADA TRANSKRIPATA KOVALENTNIM MODIFIKACIJAMA Elongacija i terminacija transkripcije i obrada irnk su međusobno povezani i koordinisani procesi. Svi enzimi uključeni u obradu RNK reaguju sa CTD repom Pol II, zamenjuju inicijatorne transkripcione faktore sa enzimima koji dodaju 5 kapu i vrše splajsovanje irnk, faktorima za poliadenilaciju i kidanje irnk. 5 kapa, pozitivno naelektrisana, bitna za vezivanje za ribozom Na 5 kraj pre-irnk dodaje se 7-metil-guanozin (5-5 trifosfatnim mostom vezan za prvi ribonukleotid) Metilacija 2 OH grupe prve (nekad i druge) riboze u nizu Metilacija N 6 atoma purinskog prstena ako je prva baza adenin Na 3 kraju 3 -poli(a) rep Na pre-irnk poli(a)polimeraza dodaje 100-200 A nukleotida Signal za poliadenilaciju je AAUAAA Endonukleaza hidrolizuje primarni transkript 15 nukleotida nizvodno od signala za poliadenilaciju, a zatim deluje poli(a)polimeraza uz ATP

OBRADA TRANSKRIPATA ISECANJEM INTRONA Pre-iRNK je nestabilna i samo mali deo izbegne degradaciju (oko 5%) Obrada hnrnk do irnk traje oko 30 min Introni i egzoni Obrada transkripata isecanjem introna (RNA splicing) u jedru

Dužina introna od 100 do 1000 nukleotida 5 mesto splajsovanja - GU na 5 kraju (donori); 3 mesto splajsovanja - AG na 3 kraju (akceptori); mesto grananja u intronu (A) Komplementarni snrnk u snrnp česticama Formiranje RNK-RNK hibrida Prekidanje lanca u granicama introna i spajanje egzona

snrnk (U-RNK) U1-RNK su komplementarne graničnim nizovima introna U2-RNK su komplementarne nizovima unutar introna U4-RNK su komplementarne signalu za poliadenilaciju U5-RNK su komplementarne 3 krajevima introna snrnp (U1-RNP, U2-RNP, U4-RNP,..) Za obradu pre-irnk Za transport RNK iz jedra u citoplazmu Pakovanje ribozoma u nukleolusu Splajsozomi (50-60S) od pre-irnk, U-RNK i proteina Prva faza: presecanje veze između I i E i formiranje 2,5 -fosfodiestarske veze između G (5 kraja I) i A (u okviru I) omča Druga faza: iskrajanje I i spajanje E; energija tranesterifikacije Proteini koji imaju ključnu ulogu u regulaciji splajsovanja i ulogu aktivatora u regulaciji alterantivnog splajsovanja su familija SR proteina Proteini SR familije poseduju dva domena: Domen preko koga se vezuju za RNK sekvencu (eng. RNA recognition motif, RRM). Domen bogat argininskim i serinskim ostacima (RS motiv) preko koga interaguju sa komponentama splajsozoma, regrutujući ih na susedno splice mesto. Proteini represori alternativnog splajsovanja Transport zrelih irnk kroz jedrove pore u citoplazmu Proteini koji markiraju zrelu irnk su SR proteini (ostaju vezani za zrelu irnk) i proteini koji se specifično vezuju samo za egzon-egzon granice.

AUTOKATALITIČKA OBRADA RNK Obrada primarnog transkripta za rrnk kod Tetrahymena thermophila Ribozim Grupa I - introni sadrže niz (interni vodič) komplementaran sa egzonom (G na mestu grananja); linearni isečeni intron Grupa II introni na 5 kraju sadrže niz GUGCG (A na mestu grananja) RNK izvorni molekul

Introni genetiča fleksibilnost ćelije Alternativna obrada transkripata rezultuje različitim izoformama proteina (kod čoveka 92-94% gena se altern. obrađuje) Intra- i intermolekulske obrade transkripata Alternativno splajsovanje - zrela irnk može sadržati sve egzone ili može biti alterantivno obrađena Preskakanjem egzona Produžavanjem egzona Zadržavanjem sekvence introna Alterantivnim korišćenjem dva egzona - zrela irnk je smeša dve različite irnk. Editovanje RNK - proces u kome se menjaju sekvence na nivou informacione RNK (irnk). Mesto-specifičnom dezaminacijom C ( U) ili A ( inozin) Insercijom ili delecijom U uz pomoć vodič RNK molekula (grna). Alternativna obrada primarnog transkripta najviše zastupljena u nervnom sistemu čoveka

RAZLIKE IZMEĐU PROKARIOTSKIH I EUKARIOTSKIH irnk PROKARIOTE Bez introna Policistronske Kratkoživeće (min) Na 5 kraju je čeoni niz (sa Šajn-Dalgarnovim nizom) ispred start kodona AUG, zatim kodirajući niz i stop kodon (UAA, UAG, UGA) i niz koji se ne translatuje (intercistronski deo) EUKARIOTE Obrada hnrnk Monocistronske Dugoživeće (sati) U polizomima ili u obliku irnp u citoplazmi Na 5 kraju je 5 kapa, čeoni niz, start kodon, kodirajući niz, stop kodon, nekodirajući niz i na 3 kraju poli(a) rep