Elektronska paramagnetna resonanca (EPR)

Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) Pregled predavanja o EPR snovni princip delovanja EPR v primerjavi z NMR Instrumentacija Analiza EPR signala Primeri praktične uporabe EPR Posebne metode, ki temeljijo na EPR Instrumentalna farmacevtska analiza 1

Kaj je EPR? Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) Elektronska spinska resonanca (ESR) { Elektronska magnetna resonanca (EMR) } Spektroskopija: ne-destruktivna analizna tehnika dkritje EPR Yevgeny Zavoisky, Kazan 1944 CuCl 2, CuS 4, MnS 4 Instrumentalna farmacevtska analiza 2

Kakšne spojine lahko analiziramo? Zvrsti z enim ali več nesparjenimi elektroni Radikali (stabilnost!) Spojine z elementi prehodnih kovin Defekti v kristalnih rešetkah H H H H EPR Princip delovanja B 0 E h Instrumentalna farmacevtska analiza 3

Zeemanov efekt Degenerirano stanje Magnetno polje Magnetni momenti elektronov se v zunanjem magnetnem polju skoraj naključno porazdelijo na dva energijska nivoja. Ko je sistem v termičnem ravnovesju jih je nekoliko več na energijskem nivoju z nižjo energijo, saj sledijo Boltzmannovi porazdelitvi. Kaj povzroči razliko med energijskimi nivoji? B 0 Razcep energijskih nivojev elektronov v zunanjem magnetnem polju (B 0 ). Nižji energijski nivo: magnetni moment elektrona je poravnan z zunanjim magnetnim poljem B 0 (oz. precesira okoli smeri zunanjega mag. polja) Instrumentalna farmacevtska analiza 4

Kako opišemo energijska nivoja? S pomočjo elektronskega spina in z njim povezanega magnetnega momenta Za molekulo z enim nesparjenim elektronom: V zunanjem magnetnem polju je razlika med elektronskima energijskima nivojema enaka: E = g B B 0 M S g = sorazmernostni faktor M S = elektronsko spinsko kvantno število (+½ ali -½) B = Bohrov magneton B 0 = Magnetno polje Prehodi med energijskima nivojema B 0 E h Absorpcija mikrovalov Med spreminjanjem magnetnega polja (an. sweep) postanejo elektronski spini resonantni s frekvenco mikrovalov s katerimi obsevamo paramagnetni vzorec. Vzorec zato absorbira moč (energijo) mikrovalov, kar vodi v EPR prehod. Ta se slednjič po spin-lattice relaksaciji pretvori v toploto. Instrumentalna farmacevtska analiza 5

EPR meritev Energija M s ±½ M s = +½ E=h =g B B pp B = 0 B > 0 M s = -½ Magnetno polje (B) h Planckova konstanta 6.626196 x 10-27 erg.s frekvenca (GHz ali MHz) g g-faktor (približno 2.0) Bohrov magneton (9.2741 x 10-21 erg.g -1 ) B magnetno polje (G ali mt) Pri EPR meritvi paramagnetni vzorec v zunanjem magnetnem polju absorbira elektromagnetno valovanje (mikrovalove), ko je izpolnjen resonančni pogoj: pri izbrani frekvenci mora biti ustrezna jakost magnetnega polja. Frekvenca in polje EPR meri prehode elektronskih spinov med energijskimi nivoji Prehod inducira elektromagnetno valovanje z ustrezno frekvenco (mikrovalovi), s katerim vzorec obsevamo Frekvenca elektromagnetnega valovanja, ki je potrebna za prehod je odvisna od jakosti magnetnega polja Pas mikrovalov L S X K Q W Frekvenca [GHz] 1 3 9 24 35 94 B res (za g=2) [G] 390 1070 3380 8560 12480 33600 bmočje mikrovalov 1-100 GHz 10.000 G = 1 T (gauss) (tesla) Instrumentalna farmacevtska analiza 6

Časovno okno EPR nsčasovna skala Za EPR so vse spremembe vezi prehitre, zato jih vidi povprečene. Spremembe konformacij kratkih verig (lipidi!) pa so ravno v časovnem oknu EPR, zato je EPR tako občutljiv na anizotropijo njihovega opletanja. Spremembe konformacij daljših polimerov (proteini) so za EPR prepočasne, zato jih zazna kot superpozicijo konformacij. EPR spekter Absorpcija, A Prvi odvod absorpcije, da/db Polje, B Polje, B EPR spekter je prvi odvod absorpcijskega spektra Instrumentalna farmacevtska analiza 7

g faktor Izmerjen iz sredine signala Za prost elektron 2.00232 Za organske radikale Pogosto blizu vrednosti za prosti elektron 1.99-2.01 g = h / B Za spojine z elementi prehodnih kovin Večja odstopanja zaradi sklopitev s spinskimi orbitalami in zero-field splitting 1.4-3.0 g faktor Mo(SCN) 5 2- V(acetilacetonat) 2 1.935 1.968 e - 2.0026 CH 3 2.0023 C 14 H 10 + (antracen) kation C 14 H 10 - (antracen) anion Cu(acetilacetonat) 2 2.0028 2.0029 2.13 Instrumentalna farmacevtska analiza 8

g faktor 8 6 4 3 g -factor 2 Manganese Plastocyanin Ferredoxin Metmyoglobin 50 100 150 200 250 300 350 400 Magnetic field, mt Identifikacija kovinskih ionov preko njihovih g faktorjev EPR Instrumentacija Izvor Vzorec Detektor Instrumentalna farmacevtska analiza 9

Kako deluje EPR spektrometer? Mikrovalovni most dprtina za vzorec Resonator Elektromagnet Konzola Mikrovalovni most - diagram Magnet Instrumentalna farmacevtska analiza 10

Mikrovalovno polje v resonatorju Modulacija Če bi vzorec v resonatorju obsevali z enako močjo mikrovalov in spreminjali magnetno polje (an. sweep), bi bil izstopni tok na diodi sorazmeren absorpcijskemu spektru in ne prvemu odvodu. Prvi odvod dobimo z modulacijo zunanjega magnetnega polja (B 0 ), ki vodi do oscilacije absorpcijskega signala. Amplitudo oscilacije absorpcijskega signala detektiramo s fazno odvisnim detektorjem. Prednost tega dodatnega koraka je filtracija šuma, ki ne niha z modulacijsko frekvenco in neresonančne absorpcije mikrovalov, ki ni odvisna od magnetnega polja. Nadalje s prvim odvodom dosežemo boljšo resolucijo v primerjavi s samim absorpcijskim spektrom. Instrumentalna farmacevtska analiza 11

Potek EPR meritve EPR Multipliciteta EPR signala - hiperfina interakcija Instrumentalna farmacevtska analiza 12

Hiperfina interakcija Hiperfina interakcija Elektron S (½) Jedro I (½) M s +½ M I +½ a M S =±½ -½ E 1 E 2 B -½ E = g BS z + (ha 0 )S z I z E = g BS z + (a)s z I z (ha 0 (Hz) a (G) preko g-faktorja) -½ +½ Selekcijsko pravilo M S = ±1 (elektron) M I = 0 (jedro) dublet E 1 = g B + a/2 E 2 = g B -a/2 E 1 E 2 = a Instrumentalna farmacevtska analiza 13

Elektron S (½) Jedro I (1) M s M I M S =±½ +½ +1 +0-1 a E 1 E 2 E 3 -½ -1 +0 +1 triplet B E = g BS z + (ha 0 )S z I z E = g BS z + (a)s z I z (ha 0 (Hz) a (G) preko g-faktorja) Selekcijsko pravilo M S = ±1 (elektron) M I = 0 (jedro) E 1 = g B + a E 2 = g B E 3 = g B -a Hiperfina interakcija EPR signal se razcepi zaradi sosednjih jedrer To imenujemo hiperfine interakcije Nam da informacije o: Številu in identiteti jeder Razdalji od nesparjenega elektrona Interakcije s sosednjimi jedri E = g B B 0 M S + am s m I a = hiperfina konstanta sklopitve m I = jedrsko spinsko kvantno število a - izmerjena kot razdalja med centroma dveh signalov Instrumentalna farmacevtska analiza 14

Katera jedra vstopajo v interakcijo? Enaka selekcijska pravila kot pri NMR Vsak izotop vsakega elementa ima jedersko spinsko kvantno število osnovnega stanja, I ki ima vrednost n/2, n je celo število Izotopi s sodim atomskim številom in sodim masnim številom imajo I = 0, in nimajo EPR spektra 12 C, 28 Si, 56 Fe, Izotopi z lihim atomskim številom in sodim masnim številom imajo sod n 2 H, 10 B, 14 N, Izotopi z lihim masnim številom imajo lih n 1 H, 13 C, 19 F, 55 Mn, Katera jedra vstopajo v interakcijo? 1 H I =1/2 13 C I =1/2 14 N I =1 15 N I =1/2 High spin Fe(III) I = 5/2 Low spin Fe(III) I =1/2 63 Cu(II) I =3/2 55 Mn(II) I =5/2 95 Mo(V) I =5/2 97 Mo(V) I =5/2 61 Ni(III) I =3/2 51 V I =7/2 Instrumentalna farmacevtska analiza 15

Hiperfina interakcija primer H H - + 400 50.7 mt 200 0-200 -400 3300 3350 3400 Atomarni vodik: interakcija e - z jedrom (protonom) s spinom ½ Hiperfina interakcija Sklopitveni vzorci enaki kot pri NMR Pogosteje vidimo sklopitve z jedri s spinom večjim od ½ Število črt: 2NI + 1 N = število ekvivalentnih jeder I = jedersko spinsko kvantno število Določa samo število črt ne pa intenzitet Instrumentalna farmacevtska analiza 16

Hiperfina interakcija Relativne intenzitete so določene s številom jeder, ki vstopajo v interakcijo Če vstopa v interakcijo samo eno jedro Imajo vse črte enako intenziteto Če vstopa v interakcijo več jeder Distribucije izpeljane na podlagi spina Za spin ½ (najpogosteje), sledijo interakcije binominalni porazdelitvi Relativne intenzitete I = ½ N 0 1 2 3 4 5 6 Relativne intenzitete 1 1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1 1 : 4 : 6 : 4 : 1 1 : 5 : 10 : 10 : 5 : 1 1 : 6 : 15 : 20 : 15 : 6 : 1 Instrumentalna farmacevtska analiza 17

Relativne intenzitete I = ½ Relativne intenzitete I = 1 N 0 1 2 3 4 5 6 Relativne intenzitete 1 1 : 1 : 1 1 : 2 : 3 : 2 : 1 1 : 3 : 6 : 7 : 6 : 3 : 1 1 : 4 : 10 : 16 : 19 : 16 : 10 : 4 : 1 1 : 5 : 15 : 20 : 45 : 51 : 45 : 20 : 15 : 5 : 1 1 : 6 : 21 : 40 : 80 : 116 : 141 : 116 : 80 : 40 : 21 : 6 : 1 Instrumentalna farmacevtska analiza 18

Relativne intenzitete I = 1 Hiperfine interakcije primer 1 Primer: V(acetilacetonat) 2 Interakcija e - z vanadijevim jedrom Za vanadij, I = 7/2 Zato, 2NI + 1 = 2(1)(7/2) + 1 = 8 Pričakujemo, da bomo videli 8 črt enake intenzitete Instrumentalna farmacevtska analiza 19

Hiperfine interakcije primer 1 EPR spekter vanadil acetilacetonata Hiperfine interakcije primer 2 Primer: Benzen radikal anion [C 6 H 6 ] - Elektron je delokaliziran čez vseh šest ogljikovih atomov Sklaplja se s šestimi ekvivalentnimi vodikovimi atomi Zato, 2NI + 1 = 2(6)(1/2) + 1 = 7 Zato ima spekter sedem črt z relativnimi intenzitetami 1:6:15:20:15:6:1 Instrumentalna farmacevtska analiza 20

Hiperfine interakcije primer 2 EPR spekter benzen radikal aniona Hiperfine interakcije Sklopitve z več seti jeder: Prva sklopitev z najbližjim setom jeder Največja vrednost a Razcep vsake od teh črt zaradi sklopitve z naslednjim najbližjim jedrom Naslednja največja vrednost a Nadaljuj 2-3 vezi vstran od lokacije nesparjenega elektrona Instrumentalna farmacevtska analiza 21

Hiperfine interakcije primer 3 Primer: Pirazin anion radikal Elektron je delokaliziran čez obroč Sklaplja se z dvema ekvivalentnima jedroma N (I = 1) 2NI + 1 = 2(2)(1) + 1 = 5 Nato se sklaplja s štirimi ekvivalentnimi H (I = ½) 2NI + 1 = 2(4)(1/2) + 1 = 5 Zato mora biti spekter kvintet z intenzitetami 1:2:3:2:1 in vsaka od teh črt se mora razcepiti v kvintet z intenzitetami 1:4:6:4:1 Hiperfine interakcije primer 3 EPR spekter pirazin radikal aniona Instrumentalna farmacevtska analiza 22

EPR Primeri praktične uporabe EPR 5P 7P 10P 12P 12C 14P 1 mt Kvantitativna & kvalitativna analiza Kvantitativna analiza signala: intenziteta (h), površina pod krivuljo Kinetika redukcije nitroksidov Kvantifikacija paramagnetnih centrov d 1 d 0 d -1 h 1 h 0 h -1 Kvalitativna analiza signala: oblika signala, širina črt (d), a N Nitroksidni radikali poročajo o svoji okolici: kisik, polarnost, ph, viskoznost, urejenost (ureditveni parameter) a N g 0 Instrumentalna farmacevtska analiza 23

Nitroksidi kot merilci reduktivnega statusa tkiva EPR Intenziteta t ½ ~ min EPR aktiven EPR neaktiven Čas (min) Kinetika redukcije nitroksidnega radikala ksimetrija brez 2 prisoten zračni 2 5P 1 mt Instrumentalna farmacevtska analiza 24

ksimetrija + Na - C S R R R R S S S C - Na + S R R R S S S S S R R R R S S R C - Na + LiPc (Lithium Phthalocyanine) Spojina občutljiva na kisik preko (T 2 ) Vpliv kisika na širino črte EPR širina črte v (G) 0.6 0.4 0.2 0.0 naklon = 8.9 mg / mmhg 0 25 50 75 100 125 150 Kisik (p 2 ) Ilangovan, G., Li, H., Zweier, J.L., Kuppusamy, P. J. Phys. Chem. B 104, 4047 (2000); 104, 9404 (2000); 105, 5323 (2001) 21% Kisik 0 % dziv na kisik Zrak zrak zrak N 2 N 2 0 10 20 30 40 50 60 čas (sec) Instrumentalna farmacevtska analiza 25

GSH vsebnost glutationa ph H N R N R 15 N 15 N Instrumentalna farmacevtska analiza 26

ph-občutljivi nitroksidi ph Instrumentalna farmacevtska analiza 27

ph Polarnost okolice Instrumentalna farmacevtska analiza 28

Viskoznost Anizotropija Kristal Viskozna raztopina Neviskozna raztopina Kristalinična trdna snov je rigiden material s translacijsko simetrijo na dolge razdalje (ponavljanje osnovnih celic) Paramagnetni center v trdnem materialu nima rotacijskih ali translacijskih prostostnih stopenj zato se izrazi anizotropija magnetnih interakcij Instrumentalna farmacevtska analiza 29

Dinamika v bioloških membranah rotacija vezi 10-10 s rotacijska difuzija»wobbling«10-8 s protruzija 10-9 s flip-flop 10-3 10 4 s oscilacija vezi 10-12 s lateralna difuzija 10-7 s undulacija 10-7 s 1 s Anizotropija spinskih označevalcev v bioloških membranah Gibanje amfifilne spinske probe je v lipidnem dvosloju omejeno. π orbitala nitroksida z nesparjenim e - je usmerjena v prostoru. Instrumentalna farmacevtska analiza 30

Anizotropno vs. izotropno gibanje S je ureditveni parameter c = korelacijsko rotacijski čas Izotropno gibanje c = 4 r³ / 3kT [Debye] Ureditveni parameter (S) Instrumentalna farmacevtska analiza 31

Primer spinske sonde v celični membrani N P PP 5P 7P 10P N P N 5P 12P 12C 14P N N N P P P N 7P N 10P N 12P rder parameter S 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 1 mt liposomes erytocyte MCF-7 cells N 0,40 P 14P N 0,35 4 6 8 10 12 14 Position of doxyl group Simulacija molekulske dinamike Instrumentalna farmacevtska analiza 32

EPR dozimetrija Hidroksiapatit sestavlja: ~95% mase zobnega emajla 70-75% dentina 60-70% kasti Klinični EPR spektrometri MAGNETIC FLUX LINES PATIENT SPHERE F HMGENEITY MAGNET CILS Instrumentalna farmacevtska analiza 33

EPR Posebne metode, ki temeljijo na EPR Spinske pasti (an. spin traps) DMP, 5,5-dimetilpirolin-N-oksid H 3 C H 3 C N H R. H 3 C H 3 C N. H R nitron nitroksid (ni radikal) (radikal) Instrumentalna farmacevtska analiza 34

Spinske pasti (an. spin traps) Site directed spin labeling (SDSL) Metantiosulfonatni spinski označevalec (SL) specifično reagira z SH skupino AK metionin v proteinu. SL poroča o dinamiki in svoji okolici. Instrumentalna farmacevtska analiza 35

Site directed spin labeling (SDSL) SDSL metoda je uporabna zlasti za študij (trans)membranskih proteinov, ki jih ne moremo kristalizirati ali pa so preveliki za študij z NMR. Site directed spin labeling (SDSL) Vpliv gibljivosti (zgoraj) in magnetne dipolarne interakcije na EPR spekter nitroksida (spodaj). Magnetna dipolarna interakcija med dvema radikaloma (nitroksidnima spinskima označevalcema) prispeva k širitvi črt. Tako lahko izmerimo razdaljo (r) med dvema nitroksidoma. Instrumentalna farmacevtska analiza 36

Primer: Rodopsin Aktivacija rodopsina s svetlobo: model razporeditve vijačnic rodopsina v mirujočem (modra vijačnica zgoraj) in aktiviranem stanju (rdeča vijačnica spodaj). Vsak mutant vsebuje samo en (levo) ali dva (desno) SL, zaradi preglednosti pa so prikazani vsi. ΔM s je sprememba v mobilnosti SL po aktivaciji s svetlobo. EPR Imaging Histološka slika organa in in vivo EPR slika. Presek debla Instrumentalna farmacevtska analiza 37

EPR Imaging Magnetic Resonance Insights 2008:2 43 74 Instrumentalna farmacevtska analiza 38