УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине. Горана Поганчев

Transcript

1 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Горана Поганчев Параметри оксидативног стреса и осетљивости генотипова соје у условима различитих типова вештачких инокулација са Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. МАСТЕР РАД Нови Сад, год.

2 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Кандидат: Горана Поганчев Ментор: Проф. др Вера Стојшин Параметри оксидативног стреса и осетљивости генотипова соје у условима различитих типова вештачких инокулација са Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Нови Сад, год.

3 КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА Др Вера Стојшин, редовни професор, - Ментор Ужа научна област: Фитопатологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Ференц Баги, ванредни професор, - члан Ужа научна област: Фитопатологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Ђорђе Маленчић, редовни професор, - председник комисије Ужа научна област: Хемија и биохемија Пољопривредни факултет, Нови Сад

4 САДРЖАЈ Резиме... 1 SUMMARY... 3 Преглед фотографија... 5 Преглед употребљиваних скраћеница... 5 Преглед табела... 6 Преглед графикона... 7 Увод... 8 Задатак и циљ Преглед литературе Macrophomina phaseolina, проузроковач угљенасте трулежи соје Мере заштите Отпорност биљака на M. phaseolina Оксидативни стрес МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ Фитопатолошке методе Инокулација семена соје на PDA подлози Инокулација семена соје на филтер хартији Провера патогености инокулацијом супстрата Биохемијске анализе Одређивање интензитета липидне пероксидације NBT- нитроблу тетразолијум тест Одређивање активности фенилаланин амонијум-лиазе Одређивање садржаја укупних танина Одређивање садржаја кондензованих танина (проантоцијанидина) Статистичка обрада података РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје Инокулација семена соје на PDA подлози Инокулација семена соје на филтер хартији Провера патогености инокулацијом супстрата... 31

5 Биохемијске анализе Липидна пероксидација NBT нитроблу тетразолијум тест Фенилаланин амонијум лиаза Феноли Танини Проантоцијанидини Закључак Литература... 50

6 Параметри оксидативног стреса и осетљивости генотипова соје у условима различитих типова вештачких инокулација са Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Резиме Употребом различитих метода инокулације проврена је патогенсот изолата и тестирана осетљивост генотипова према изолатима различитог порекла према Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidonich. проузроковачу угљенасте трулежи корена и стабла биљака. Резултати инокулације семена соје на PDA подлози су показали код генотипа Мели да је највишу патогеност испољио изолат ŠR 62/4, док је код генотипа Балкан највећу патогеност показао је изолат MphSo. Oстали су показали значајно нижу патогеност. Резултати инокулације семена соје на филтер хартији су показали да је изолат ŠR 62/4 код оба генотипа испољио највишу патогеност. АUDPC вредности су показале да је најбрже пропадање семена проузроковано изолатима ŠR 62/4 и ŠR 55(3)/09, док је развој болести код семена инокулисаног изолатима MphK, MphSu и MphSo био најспорији. Резултати инокулације путем супстрата су показали да је изолат MphSu код оба геноптипа испољио највишу патогеност, без статистичке значајности у односу на MphK, док су остали изолати показали значајно нижу патогеност где је најнижу патогеност показао изолат MphSo. Утврђивање биохемијских параметара, показатеља оксидативног стреса утврђено је да највећу патогеност код генотипа на семену инокуисаном на хранљивој подлози показује изолат MphSu код генотипа Мели а код генотипа Балкан изолат MphK. На семену инокулисаном на филтер хартији у Петри посуди највећу патогеност код оба генотипа показао је изолат ŠR 55(3)/09. На семену инокулисаном путем супстрата код генотипа Мели највећу патогеност показао је изолат MphSu, а код генотипа Балкан показао изолат MphK. Кључне речи: Macrophomina phaseolina, патогеност, соја, биохемијски параметри оксидативног стреса 1

7 Примерак мастер рада је одложен у Библиотеци Пољопривредног факултета у Новом Саду. Састоји се од 62 странa, 13 табела, 7 графикона и 7 оригиналних слика. Оригинал је писан на српском језику са сажетком на српском и енглеском језику. 2

8 Parameters of oxidative stress and susceptibility of soybean genotypes inoculated with Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. using various methods of artificial inoculation SUMMARY Pathogenicity of 5 isolates of M. phaseolina was tested using two different methods on two soybean varieties (Meli and Balkan) using 3 methods of artificial inoculation. Inoculation of Balkan on PDA proved that isolate MphSo had the highest pathogenicity. In the same group, without significance in pathogenicity was ŠR 62/4. Both Meli and Balkan seed inoculation on filter paper showed that ŠR 62/4. АUDPC showed that the fastest decay of soybean seed was caused by isolates ŠR 62/4 and ŠR 55(3)/09, while the slowest disease development was on seed inoculated with MphK, MphSu and MphSo. Results of pathogenicity tests using inoculated substrate showed that MphSu and MphK proved to be the most pathogenic in both Meli and Balkan. Determination of biochemical parameters of oxidative stress included measuring: lipid peroxidation, superoxide- dismutase, phenylalanine ammonium lyase, phenols, tannins, pronaticyanidines on all of the artificially inoculated variants. In genotype Meli the highest pathogenicity on soybean seeds inoculated on PDA has shown the isolate MphSu, whereas in genotype Balkan the highest pathogenicity has been proven after inoculation with the isolate MphK. Using the second method of artificial inoculation, the highest pathogenicity in both genotypes has been proven on seed inoculated by the isolate ŠR 55(3)/09. After indirect inoculation on supstrate the highest pathogenicity in Meli genotype has showen the isolate MphSu, while the highest pathogenicity in Balkan genotype has been recorded after inoculation with the isolate MphK. Key words: Macrophomina phaseolina, pathogenicity, soybean, biochemical parameters of oxidative stress 3

9 The copy of the Master thesis is submitted into the Library of the Faculty of Agriculture in Novi Sad. It contains 62 pages, 13 tables, 7 charts and 7 original photos. The original of this thesis is written in Serbian with abstract in Serbian and English. 4

10 Преглед фотографија 1.Симптоми угљенасте трулежи корена и стабла на биљкама соје 2. а и б: Постављање огледа провере патогености изолата Macrophomina phaseolina на семену соје на PDA подлози 3. Семе соје које је коришћено при оцени некрозе семена (с лева на десно (0 здраво, клијало семе до 4 угљенаста некроза семена неклијало) 4. а и б: Постављање огледа провере патогености на семену соје изолатима Macrophomina phaseolina на филтер хартији 5. Инокулисано семе сирка 6. а, б, ц и д: Постављање огледа провере патогености изолата Macrophomina phaseolina инокулацијом супстрата 7. Припрема инокулисаних биљака и контроле за очитавање биохемијских параметара Преглед употребљиваних скраћеница HR хиперсензитивни одговор. (eнгл. Hypersensitive Response) SAR системско стицање отпорности (eнгл. Systemic Acquired Resistance) PDA кромпир декстрозни агар (Potato Dextrose Agar) WA водени агар ( Water Agar) HTC култура врха хифе (Hyphal Tip Culture) MDA малондиалдехид LP липиднa пероксидација TBA тиобарбитурна киселина thiobarbituric acid TCA трихлорсирћетна trichloroacetic acid NBT нитроблутетразолијум хлорид см сува маса биљног материјала 5

11 свм свежа маса биљног материјала PAL фенилаланин амонијум-лиаза PVPP поливинилполипиролидон Преглед табела 1. Преглед слободних радикала 2. Подаци о испитиваним изолатима 3. Скала за оцену некрозе семена соје 4. Скала за оцену некрозе семена соје на филтер хартији 5. Скала за оцену некрозе у огледу са инокулацијом супстрата 6. Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје на хранљивој подлози 7. Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје у стерилном песку са инокулумом на семену сирка на генотиповима Балкан и Мели 8. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од садржаја nmol MDA еквивалената g-1 свм код генотипова Мели и Балкан 9. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од способности екстракта да неутралише супероксид-анјон код генотипова Мели и Балкан инокулианих различитим методама вештачке инокулације 10. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од активности PAL изражене у U по граму свежег биљног материјала (U g-1 свм). код генотипова Мели и Балкан 11. Упоредни приказ патогености изолата на генотиповима Мели и Балкан у зависности од примењене методе вештачке инокулације 6

12 12. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од садржаја танина код генотипова мели и Балкан инокулисаних разичитим методама вештачке инокулације 13. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од садржаја проантоцијанидина код генотипова мели и Балкан инокулисаних разичитим методама вештачке инокулације Преглед графикона 1. Некроза семена соје у периоду од 5 дана по инокулацији 2. Упоредни приказ активности LP у зависности од употребљене методе вештачке инокулације и кориштеног изолата 3. Упоредни приказ активности НБТ у зависности од употребљене методе вештачке инокулације и кориштеног изолата 4. Упоредни графички приказ активности ензима PAL код генотипова Мели и Балкан изражен у у U по граму свежег биљног материјала (U g -1 свм) 5. Упоредни графички приказ садржаја фенола код генотипова Мели и Балкан изражен у у mg GA g-1 сувог биљног материјала у зависности од употребљене методе вештачке инокулације 6. Упоредни графички приказ садржаја танина у mg GA g -1 сувог биљног материјала у зависности од употребљене методе вештачке инокулације 7. Упоредни графички приказ садржаја проантоцијанидина изражен у у mg GA g -1 сувог биљног материјала у зависности од употребљене методе вештачке инокулације 7

13 Увод Соја (Glycine max (L.) Merr.) је једногодишња врста из породице Fabaceae и рода Glycine. Сматра се да је постала од дивље соје Glycine usuruensis. Соја је веома стара гајена биљна врста, пореклом са далеког Истока. У Кини је гајена још пре 5000 година а одатле се проширила у друге земље источне и југоисточне Азије (Кореју, Јапан, Вијетнам, Индонезију, Индију). За остале делове света је релативно млада гајена биљна врста, која у Европи почиње да се гаји у 19. веку (Тодоровић и Комљеновић, 2003). Трогодишњи просек површина под сојом у периоду године у Републици Србији износио је ha са просечним приносом од 2,3 t/ha (Статистички годишњак Србије, 2014). Индустријски значај соје огледа се у најважнијим компонентама састава зрна које је богато протеинима и уљима (Видић и сар., 2008). Хемијски саства зрна од око 40% протеина чини велик удео хранљивих материја семена. Поред тога, са око 20% уља, семе соје садржи свеукупно више од 60% хранљивих материја употребљивих у разне сврхе. Због могућности употребе целог зрна, као и уља и протеина посебно, соја налази велику примену не само у прехрамбеној, него и у другим гранама индустрије, као што су аутомобилска, индустрија авиона, фармацеутска (Хрустић и сар., 1998; Тодоровић и Комљеновић, 2003). Са аспекта пољопривреде соја налази употребу за исхрану стоке (сојина погача, сојино брашно, за силажу, сено и сојино зелено брашно). Соја је веома значајна биљка и са становишта агротехнике. Цењена је као предусев свим усевима, јер својим развијеним и разгранатим кореном побољшава структуру земљишта. Поред тога квржице на корену соје представљају станиште за бактерије које фиксирају азот из ваздуха, смањујући тако потребу за коришћењем азотних ђубрива (Хрустић и сар., 1998). Болести соје могу у значајној мери утицати на висину и стабилност приноса ове индустријске биљке. Понекад, у случају да дође до појаве епифитоција, поједини проузроковачи болести доводе у питање рентабилност гајења соје. Познат је велики број фитопатогених микроорганизама, патогена соје, који проузрокују различите болести. У свету је описано више од 100 патогена соје, а сматра се да око 35 могу проузроковати оштећења изнад економског прага штетности. Према подацима Sinclair-a и Backman-a 8

14 (1989) у години болести у свету су смањиле принос соје за 10.3 милиона тона. Најбројније и најштетније су микозе, а затим бактериозе и вирозе. Једна од економски најзначајнијих паразита соје је фитопатогена гљива Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., проузроковач угљенасте трулежи корена и стабла соје и других биљака (Smith и Wyllie, 1999; Видић и сар., 2008). 9

15 Задатак и циљ Задатак овог мастер рада је: 1. Испитивање реакција генотипова соје на Macrophomina phaseolina 2. Испитивање патогености изолата Macrophomina phaseolina на семену и биљкама соје 3. Одређивање биохемијских параметара оксидативног стреса у инокулисаним биљкама Циљ овог мастер рада је: 1. Испитивање међузависности параметара оксидативног стреса као показатеља патогености изолата и визуелних оцена 3 методе провере патогености на испитиваним генотиповима 2. Оптимизација метода провере патогености са Macrophomina phaseolina на семену и биљкама соје 10

16 Преглед литературе Macrophomina phaseolina, проузроковач угљенасте трулежи соје Macrophomina phaseolina је први пут запажена и описана године у САД, а затим се проширила у већини земаља Јужне Америке, Азије, Африке, Европе и Аустралије (Sinclair и Dhingra, 1975). На соји у Србији описана је почетком шездесетих година прошлог века (Аћимовић, 1963) и од тада се редовно јавља у слабијем или јачем интензитету (Јаснић и Видић, 1985; Тошић и сар., 1986). M. phaseolina напада биљке од ницања па све до завршетка вегетације. Смањење приноса соје зависи од броја оболелих биљака и од фазе развоја у којој се биљка налазила кад је остварена инфекција. Уколико је на парцели већи број оболелих биљака инфицираних пре цветања, онда је свака оболела биљка изгубљена за производњу. Сходно томе, број оболелих биљака по правилу једнак проценту смањења приноса. Биљке које су инфициране у фази формирања махуна или у фази наливања зрна, дају мањи принос за 30-50%. Висина смањења приноса, такође зависи и од климатског подручја и типа земљишта на коме се соја гаји. У топлијим регионима гајења и на лакшим типовима земљишта смањење приноса код оболелих биљака је веће, него у зонама са умереном климом и на тежим и структуралним типовима земљишта (Аћимовић, 1988). У умереном климату угљенаста трулеж обично се уочава у генеративној фази развоја соје, нарочито на биљкама ослабљеним сушом. У сушним годинама овим обољењем у Србији бива заражено 40 до 50% биљака соје, услед чега је принос умањен за 20 до 25% (Аћимовић, 1988). Истраживања Wrather и сар. (2008) такође указују да код биљака ослабљених сушом долази до јачег интензитета напада. Инфекција утиче на принос првенствено смањењем броја махуна и броја зрна по биљци, док је утицај на крупноћу зрна слабији. M. phaseolina је полифагна и паразитира преко 500 биљних врста, укључујући бројне ратарске и повртарске усеве: сунцокрет, соју, уљану репицу, шећерну репу, кукуруз, сирак, памук, дуван, пасуљ, грашак, паприку, кромпир, лук, купус и др., као и многе коровске врсте (Yang и Navi, 2005; Балаж и сар., 2010). 11

17 M. phaseolina спада у групу факултативних, полифагних и термофилних паразита (Аћимовић, 1988). Таксономски припада збирној групи Deuteromycota (Ивановић и Ивановић, 2001). На нападнутим биљкама и у чистој култури гљива у свом развојном циклусу ствара мицелију: септирану, хијалну и црна телашца микросклероције. Неки изолати, са појединих култура, могу створити и пикниде. Међутим, стварање пикнида је врло ретка појава (Luttrell, 1947, loc. cit., Аћимовић, 1988, Ashworth, 1959; Chidambaram и Mathur, 1975). Угљенаста трулеж је обољење корена и приземног дела стабла, али симптоми се могу јавити и на клијанцима. Уколико дође до инфекције клијанаца на хипокотилу се прво уочавају црвенкастосмеђе пеге, које се затим шире и постају тамносмеђе до црне (Слика 1). У условима топлог и сувог времена клијанци се суше и угињавају. Супротно томе, ако након остварене инфекције наступи влажан и прохладан период, они преживе, али остају латентно заражени. Латентно заражени клијанци настављају са порастом, али до испољавања симптома долази касније, када наступи дужи сушни период, праћен високом температуром (Видић и сар., 2008). (Ориг.) Слика 1. Симптоми угљенасте трулежи корена и стабла на младим биљкама соје 12

18 У нашим агроеколошким условима угљенаста трулеж соје се најчешће јавља у другом делу вегетације када инфекција настаје на корену. Најпре се уочавају светлосмеђе пеге, које временом захватају цео коренов систем. Након тога долази до ширења симптома на приземни део стабла, бочне гране, а у повољним условима захватају већи део биљке. Површинско ткиво корена и стабла постаје светлосиво, а испод епидермиса се стварају многобројне, црне микросклероције. У унутрашњости ткива такође долази до формирања микросклероција. Као последица присуства микросклероција у спроводним судовима и некрозе кореновог система, листови на болесним биљкама жуте и вену. Увели листови не опадају одмах, већ остају да висе, што представља јасан симптом распознавања болесних биљака на парцели. На оболелим деловима стабла епидермис се лако одваја и уздужно цепа на узане траке, што представља поуздан знак да је биљка оболела од проузроковача угљенасте трулежи (Видић и сар., 2008). Гљива се у неповољним условима одржава у зараженим биљним остацима, у земљишту и у семену соје. У лакшим, песковитим земљиштима која се брзо исушују, микросклероције остају виталне више година, док у влажним условима труле после неколико месеци (Видић и сар., 2008). Механизам инфекције биљака соје детаљно су проучили Ammon и сар. (1974). Према овим ауторима микросклероције у земљишту клијају дајући више иницијалних хифа. Када дођу у контакт са кореном соје, иницијалне хифе формирају апресорију са инфекционом хифом помоћу које гљива продре у корен директно кроз кутикулу, или кроз природне отворе. Мицелија се затим развија интерцелуларно, а услед деловања ензима и токсина које лучи, настаје некроза околних ћелија. Стварање микросклероција је поуздан знак да је захваћено ткиво мртво. Мицелија продире и у ксилем, где се такође формирају микросклероције што доводи до постепене трулежи кореновог система и запушавања спроводних судова микросклероцијама, док оболеле биљке почињу да вену. Заражено семе соје има слабију клијавост и енергију клијања. Након сетве семе соје или не клија, или клијанци брзо угињавају, што је нарочито изражено у регионима са високом температуром у време сетве (Видић и сар., 2008). 13

19 Мере заштите С обзиром на то да Macrophomina phaseolina у јачем интензитету напада биљке слабије виталности, опасност од остваривања инфекције може се знатно смањити уколико се усев соје током вегетационог периода развија у оптималним условима. Да би се то остварило потребна је правилна и благовремена примена свих агротехничких мера, које се препоручују у технологији гајења соје. То пре свега подразумева сетву здравог семена претходно дезинфикованог фунгицидом у оптималном року. Интензитет болести смањује се при сетви у оптималном року и у оптималном склопу, са избалансираном минералном исхраном и са поштовањем плодореда. Наводњавање усева у сушном периоду је најефикаснија мера у сузбијању угљенасте трулежи јер је гљиви за развој погодује суво земљиште (Марић и Јевтић, 2005). Поједини агротехнички фактори знатно доприносе јачем интензитету појаве угљенасте трулежи корена. Превелика густина усева у сушнијим и топлијим годинама повећава интензитет заразе. Такође, старије биљке су знатно осетљивије на напад овог паразита (Iliyas и Sinclair, 1974). Резултати истраживања Видића и сар. (1994) указују да је појава угљенасте трулежи интезивнија при раној сетви и код раностаснијих генотипова, док су генотипови дуге вегетације отпорнији према болести (Ивановић и Ивановић, 2001). Отпорност биљака на M. phaseolina Са аспекта оплемењивања, одговор биљке на инокулацију патогеном може бити двојак. С једне стране, изолат којим је биљка инокулисана може да проузоркује појаву симптома обољења, односно сматра се да је биљка у том случају подложна инфекцији. С друге стране, биљка може да не испољи никакве симптоме наокон инокулације, те се у овом случају биљка сматра отпорном на патогена. У пракси се, такође, користи и термин толерантан, који подразумева да биљка испољава симптоме након инфекције патогеном, али да, без обзира на то остварује задовољавајућ принос. Ипак, на нивоу ћелија, способност биљке да се одупре патогену може се мерити на различите начине. Биљка може утицати на инхибирање клијања и пенетрације, успоравања развоја колонија, разлагања апресорије којом је гљива пробила биљно ткиво, али и специфичним унутарћелијским механизмима који имају за циљ да неутралишу патогена. 14

20 Током свог животног циклуса, биљке морају реаговати на различите утицаје који долазе из спољне средине, због чега су развиле широк распон одбрамбених стратегија (Van Breusegem и Dat, 2006). Против микроорганизама постоји посебан софистицирани систем који биљкама омогућује уочавање хемијских сигнала потенцијалних патогена, као и њихово превођење у прикладне биохемијске одговоре. Биљке поседују физичке баријере као што су кутикула и ћелијски зид, али и бројне молекуларне механизме за успешно сузбијање напада патогена (De Gara и сар, 2003). Након инфекције покреће се сигнални механизам који доводи до промена у метаболизму заражене биљке и напослетку успорава ширење патогена (De Gara и сар, 2003; Bindschedler и сар, 2006; Davies и сар, 2006; Zaninotto и сар, 2006; Choi и сар, 2007). Биљке препознају и супротстављају се нападу многих патогена индукујући хиперсензитивну реакцију - брз одбрамбени одговор, који резултира брзом локализованом некрозом ћелија и ткива на месту инфекције. На овај начин се паразит ускраћује за хранљиве састојке и тиме се спречава ширење инфекције (Bonnet и сар., 1995). Међутим, хиперсензитивни одговор не пружа заштиту биљци од M. phaseolina јер је гљива некротрофна и стварање некрозе око места инфекције не спречава даље ширење инфекције. Одбрана биљке може бити активна и пасивна. У пасивну одбрану спадају баријере које патоген мора да прође како би остварио продор у биљку. Тако, пасивну одбрану чине физичка и хемијска одбрана. Физичке баријере могу бити од великог значаја, толико да у неким случајевима потпуно спречавају продор патогена. Улога кутина је детаљно проучавана и утврђено је да постоји разлика у врсти ензима и деградирајућој моћи ензима који користе сапрофитне гљиве од оног који користе фитопатогене. Кутикула, дебљина ћелијског зида, распоред број и величина стома и лентицела могу утицати на отпорност. Надаље, улогу физичке баријере могу имати и склеренхимско ткиво, ксилем и флоем, што се може уочити посматрањем листова где се некроза јавља само у простору између лисних нерава и условљена је њиховм мрежом. Осим тога, глатка површина листа може допринети лакшем спирању и одношењу зооспора, што такође умањује могућност инфекције (Guest и Brown, 1997). 15

21 Хемијска одбрана такође се заснива на карактеристикама биљке домаћина. Сопственим ексудатима на површини тела или деловима ћелија биљке могу утицати на способност патогена да изврши инфекцију. С друге стране, утврђено је постојање фитоантиципина, супстанци коју свака врста природно лучи на своју површину, у ризосферу или до њиховог накупљања долази у вакуолама и мртвим ћелијама. Специјалну врсту једињења чине и дефензини, различите врсте протеина које биљка лучи приликом развоја, или након оштећења, а који имају утицаја на спречавање напада патогена. Оксидативни стрес Оксидативни стрес, односно неуравнотеженост имеђу антиоксиданаса и прооксиданаса која омета ћелијску функцију, представља одбрамбену стратегију биљке. До оксидативног стреса долази када у ћелијама дође до прекомерног стварања слободних радикала насталих као одговор биљке на неке спољашње утицаје (Wojtaszek, 1997). реактивне кисеоничне облике (РОС-Reactive Oxygen Species), приказаних у Табели 1., који су у стању да реагују са основним ћелијским биомолекулима и структурама и да изазову њихову инактивацију (Halliwell и Gutteridge, 1985, Мимица-Дукић, 1997) Табела 1. Приказ слободних радикала Слободни радикал Не-радикалски облици - супероксид ањон радикал О 2 Синглет О 2 хидропероксил радикал НОО - Органски пероксиди RООН хидроксил радикал НО - Водоник пероксид Н 2 О 2 алкил и алкоксил радикали R, RО - пероксил радикал RОО - Shigeoka и сарадници (2002) такође истичу како је смањење каталитичке активности биљног антиоксидативног система један од разлога за појаву оксидативног стреса код биљака. У биљкама, радикали настају као нуспродукти раличитих метаболичких путева и локализовани су у различитим ћелијским органелама (Ceron-Garcia и сар, 2012). 16

22 Све врсте реактивних радикала врсте могу реаговати са биомолекулима присутним у ћелијским структурама. Неке од ових интеракција играју важну улогу у преносу сигнала или представљају део механизма имуног система, док друге доводе до патолошких промена као што су: оштећења ћелијских делова инактивацију протеина и мутацију ДНК ( (Ganong, 1996; Groves, 1999; Mendoza, 2011). Alscher и сар, (2002) истичу како се елиминација слободних радикала, одвија помоћу различитих компонената ензимског или неензимског одбрамбеног система биљке. Антиоксидантни систем се састоји од бројних ензима присутних у различитим изоензимским облицима у различитиморганелама, али и неензимских компоненти као што су фенолна једињења, каротеноиди, глутатион и др. Деловање антиоксидантног система биљке и његов значај за процес фотосинтезе описао је Dalton (1995) који је навео најзначајније параметре, показатеље промена у биљном организму. Ови параметри постали су стандард за испитивање антиоксидантног система биљке, те тако и новија испитивања биљне реакције на присуство вируса укључују одређивање фенолних компоненти, фенилаланин амонијум лиазе, супероксид дисмутазе, малонил алдехида (Siddique и сар., 2014). Фенолне компоненте широко су проучаване због свох антимикробног дејства (Friend, 1979; Aziz и сар., 1997; Dillon и Charnley, 1995; Waniska, 2000; Parsaeimehr и сар., 2010) а у Србији Маленчић и сарадници на инфицираној соји (Маленчић и сар., 2003;2007; 2010). Утвређено је да је утицај ензима пероксидаза такође значајан, те да је код отпорнијих сорти активност ензима израженија (Flott и сар., 1989; Kirstensen и сар., 1999; Ramanathan и сар., 2001). 17

23 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ Фитопатолошке методе За проверу патогености коришћена су два изолата пореклом са шећерне репе и три изолата по један са сунцокрета, кукуруза и соје, чије су морфолошке, одгајивачке и патогене особине испитивали Стојшин и сар. (2012). Изолати пореклом са шећерне репе су међу најпатогенијим из фитопатолошке колекције Департмана за фитомедицину Пољопривредног факултета из Новог Сада, док су изолати са сунцокрета, соје и кукуруза, добијени са Института за ратарство и повртарство, Нови Сад. Подаци о испитиваним изолатима дати су у Табели 2. Табела 2. Приказ изолата кориштених у истраживању и локалитета њиховог порекла Редни број изолата Шифра изолата Домаћин Локалитет 1 MphK Кукуруз Институт за ратарство и повртарство Нови Сад 2 MphSo Соја Институт за ратарство и повртарство Нови Сад 3 MphSu Сунцокрет Институт за ратарство и повртарство Нови Сад 4 ŠR 62/4 Шећерна репа Eчка 5 ŠR 55(3)/09 Шећерна репа Лепушница 18

24 Провера патогености је вршена са 5 изолата M. phaseolina применом 3 методе вештачке инокулације на два генотипа соје: Мели и Балкан. Рађене су следеће методе вештачке инокулације: Метода 1 се заснива на постављању семена соје у Петри кутије на хранљиву подлогу са мицелијом и микросклероцијама одабраних изолата M. phaseolina. Метода 2 обухвата вештачку инокулацију семена соје са изолатима M. phaseolina у Петри кутијама са филтер хартијом. Метода 3 се састоји од вештачке инокулације супстрата у који ће се посејати соја. Инокулација семена соје на PDA подлози Овај метод инокулације се заснива на постављању семена соје у Петри кутије на хранљиву подлогу са мицелијом и микросклероцијама одабраних изолата M. phaseolina. У Петри кутије пречника 150 мм разливено је по 80 мл PDA подлоге. Засејано је по пет фрагмената гљиве. Петри кутије су инкубиране у клима комори на температури од 30 C. Када је гљива потпуно испунила Петри кутије и образовала микросклероције (четвртог дана) на подлогу је постављено семе соје (15 семена/пк) које је претходно површински стерилисано са 0,4% NaOCl (натријум-хипохлорит). Код негативне контроле, површински стерилисано семе је постављено на хранљиву подлогу без гљиве. а б Слика 2. (а и б). Постављање огледа провере патогености изолата Macrophomina phaseolina на семену соје на PDA подлози 19

25 Оцена некрозе семена соје је вршена четвртог дана након инокулације када су се на преко 60% семена јевили симптоми некрозе. За оцену интензитета патогености испитиваних изолата коришћена је скала од 0 (здраво, клијало семе) до 4 (угљенаста некроза семена неклијало), која је приказана у Табели 3 и Слици 3. Табела 3. Скала за оцену некрозе семена соје ОЦЕНА ОПИС ОЦЕНЕ 0 Здраво, клијало семе 1 Некроза врха клице 2 Непотпуна некроза клице 3 Угљенаста некроза семена уз некрозу клице 4 Угљенаста некроза семена неклијало Слика 3. Скала за оцену некрозе семена (с лева на десно: 0 здраво, клијало семе до 4 угљенаста некроза семена - неклијало) - фото Јовановић Инокулација семена соје на филтер хартији Ова метода обухвата вештачку инокулацију семена соје са изолатима M. phaseolina у Петри кутијама са филтер хартијом. Прво је припремљена суспензија од испитиваних изолата M. phaseolina. У припремљену суспензију познате концентрације 0,9 x 10⁴ микросклероција/мл је потопљено семе соје током 24 h. За контролу смо користили дезинфиковано семе соје. 20

26 Након тога семе соје је постављено у Петри кутије и преливено са по 10 мл суспензије сваког испитиваног изолата, а код контроле са по 10 мл стерилне воде. Све Петри кутије су инкубиране у клима комори на температури од 30 C. а б Слика 4. (а и б). Постављање огледа провере патогености на семену соје изолатима Macrophomina phaseolina на филтер хартији Оцена патогености је вршена другог, трећег, четвртог и петог дана након постављања огледа. За оцену интензитета патогености испитиваних изолата коришћена је скала од 0 (здраво семе) до 5 (неклијало, некроза семена), која је приказана у Табели 4. Табела 4. Скала за оцену некрозе семена соје на филтер хартији ОЦЕНА ОПИС ОЦЕНЕ 0 Здраво семе 1 Здраво семе, некроза клице до 1/3 2 Здраво семе, некроза клице до 1/2 3 Здраво семе, некроза целе клицe 4 Клијало, потпуна некроза семена и клице 5 Неклијало, некроза семена 21

27 Провера патогености инокулацијом супстрата Код ове методе као инокулум коришћено је семе сирка зрнаша заражено са испитиваним изолатима M. phaseolina. Припрема инокулума је извршена по методи Оmar и сар. (2007) на следећи начин: 3 кг семена сирка зрнаша је распоређено у 15 тегли (200 гр/ тегли), затим је у сваку теглу додато по 160 мл дестиловане воде (40 мл воде на 50 гр семена), промешано и остављено да стоји 24 часа. Након тога, семе сирка је промешано и аутоклавирано (120 C, 1.2 bara) и након хлађења, приступило се инокулацији тако што се на површину семена постављају фрагменти подлоге са 4 дана старом мицелијом. Семе је инкубирано у клима комори на температуру од 30 C у трајању од 3 недеље, односно док мицелија није у потпуности прожела семе (Слика 5). Слика 5. Инокулисано семе сирка фото Јовановић У саксије се прво постављао слој стерилног шљунка, након тога слој хомогено измешаног стерилног песка и инокулума (700 гр песка гр инокулума/саксији). У тако припремљене саксије посејано је семе соје (5 семена/саксији) које је претходно површински стерилисано са 0,4% NаOCl (натријум-хипохлорит). Истовремено је постављена и негативна контрола код које је површински стерилисано семе посејано у 22

28 стерилни песак. Све саксије су држане у Ботаничкој башти Пољопривредног факултета у Новом Саду, уз свакодневно заливање, а појава симптома је праћена током 14 дана. а б ц д Слика 6. (а, б, ц и д). Постављање огледа провере патогености изолата Macrophomina phaseolina инокулацијом супстрата За оцену интензитета патогености испитиваних изолата коришћена је скала од 0 (здраве биљке) до 5 (неклијало семе некроза) која је приказана у Табели 5. 23

29 Табела 5. Скала за оцену некрозе у огледу са инокулацијом супстрата ОЦЕНА ОПИС ОЦЕНЕ 0 Здраве биљке 1 Биљке са некрозом хипокотила - * 2 Биљке са некрозом хипокотила - ** 3 Биљке са некрозом хипокотила - *** 4 Клијало семе (некроза семена и клице) и деформисане биљке 5 Неклијало семе некроза Легенда: * - слаба некроза; ** - умерена некроза; *** - јака некроза Биохемијске анализе Показатељи антиоксидантног система одређенe су спектрофотометријским методамапомоћу УВ/ВИС спектрофотометра (модел 6105, Jenway, Dunmon, УК). Екстракти свежег биљног материјала (клијанца) за биохемијске анализе добијени су хомогенизацијом 1 g свежег биљног материјала у авану уз додатак 10 ml 0.1 М KH2PO4 пуфера (ph 7). Након хомогенизације, хомогенат је квантитативно пренет у пластичну епрувету и остављен на леду. Добијени екстракти су центрифугирани на 2500 x g 15 мин. Супернатант је коришћен као узорак у даљим анализама. За одређивање укупних фенола, танина, проантоцијанидина и антиоксидантне тестове (DPPH- и NBT-тест) коришћен је лист испитиваних биљака осушен на ваздуху и самлевен у млину за кафу. Екстракти сувог биљног материјала добијени су преливањем 0.2 g самлевог узорка уз додатак 70% ацетона (1/50, w/v). 24

30 Слика 7. Припрема биљног материјала за биохемијске анализе Одређивање интензитета липидне пероксидације Садржај малондиалдехида (MDA), једног од крајњих производа разградње мембранских липида у ћелијама, користи се као мерило интензитета липидне пероксидације (LP). Интензитет LP одређује се на основу садржаја MDA екстрахованог из свежег биљног материјала помоћу смеше TBA и TCA (Madhava Rao и Sresty, 2000; Moon и Shibamoto, 2009). Садржај MDA одређен је у радним пробама у односу на слепу пробу. Реакциони медијум радне пробе чинило је 0.5 ml узорка (екстракт свежег биљног материјала) и 4.5 ml раствора за екстракцију MDA (20% TCA и 0.5 % ТBА), док је слепу пробу представљало 5 ml раствора за екстракцију MDA. Реакционе смеше су загреване 30 мин на 95 o C на воденом купатилу, охлађене и центрифугиране 10 минута на 1500 x g. Садржај MDA у добијеном супернатанту очитан је спектрофотометријски на λ=532 nm.интензитет LP изражен је бројем nmol MDA еквивалената по граму свежег биљног материјала (nmol MDA еквивалената g -1 см). 25

31 NBT- нитроблу тетразолијум тест Способност екстракта да неутралише супероксид-анјон (O2 ˉ) одређена је по методи Panda (2012) која се заснива на принципу способности инхибиције фотохемисјке редукције нитроблутетразолијум хлорида (NBT).Реакциони медијум чинило је 50 mм KH2PO4 пуфера (ph 7.8), 75 μм NBT, 13 mм L- метионин, 0.1 mм ЕDТА, 2 μм рибофлавин и 0.5 ml екстракта свежег биљног материјала (односно, H2О у слепој проби). Епрувете са реакционим смешама изложене су 15 минута флуоресцентној лампи од 18 W, а затим, након 15 минута мировања у тами, очитане су апсорбанце слепој и радним пробама на λ=560 nm. Способност екстракта да неутралише супероксид-анјон (O2ˉ) изражен је % у односу на контролу. Одређивање активности фенилаланин амонијум-лиазе Метода за одређивање активности фенилаланин амонијум-лиазе (PAL, EC ) (Gerasimova и сар., 2005) заснива се на деаминацији L-фенилаланина, при чему долази до настајања транс-циметне киселине, чија се апсорбанца детектује на λ=290 nm. Реакциони медијум радне пробе чинило је 1.5 ml 0.1 М боратног пуфера (ph 8.8), 1.5 ml 0.06 М L - фенилаланина и 100 μl узорка (екстракта свежег биљног материјала). Реакционе смеше су инкубиране 60 мин на 37 C на воденом купатилу, након чега им је додато 0.5 ml 1 М TCA, чиме је прекинута ензимска реакција. Количина настале транс-циметне киселине очитана је из стандардне криве зависности апсорбанце од познатих концентрација раствора транс-циметне киселине. Она количина ензима која је потребна да каталише настајање 1 nmol транс-циметне киселине у току 1 секунде под наведеним условима реакције дефинисан је као 1 U PAL. PAL активност је изражена у U по граму свежег биљног материјала (U g -1 свм). 26

32 Одређивање садржаја укупних фенола Количина укупних фенола одређена је по методи Folin-Ciocalteu (Makkar, 2003) која је базирана на чињеници да су фенолна једињења редукујућа средства. У епрувете је сипано 8.4 ml H2O, 0.5 ml 33% раствора Folin-Ciocalteu и 0.1 ml ацетонског екстракта (осим у слепу пробу). Раствори су промућкани и остављени 3-6 мин, затим је додат 1 ml 20% Na2CО3. Након 60 минута, очитана апсорбанца на λ=720 nm. Израчунавање следи из калибрационе криве зависности апсорбанце и стандарда галне киселине различитих концентрација. Резултати су изражени у mg еквивалената галне киселине (gallic acid-ga) по граму суве масе биљног материјала (mg GA g -1 см). Одређивање садржаја укупних танина За одређивање количине танина у узорцима примењена је метода за одређивање укупних фенола (Makkar, 2003), с тим што је као узорак коришћен супернатант добијен центрифугирањем (1960 x g 10 min) реакционе смеше коју је чинило 0.1 g поливинилполипиролидона (PVPP), 1 ml H2O и 1 ml ацетонског екстракта сувог биљног материјала. PVPP везује танине, чиме долази до њиховог таложења, па се заправо одређује садржај простих нетанинских фенола у супернатанту, а садржај танина у узорку добија се из разлике садржаја укупних фенола и садржаја нетанинских фенола. Резултати су изражени у mg еквивалената галне киселине по граму суве масе биљног материјала (mg GA g -1 см). Одређивање садржаја кондензованих танина (проантоцијанидина) Одређивање садржаја кондензованих танина заснива се на оксидативној деполимеризацији кондензованих танина са бутанол-hcl реагенсом (Makkar, 2003). Реакциону смешу слепе и радне пробе чине 3 ml бутанол-hcl реагенса (95/5, v/v), 0.1 ml 27

33 фери реагенса (2% фери-амонијум сулфат у 2М HCl) и 0.5 ml ацетонског екстракта сувог биљног материјала (по потреби разблаженог са 70% ацетоном или са бутанол-hcl реагенсом). Епрувете су након мешања покривене стакленим кликерима и стављене на кључало водено купатило 60 мин (осим епрувете слепе пробе које нису загреване). Након хлађења, апсорбанце су очитане на λ=550 nm. Израчунавање следи из калибрационе криве зависности апсорбанце и различитих концентрација стандарда леукоантоцијанидина.количина проантоцијанидина изражена је у mg леукоантоцијанидина по граму суве масе биљног материјала (mg леукоантоцијанидина g -1 см). Статистичка обрада података Добијене вредности фитопатолошких и биохемијских испитивања анализиране су методом анализе варијансе, док је постојање значајности између изолата утврђено Данкановим вишеструким тестом интервала на нивоу значајности од 5 %, коришћењем програма Statistica 11. Поред овог, резултати о пропадању биљака су обрађени методом AUDPC (Area Under Disease Protection Curve) премаwolf и Veerret (2002). AUDPC омогућава изражавање интензитета пропадања биљака у току одређеног времена након инокулације. 28

34 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје Инокулација семена соје на PDA подлози Резултати провере патогености испитиваних изолата Macrophomina phaseolina на семену соје на хранљивој подлози су приказани у Табели 6. Табела 6. Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје на хранљивој подлози МЕЛИ БАЛКАН Редни Изолати број Ниво Ниво Патогеност Патогеност значајности* значајности* 1 Контрола 0.00 c 0.00 c 2 МphK 1.52 f 2.13 ab 3 MphSu 1.83 a 2.18 b 4 MphSo 2.31 b 3.03 e 5 ŠR 62/ d 2.91 de 6 ŠR55(3)/ a 2.04 ab * Вредности које не садрже исто слово немају исту значајност p<0.05 Код обе сорте сви испитивани изолати су испољили значајно виши интензитет обољења у односу на неинокулисану контролу (Табела 6). Сорта Балкан је у просеку показала већу осетљивост од сорте Мели. Код сорте Мели највишу патогеност је испољио изолат ŠR 62/4 (2.64), а код сорте Балкан MphSo (3.03) и ŠR 62/4 (2.91). Остали изолати су показали статистички значајно нижу патогеност. 29

35 Инокулација семена соје на филтер хартији Подаци су рачунати на основу свакодневних очитавања током петодневног периода. AUDPC вредности су показале разлике између испитиваних изолата, када је у питању интензитет пропадања биљака (Графикон 1). Графикон 1. Некроза семена соје у периоду од 5 дана по инокулацији Најбржа некроза семена код оба генотипа соје била је проузрокована изолатима ŠR 62/4 и ŠR 55(3)/09, док је развој болести код семена инокулисаног изолатима MphK, MphSu и MphSo био најспорији. На основу ових AUDPC вредности, такође видимо да су изолати ŠR 62/4, ŠR 55(3)/09, MphSu и MphSo показали већу патогеност према генотипу Балкан, док је једино изолат MphK показао већу патогеност према генотипу соје Мели. 30

36 Провера патогености инокулацијом супстрата У овој методи, симптоми који су се јавили на семену и никлим биљкама соје су оцењивани четрнаестог дана након инокулације (Табела 12). Табела 7. Патогеност изолата Macrophomina phaseolina на семену соје у стерилном песку МЕЛИ БАЛКАН Редни Изолати број Ниво Ниво Патогеност Патогеност значајности значајности 1 Контрола 0.00 c 0.00 c 2 МphK 4.80 a 4.76 a 3 MphSu 4.96 a 4.84 a 4 MphSo 3.12 d 2.00 f 5 ŠR 62/ b 2.64 d 6 ŠR55(3)/ b 3.68 be * Вредности које не садрже исто слово немају исту значајност p<0.05 Патогеност изолата је у просеку била већа код генотипа Мели (3.42) него код генотипа Балкан (2.99). Код обе сорте сви испитивани изолати су испољили значајно виши интензитет обољења у односу на контролу. Код генотипа Мели највишу патогеност је испољио изолат MphSu (4.96). Без статистичке значајности у односу на овај изолат патогеност је оцењена код изолата MphK (4.80). Остали су показали статистички значајно нижу патогеност а статистички значајно најнижу патогеност испољио је: MphSo (3.12). Слично као код претходне, код генотипа Балкан највишу патогеност су испољили изолати MphSu (4.84) и MphK (4.76), док су остали су показали значајно нижу патогеност: Статстички значајно најнижу патогеност испољио је, као и код генотипа Мели, изолат MphSo (2.00). 31

37 Биохемијске анализе Липидна пероксидација Акумулација липидних пероксида у ћелији јасан је индикатор оксидативног стреса. Они настају као последица одвајања електрона из ланаца масних киселина, компонената двоструког слоја фосфолипида ћелијске мембране што доводи до смањења флуидности и повећања пропустљивости мембране. У Табели 8. су приказане вредности очитане на спектрофотометру, док Графикон 2. представља графички приказ вредности. Интензитет LP изражен је бројем nmol MDA еквивалената по граму свежег биљног материјала (nmol МDA еквивалената g-1 свм). Табела 8. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од садржаја nmol MDA еквивалената g -1 свм МЕЛИ БАЛКАН I II III I II III контрола a 64.2 ab b a 90.2 cd ab MphK a 89.2 a c a a аb MphSu a 71.2 b ab a 82.9 cd c MphSo 87.9 a 67.2 b d 89.6 a 74.0 de b ŠR62/ a 74.0 b a 90.2 a 67.2 e a ŠR55(3)/ a 91.3 a ab 78.1 a b a Легенда: I Вештачка инокулација на хранљивој подлози II Вештачка инокулација на филтер хартији III Инокулација супстрата * Вредности које не садрже исто слово немају исту значајност p<

38 Графикон 2. Упоредни приказ активности LP у зависности од употребљене методе вештачке инокулације и кориштеног изолата 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 I II III I II III контрола MpK MphSu MphSo ŠR 62/4 ŠR 55(3)/09 МЕЛИ БАЛКАН Упоредном анализом резултата патогености и садржаја МDA (Табела 8. и Графикон 2) утврђене су разлике у реакцији генотипа на изолате, патогености изолата између себе и начина инокулације. Код генотипа Мели инокулацијом на PDA подлози највишу вредност испољио је изолат ŠR 55(3)/09 (121.0), без статистички значајне разлике у односу на друге испитиване изолате (Таб.8.) од којих је најмању патогеност испољио изолат MphSo (87.9). Код генотипа Балкан, највишу вредност липидне перокисдације одн. највиши садржај МDA показао је изолат са MphSu (130.2) без статистички занчајне разлике у односу на остале изолате, док је најнижу вредност, као и код генотипа Мели испољио изолат MphSo (89.6) Методом инокулације на филтер хартији код генотипа Мели највећа оштећења ћелијске мембране настала су у биљкама инокулисаним изолатом ŠR 55(3)/09 (91.3). Без статистички значајне разлике у односу на овај изолат патогеност је оцењена код изолата MphK (89.2), док је патогеност свих остали изолата ŠR62/4 (74.0), MphSu (71.2) и MphSo (67.2) на нижем нивоу статистичке значајности. Код генотипа Балкан највиши садржај МDA утврђен је код изолата MphK (124.5). Статистички значајно различиту патогеност испољили су сви остали изолати ŠR55(3)/09 (114.1), MphSu (82.9), MphSo (74.0) и ŠR62/4 (67.2). 33

39 Методом вештачке инокулације супстрата донијене су статистички значајно више вредности у односу на вредности очитане код претходна два начина инокулације. Код генотипа Мели највећу патогеност, статистички значајно различиту у односу на друге испитиване изолате, показао је изолат MphSo (490.9), док је најнижу патогеност показао. MphK(410.4). Код генотипа Балкан највећу патогеност показао је изолат ŠR62/4 (501.5) без статистички значајне раѕлике у односу на изолат ŠR55(3)/09 (495.9), док је најнижу патогеност, нижу од вредности липидне пероксидације у контроли (435.8) показао је изолат MphK (421.3). NBT тест НБТ тестом утврђује се укупна антиоксидантна активност екстраката. Резултати НБТ теста на клијанцима генотипова Мели и Балкан приказани су у Табели 9, док су њихови графички прикази представљени на Графикону 3. Способност екстракта да неутралише супероксид-анјон (O 2ˉ) изражен је % у односу на контролу. Табела 9. Упоредни приказ патогености изолата у зависности од способности екстракта да неутралише супероксид-анјон код генотипова Мели и Балкан инокулисаних различитим методама вештачке инокулације МЕЛИ БАЛКАН I II III I II III контрола 0 a 0 а 0 а 0 a 0 a 0 а MphK 8.62 a 9.70 c 3.98 f b b 4.23 f MphSu a c 5.39 e b c 4.65 d MphSo a b 4.44 е 11.4 b b 5.54 d ŠR62/ b d 4.15 c 0.22 b f 4.52 e ŠR55(3)/ c d 4.31 е 15.3 a c 4.84 d Легенда: I Вештачка инокулација на хранљивој подлози II Вештачка инокулација на филтер хартији III Инокулација супстрата * Вредности које не садрже исто слово немају исту значајност p<

40 Графикон 3. Упоредни приказ активности NBT код генотипова Мели и Балкан у зависности од употребљене методе вештачке инокулације и кориштеног изолата контрола MphK MphSu MphSo ŠR62/4 ŠR55(3)/09 0 I II III I II III МЕЛИ БАЛКАН Поређењем реакције сорте и вредности MDA након инокулације на PDA одређеним изолатом, утврђено је да код оба генотипа исти изолати показали су највећу (ŠR55(3)/09) и најмању патогеност (ŠR62/4). Код генотипа према патогености, надаље, без статистички знчајне разлике су изолати MphSo (12.52), MphSu (10.79), MphK (8.62), док је вредност MDA за изолат ŠR62/4 најнижа и статистички знчајно различита у односу на остале (0.612). Најмању и статистички значајно различиту од осталих изолата вредност MDA, показао је изолат ŠR62/4 (0.223). Методом инокулације на филтер хартији код генотипа Мели утврђено је да највећу патогеност показује изолат ŠR62/4 (18.729) без статистички занчајне разлике у односу на ŠR55(3)/09 (18.566). Статистички значајно нижи ниво патогености показали су изолати MphSu ( ) и MphK (9.706), док су на статистички значајно најнижу патогеност показао изолат MphSo (4.072). Код генотипа Балкан, највећу патогеност показао је исти изолат као и код сорте Мели изолат ŠR62/4, али са вредношћу значајно вишом у односу на вредност код сорте Мели (26.593). У односу на овај изолат статистичи значајно нижу патогеност показали су изолати ŠR55(3)/09 (14.571) и MphSu (13.843), међу којима нема 35

41 статистички значајне разлике. Најнижу патогеност, без статистички значајне разлике међусобно показали су изолати MphK (4.553) и MphSo (4.189). Изолат MphSo је, као и код генотипа Мели показао најнижу патогеност, али је вредност MDA виша код сорте Балкан. Испитивања патогености методом инокулације супстрата дала су значајно другачије резултате: вредности су у просеку значајно мање, а патогеност изолата другачија. Код генотипа Мели, највећу патогеност испољио је изолат MphSu (5.39), без статистички значајне разлике у односу на изолате. MphSo (4.44) и ŠR55(3)/09 (4.317), потом изолат ŠR62/4 (4.15). али и у односу на изолат који је испољио најмању патогеностизолат MphK (3.98). Код генотипа Балкан, највећу патогеност показао је изолат MphSо (5.54), а статистички значајно најнижу патогеност показао је изолат MphK (4.23). Добијени резултати подударају се са подацима које у свом истраживању наводе Маленчић и сар. (2010). Они су, наиме, утврдили пораст SOD код напада Sclerotinia sclerotiorum као одговор на стрес, као механизам којим се неутралишу слободни радикали. Ипак, као и у њиховим резултатима, овај пораст није довољан да би се ефекти потпуно неутралисали с обзиром на то да не постоји потпуна разистентност соје према M. phaseolina. Фенилаланин амонијум лиаза Фенилаланин амонијум (PAL) лиаза је ензим неопходан за синтезу фенилпропаноида у биљкама. Локализација фенилпропаноида у ћелији значајна је приликом озледа или напада патогена. Повишене вредности активности PAL у ћелијама биљака представљају један од кључних елемената отпорности (Кипровски и сар., 2014). Вредности PAL приказане су у Табели 10, а Графички су представљене на графикону 5. PAL активност је изражена у U по граму свежег биљног материјала (U g -1 свм). Слично Кипровски и сар., (2014) и нашим истраживањем утврђене су високе концентрације PAL на третманима инокулираним слабо патогеним изолатима. Ове високе вредности указују да инокулација клијанаца подстиче активност PAL код обе сорте, али да не утиче статистички значајно на антиоксидантни капацитет. 36