Eesti Põllumajandusülikool VETERINAARGENEETIKA

Transcript

1 Eesti Põllumajandusülikool VETERINAARGENEETIKA (loengukonspekt) Tartu 2005

2 Koostajad: Arvo Viltrop Ülo Pavel Haldja Viinalass

3 1 SISUKORD 1. Sissejuhatus 2 2. Geneetika pōhimōisted ja -kontseptsioonid 4 3. Molekulaarbioloogia ja rekombinant-dna tehnoloogia Geneetilised anomaaliad Üksiku geeni defektist tingitud ainevahetushaigused Multifaktoriaalsed polügeensed pärilikud haigused. Haiguse pärilik eelsoodumus Pärilike haiguste geneetiline ja väline kontroll Ontogeneetika veterinaargeneetilised aspektid ja onkogeneetika Farmakogeneetika Immunogeneetika Loomade karvavärvuse geneetika Mikroobigeneetika alused Peremehed, parasiidid ja patogeenid 141

4 2 1. SISSEJUHATUS 1.1. Veterinaargeneetika määratlus ja uurimisobjekt Veterinaargeneetika (VG) on teadus, mis hõlmab geneetika neid aspekte, mis on seotud loomade haiguste, toodangu- ja eluvõimega (Nicholas, 1988). VG uurimisobjektideks on koduloomad ja ulukid ning nendel haigusi tekitavad mikroorganismid ja parasiidid (Pavel et al., 1988). VG uurib loomade pärilikke anomaaliaid, päriliku eelsoodumusega haigusi ja sellega seoses ka päriliku eelsoodumuse rolli erinevate haiguste etioloogias. Sellest aspektist lähtuvalt võib VG-t käsitleda kui patogeneetikat e. pärilikkuse patoloogiat (Wiesner ja Willer, 1974) VG objektiks on ka: (1) loomade haigus-resistentsus ja immuunsuse geneetika, (2) loomade veterinaarne selektsioon, (3) mikroobigeneetika veterinaarsed aspektid (4) farmakogeneetika veterinaarsed aspektid (5) jne. Valdkonnad veterinaarias, kus geneetika kui teadus leiab (võib leida) rakendust: (1) Kliiniline veterinaarmeditsiin: anomaaliate (loe haiguste) päritavuse selgitamine ja pärilikke anomaaliaid põhjustavate geenide ja lookuste selgitamine, kahjulike geenide leviku uurimine ja nende elimineerimine populatsioonidest, pärilike eelsoodumuste avastamine ja eelsoodumuste päritavuse uurimine, genoteraapia- geenide siirdamine (2) Veterinaar-mikrobioloogia: mikroobide patogeensuse ja virulentsuse geneetilise määratuse ja selle muutlikkuse selgitamine, ravimresistentsete mikroobi- ja nugiliste tüvede kujunemise ja resistentsuse mehhanismide selgitamine, mikroobide genotüüpimine, molekulaar-epidemioloogia, mikroobide geneetiline modifitseerimine (insenergeneetikal baseeruvate vaktsiinide ja diagnostikumide loomine);

5 3 (3) Veterinaar-immunoloogia loomade immuunsuse ja resistentsuse geneetika uurimine; resistentsete liinide ja tõugude kujundamine e. veterinaarselektsioon, (4) Veterinaar-farmakoloogia farmakokineetiliste protsesside geneetilise determineerituse selgitamine, ravimitele reageerimise geneetilise varieeruvuse sedastamine loomapopulatsioonides, genotüübi ja indiviidi spetsiifiliste ravimite loomine (5) Ennetav (peventiiv-) e. populatsiooni-veterinaarmeditsiin pärilike anomaaliate vältimise meetodite rakendamine (geneetiline hügieen selektsioonis) produktiivloomade populatsioonide resistentsuse tõstmisele infektsioonide suhtes selektsiooni abil (tervisearetus- health breeding). Kasutatud kirjandus F. W. Nicholas, Veterinary Genetics. Clarendon Press, Oxford, 1988, 2000 Kontrollküsimused I ptk kohta 1. Veterinaargeneetika määrang, 2. Patogeneetika määrang. 3. Geneetika rakendusvaldkonnad kliinilises veterinaarmeditsiinis 4. Geneetika rakendusvaldkonnad veterinaar mikrobioloogias 5. Geneetika rakendusvaldkonnad veterinaar immunoloogias 6. Geneetika rakendusvaldkonnad veterinaar farmakoloogias 7. Veterinaargeneetika roll ennetavas veterinaarmeditsiinis.

6 4 2. GENEETIKA PÕHIMÕISTED JA -KONTSEPTSIOONID 2.1. Kromosoomid... on pärilikkuse informatsiooni kandvat ainet DNA-d sisaldavad struktuurid rakus. Elusorganismid Maal jaotatakse sõltuvalt sellest, kas kromosoom(id) paikneb(vad) rakus "vabalt" või membraaniga piiratud rakutuumas- prokarüootideks ja eukarüootideks. Näiteks bakteritel on tavaliselt ainult üks kromosoom, mis paikneb bakteriraku keskosas ja kujutab endast rõngakujulist DNA molekuli. Kõikidel hulkraksetel on aga kromosoome palju ja need asuvad raku tuumas. Eukarüootide kromosoomid erinevalt bakterikromosoomist on keeruka ehitusega ning neis sisalduv DNA on seotud proteiinidega (aluseline histoon ja happeline nn. jääkvalk). Üks kromosoom sisaldab ühte ülisuurt DNA molekuli. Interfaasse e. mittepaljuneva raku tuumas moodustavad kromosoomid pikki ja peeni niite, mida valgusmikroskoobis pole võimalik näha. Kromosoomid muutuvad valgusmikroskoobis nähtavaks paljunevates rakkudes, kuna sel puhul niitjad kromosoomid keerduvad ja omandavad suhteliselt kindla kuju. Kromosoomide kuju, suurust ja arvu hinnatakse mitoosi metafaasis (vt. joonis 2.1). Raku kromosoomide komplekti nimetatakse raku karüotüübiks. Karüotüübi kohta on kasulik meeles pidada järgmist: 1) Organismi kõik keharakud on ühesuguse karüotüübiga st. sisaldavad võrdsel hulgal ja ühesugust geneetilist informatsiooni. 2) Karüotüüp on liigispetsiifiline. Erinevate liikide karüotüübid erinevad kromosoomide arvu, kuju ja suuruse poolest. 3) Karüotüüp on liigi piires soospetsiifiline. Sama liigi eri sugu isendid erinevad ühe kromosoomipaari poolest. Imetajatel: emastel XX kromosoomipaar, isastel XY kromosoomipaar. Neid kromosoome nimetatakse sugukromosoomideks e. gonosoomideks. Kõiki ülejäänud kromosoome nimetatakse autosoomideks. Ühe liigi piires on nii emastel kui isastel ühesugune autosoomide komplekt. Organismi geneetilise informatsiooni kogumit, mis on salvestatud kromosoomides nimetatakse ka genoomiks. Kõrgemate organismide kromosoomistik on diploidne, st. igat kromosoomi on tuumas kaks üks kummaltki vanemalt. Kromosoomipaari moodustavaid kromosoome nimetatakse homoloogseteks kromosoomideks.

7 5 Joonis 2.1. Inimese kromosoomid mitoosi metafaasis Sugurakkudes on igast homoloogsete kromosoomide paarist üks kromosoom ja sellist ühekordset kromosoomiarvu nimetatakse haploidseks. Sugurakkude haploidne karüotüüp moodustub meioosis, mis on ainult sugurakkudele omane paljunemisprotsess. Vt joonis 2.3. ja 2.4.

8 Pärilikkuse biokeemia DNA molekul kromosoomis kujutab endast ülipikka nukleotiidide topeltahelat. Nukleotiidid koosnevad suhkrumolekulist (pentoos- desoksüriboos), fosforhappe jäägist ja lämmastikalusest. Lämmastikaluseid on nelja liiki: adeniin (A) guaniin (G) tsütosiin (C) tümiin (T). Sellest tulenevalt on ka nukleotiide nelja liiki. Seega erinevad nukleotiidid teineteisest vaid lämmastikaluste poolest- suhkrumolekul ja fosforhappe jääk on identsed. Nukleotiidide struktuurivalemid koos nende keemiliste nimetustega on esitatud joonisel 2.2. (Lihtsuse mõttes nimetatakse nukleotiide geneetika ja molekulaarbioloogia-alastes tekstides tihti vaid lämmastikaluse nime pidi.) Nukleotiidid on ahelas seotud teineteisega kovalentsete sidemete abil, mis moodustuvad ühe nukleotiidi desoksüriboosi viienda süsinikuga seotud (ehk 5') fosforhappe jäägi ja teise nukleotiidi desoksüriboosi kolmanda süsinikuga seotud (ehk 3') OH-rühma vahel (vt. joonis 2.2.). DNA molekuli kaks nukleotiidiahelat on omavahel seotud vesiniksidemete abil, mis moodustuvad kindlate lämmastikaluste vahel. Omavahel seonduvad adeniin-tümiin (A T) ja tsütosiin-guaniin (T G) (vt. joonis 2.2). Sellest tulenevalt on kahe nukleotiidiahela järjestused vastastiku määratud. Selle kohta öeldakse, et DNA ahelad on komplementaarsed (teineteist täiendavad). DNA ahelad on keerdunud oma telje ümber moodustades biheeliksi. DNA struktuur tingib selle, et ta on ennast taastootev molekul. Kohe kui DNA topeltahel ühest otsast hakkab lahknema, alustab üksijäänud ahel kibekähku vabade nukleotiidide liitmist enesega. Selle tulemusena moodustub kahest lahknenud üksikahelast kaks topeltahelat. Nimetatud protsessi nimetatakse DNA replikatsiooniks. DNA replikatsiooni on kaasatud mitmed ensüümid, millest tähtsamad on kaks: DNA-polümeraas, DNA-ligaas. DNA molekul on kromosoomis lisaks heeliksi kujule veel mitmekordselt kokku volditud. Raku paljunemisel volditakse DNA molekul väga tihedalt kokku, interfaasis aga pakitakse suures osas lahti.

9 Joonis 2.2. DNA struktuur 7

10 Geneetiline kood DNA molekulides talletatud geneetiline informatsioon realiseerub valgusünteesil. Valgud koosnevad aminohapetest. Erinevaid aminohappeid on 20. Seega erinevad valgud teineteisest aminohapete kombinatsioonide ja nende järjestuse poolest polüpeptiidahelates. Informatsioon, mis on vajalik teatud aminohappelise järjestusega polüpeptiidahela sünteesimiseks on salvestatud koodi kujul DNA molekulis. Selleks koodiks on aga DNA ahela teatud fragmendi nukleotiidide järjestus. Igat aminohapet kodeerib 3 nukleotiidi nukleotiidi triplett, e. koodon. Neljast nukleotiidist on võimalik moodustada 4*4*4 = 64 erinevat kombinatsiooni. Seega on koodoneid rohkem kui 20 aminohappe jaoks tarvis. Selgunud ongi, et mitu koodonit võivad kodeerida ühte ja sama aminohapet, kusjuures määravad on koodoni kaks esimest nukleotiidi. Teiseks: kolmele koodonile ei vasta mitte ükski aminohape ja nad talitlevad DNA ahelas kui peatavad koodonid (ingl. k. stop triplets), mis annavad signaali polüpeptiidahela sünteesi lõpetamiseks. Metioniini koodon seevastu talitleb kui signaal sünteesi alustamiseks. Joonisel 2.3. on toodud kõigi aminohapete koodonid. Joonis 2.3. Geneetiline kood

11 Valgusüntees Valgusüntees algab DNA ahela despiraliseerumise- ja topeltahela lahknemisega lõigu kohal, millelt kopeeritakse valgusünteesiks vajalik informatsioon. DNA üksikahel talitleb siin kui matriits uue nukleiinhappemolekuli sünteesimisel. Kuid edastamaks geneetilist infot valgusünteesiks ei sünteesita mitte komplementaarset DNA ahelat, vaid komplementaarne ribonukleiinhappe (RNA) ahel. RNA peamised erinevused DNA-st on järgmised: 1. RNA nukleotiidis on desoksüriboosi asemel riboos (struktuurivalemid on toodud võrdlevalt joonisel 2.2.), 2. RNA lämmastikalustena on kasutusel küll adeniin, guaniin, tsütosiin, kuid tümiini asemel uratsiil, 3. RNA on normaalselt üheahelaline Antud protsessi nimetatakse transkriptsiooniks ja seda katalüüsib ensüüm nimega RNApolümeraas. Järgnevalt RNA-molekul lahkneb DNA-ahelast ja liigub raku tsütoplasmas asuvatele ribosoomidele, kus valgusüntees tegelikult toimub. Kuna sisuliselt on tegemist geneetilise informatsiooni edasitoimetamisega, nimetatakse DNA-maatriksil sünteesitud RNA-d informatsiooni- RNA-ks (irna) (ingl.k. messenger RNA sõnumitooja). Seejärel aktiveeritakse vabad aminohapped rakus. Need seonduvad teist liiki RNA-ga, mida nimetatakse transpordi-rna-ks (trna). Transpordi-RNA on varustatud antikoodoniga, mis on komplementaarne irna-le DNA-lt ülekantud koodoniga. Iga aminohape seondub vaid teatud antikoodoniga varustatud trna molekuliga. Teisisõnu, iga aminohappe jaoks on olemas kindla koostisega trna. Järgneb translatsioon (ingl.k. translation- tõlge): geneetilise informatsiooni tõlkimine valgu aminohappeliseks järjestuseks. Translatsiooni käigus liituvad aminohappe molekuli kandvad trna molekulid oma antikoodonile vastava irna koodoniga. Seondumine algab irna 5'-otsast ja trna molekulid lisanduvad irna koodonite järjestusega määratud järjekorras. Seejuures, nii kui polüpeptiidside kahe aminohappe vahel on moodustunud, vabaneb varem seondunud trna molekul irna-st ja aminohappest. Vt. joonis 2.4.

12 10 Joonis 2.4. Valgusüntees 2.5. Geenid, alleelid ja lookused Eelmisest alaosast selgub, et DNA teatud lõigud kodeerivad teatud kindlaid polüpeptiide. Sellest tulenevalt võib lihtsustatult määratleda geeni kui DNA lõiku, mis koosneb ühe kindla polüpeptiidi aminohapetele vastavatest nukleotiididest. Siiski selliseid geene esineb kõrgematel loomadel äärmiselt harva. Tänapäeval on teada, et geenid koosnevad erinevatest piirkondadest e. lõikudest, millest vaid osa sisaldab informatsiooni, mida kantakse üle irna-le ja mille järgi toimub polüpeptiidide süntees.

13 11 Genoomiosi, millelt toimub informatsiooni ülekandmine irna-le, nimetatakse eksoniteks, kuna need genoomiosad on "eksponeeritud" ribosoomidel. Lisaks nimetatuile on olemas genoomiosad, milles talletunud infot irna-le üle ei kanta. Neid nimetatakse introniteks (nn. geenisisesed piirkonnad) ja nende ülesanne ei ole lõpuni selge. Teada on, et eksonid moodustavad oluliselt väiksema osa genoomist. (Vt.joonis 2.5 ) Joonis 2.5. Geeni struktuur Geene, mis kodeerivad teatud polüpeptiide, nimetatakse struktuurseteks geenideks. Seejuures polüpeptiidid võivad olla kas rakkude 'ehitusmaterjal' või ensüümid. Lisaks struktuurgeenidele eksisteerivad nn. reguleerivad geenid, mis reguleerivad struktuurgeenide transkriptsiooni. Reguleerivad geenid jaotatakse omakorda regulaatoriteks ja operaatoriteks. Regulaator "lülitab" struktuurgeeni sisse ja välja, operaator kontrollib struktuurgeenil toimuvat transkriptsiooni. Lisaks on olemas geene, mis sünteesivad transpordi- ja ribosoomi RNA-d. GEEN on funktsionaalselt piiritletud lõik DNA molekulis. Geeni asukoht kromosoomis on määratud. Geeni asukohta kromosoomis nimetatakse lookuseks. Diploidse organismi kaks homoloogset kromosoomi võivad sisaldada samas lookuses ühe geeni erinevaid variante.

14 12 Joonis 2.6. Geen kui funktsionaalne ühik Üht ja sama tunnust määravate geenide erinevaid variante nimetatakse alleelideks. Seega on alleeli mõiste seotud tunnustega. Tunnused on aga harva monogeensed- sagedamini määravad tunnuseid geenikompleksid. Sellest tulenevalt võib defineerida geeni ka kui geneetilise informatsiooni ühikut, mis muutumatult pärandub põlvkonnast põlvkonda. Seega võib ühel isendil olla maksimaalselt ühe geeni kaks alleeli. Populatsioonis võib alleelide arv olla aga kümnetes. Kui populatsioonis esineb vaid kaht liiki alleele, on tegemist dialleelsusega, kui neid on rohkem, siis polüalleelsusega. Kui isendil on kummaski homoloogses kromosoomis sama geeni kaks ühesugust alleeli, on

15 13 tegemist homosügootse isendiga, kui alleelid on erinevad- heterosügoodiga Geneetiline muutlikkus e. variatsioon Organismi muutlikkuse võib liigitada joonisel 2.7. toodud moel. PÄRILIK MITTEPÄRILIK KOMBINATIIVNE MUTATSIOONILINE ONTOGENEETILINE Joon Muutlikkuse liigid. - Ontogeneetiline muutlikkus põhineb organismi reaktsiooninormi realiseerumisel individuaalse arengu vältel. - Kombinatiivne muutlikkus põhineb geenide ümberjaotumisel meioosi protsessis. - Mutatsiooniline muutlikkus seisneb uute alleelide tekkimises DNA replikatsiooni protsessis Kombinatiivse muutlikkuse tüübid Kombinatiivse muutlikkuse aluseks on alleelide rekombinatsioon (ümberjagamine) sugurakkudes. Alleelide rekombinatsioon võib toimuda kahel teel: a) Interkromosoomne (kromosoomidevaheline) rekombinatsioon- alleelipaaride ümberjaotumine sugulisel sigimisel, mis tuleneb homoloogsete kromosoomide lahknemisest meioosis ja nende juhuslikust paardumisest isas- ja emassugurakkude ühinemisel viljastumisel. b) Intrakromosoomne (kromosoomipaari sisene) rekombinatsioon- geenide vahetus homoloogsete kromosoomide vahel nende konjugatsioonil meioosi käigus e. krossingover (Vt. joonis 2.8)

16 14 Joonis 2.8 Krossingover Mutatsioonid Hugo De Vries ( ) postuleeris, et mutatsioonid on päriliku tunnuse hüppelised muutused vastupidiselt kvantitatiivsete tunnuste (näit. seemne mass) nn. tavalisele muutlikkusele, mis seisneb tunnuse parameetri varieerumises keskväärtuse ümber. Mutatsioonide bioloogiliseks aluseks on muutused genoomis. Mutatsioonide peamiseks põhjuseks on DNA replikatsiooni käigus ettetulevad replikatsiooni vead. Rõhuv enamus replikatsiooni vigadest korrigeeritakse vastavate mehhanismide abil ja nad ei pärandu järgmistele rakkude põlvkondadele. Kui aga raku kaitsemehhanismid ei suuda replikatsiooni viga parandada, pärandub see edasi järgmistele rakupõlvkondadele. Mutatsiooniks nimetatakse organismi geneetilise struktuuri püsiva iseloomuga muutusi. DNA replikatsioonivigade tõttu tekkinud mutatsioone nimetatakse geeni e. punkt mutatsioonideks. Lisaks esineb ka kromosoomi mutatsioone, mille puhul muutub kromosoomi struktuur või nende arv. Mutatsioone klassifitseeritakse lähtuvalt tekke põhjustest, lokalisatsioonist ja nende mõjust organismile järgmiselt: A. Genoomi muutuste alusel: 1. Kromosoommutatsioonid - kromosoomide struktuuri ja/või arvu muutused. 2. Geeni- e. punktmutatsioonid geenide struktuuri muutused. B. Avaldumise alusel heterosügoodis:

17 15 1. Dominantsed mutatsioonid. 2. Retsessiivsed mutatsioonid. C. Olenevalt põhjustajatest: 1. Spontaansed mutatsioonid. 2. Indutseeritud mutatsioonid. D. Lokalisatsiooni alusel: 1. Tuumamutatsioonid. 2. Tsütoplasmaatilised mutatsioonid. E. Päritavuse alusel: 1. Generatiivsed mutatsioonid- tekivad sugurakkudes. 2. Somaatilised mutatsioonid- tekivad keharakkudes. F. Fenotüübilise avaldumise alusel: 1. Letaalsed 2. Subletaalsed 3. Morbiidsed Geenimutatsioonide tekkemehhanism Geenimutatsioonid on tavaliselt nn. punktmutatsioonid; kuid esineb ka mitut nukleotiidi hõlmavaid struktuuri muutusi. Punktmutatsioonid kujutavad endast kas DNA (RNA) nukleotiidide: asendumist, väljalangemist või lisandumist. Kromosoomi mutatsioonide tüübid Kromosoommutatsiooniks (KM) loetakse geenide ümberpaiknemist kromosoomisiseselt või kromosoomidevaheliselt või mõne geeni kromosoomist väljalangemist. KM-e on nelja tüüpi: a) deletsioonid ehk kaod: b) duplikatsioonid e. kahekordistumised c) inversioonid e. ümberpöördumised; d) translokatsioonid e. ümberpaiknemised. Kromosoommutatsiooniks on ka kromosoomide normaalse arvu muutumine, kusjuures kromosoomide sisene struktuur võib jääda muutumatuks. Kromosoomide arvu muutused jaotatakse kahte tüüpi: a) euploidsus- kromosoomide arvu suurenemine või vähenemine haploidse kromosoomiarvu võrra b) aneuploidsus- kromosoomide arvu suurenemine või vähenemine mõne kromosoomi võrra, mis ei ole võrdne haploidse kromosoomiarvuga.

18 Joonis

19 17 Spontaansed ja indutseeritud mutatsioonid Mutatsioonid võib jaotada spontaanseteks e. isetekkelisteks ja indutseerituteks e. väliskeskkonna mõjutustest tulenevateks ndatel sai selgeks, et spontaansete mutatsioonide teke on tingitud DNA replikatsiooni vigadest. Avastati geenid- mutaatorid (muudavad nii spontaansete kui ka indutseeritud mutatsioonide sagedust). Mutatsioone indutseerivateks väliskeskkonna teguriteks (mutageenideks) on a) ioniseerivad kiirgused (näit röntgenkiirgus, ultraviolettkiirgus jne.) b) mitmesugused keemilised ühendid (etüleenimiin, lämmastikusipriit, HNO 2, hüdroksüülamiin, fenoolid, aromaatsed ühendid jne). c) viirused (leukoosiviirused) Indutseeritud mutatsioonid on sageli väärarendite ja kasvajate põhjuseks. Mutatsioonide indutseerimine on geneetikas oluliseks uurimistöö meetodiks. Spontaansed mutatsioonid on üks evolutsiooni mehhanisme, kuna seeläbi tekkivad hüppelised muutused organismis võivad olla kohastumisele väga soodsad. Mutatsioonid on peamised geneetiliste anomaaliate põhjustajad Geenide pärandumine Pärandumiseks nimetatakse geenide ülekandumist vanempõlvkonnalt järglastele. Geenide pärandumine on allutatud kindlatele seaduspärasustele. Üksiku geeni pärandumine e. monogeense tunnuse päritavus Monogeensetele tunnustele on iseloomulik lihtne mendeleerumine ja nende suhtes kehtivad Mendeli I ja II seadus. Mendeli I e. ühetaolisuse seadus ütleb, et homosügootsete isendite ristumisel saadakse esimeses põlvkonnas kõik ühetaolised järglased. Mendeli II e. lahknemisseadus ütleb, et heterosügootsete isendite ristumisel toimub tunnuste lahknemine kindlates sagedussuhetes- lahknemissuhetes. (Tegelikult allub ka homosügootsete isendite järglaste jaotumine lahknemissuhetele). Lahknemissuhete tõenäosuskorrutisi. tuletamiseks monogeensete tunnuste puhul kasutatakse 2x2 tabelit või Selle põhjenduseks on asjaolu, et meioosis piltlikult öeldes jaotatakse diploidse kromosoomistiku kaks homoloogset kromosoomi kahe suguraku vahel. Homosügootse isendi puhul saadakse kaks

20 18 ühesugust gameeti, heterosügootse isendi puhul aga kaks erinevat. Kasutades homoloogide tähistusena ladina tähti, võime skemaatiliselt kirjeldada toimunut järgmiselt: Ema: BB Isa: Bb Sugurakud B b B BB Bb B BB Bb Tõenäosuste kasutamine lahknemissuhete arvutamisel põhineb sellel, et meioosil tekib heterosügootidel kahte tüüpi gameete vōrdse tõenäosusega, mõlema tüübi tõenäosus on 1/2 e. 0,5. Seega on ka sügoodi moodustumisel võrdne tõenäosus erinevat tüüpi sugurakkudel kohtuda. Tõenäosuste korrutamise seadus ütleb: "Kahe sõltumatu sündmuse üheaegse toimumise tõenäosus võrdub mõlema sündmuse eraldi toimumise tõenäosuste korrutisega." Kasutades tõenäosuste korrutamise reeglit saame eelnevas näites järgmised sügootide tõenäosused: Sügoote alleelidega B ja B 1/2 B x 1/2 B= 1/4 Sügoote alleelidega B ja B 1/2 B x 1/2 B= 1/4 Sügoote alleelidega B ja b 1/2 B x 1/2 b= 1/4 Sügoote alleelidega B ja b 1/2 B x 1/2 b= 1/4 Genotüübiline lahknemissuhe on seega: 1/2BB:1/2Bb Kasutatud kirjandus F. W. Nicholas. Veterinary Genetics. Clarendon Press, Oxford, 1988, 2000 R. Teinberg. Pōllumajandusloomade geneetika, Valgus, Tallinn, Kontrollküsimused II ptk kohta 1. Mis on kromosoomid? 2. karüotüüp? 3. genoom? 4. Mis on autosoomid ja mis gonosoomid?

21 5. Haploidsuse ja diploidsuse mõiste. 6. Mis on homoloogsed kromosoomid? 7. Gameet ja sügoot, somaatiline rakk. 8. Meioosi ja mitoosi mõiste. 9. Karüotüübi kolm olulist omadust. 10. Mis on prokarüoot, eukarüoot? 11. Millistes eukarüootide rakkudes leidub sugukromosoome? 12. Mis on DNA ja millest ta koosneb? 13. Loetle DNA koostises leiduvad lämmastikalused. 14. Nimeta nukleotiidi koostisosad. 15. Millised keemilised sidemed ühendavad nukleotiide omavahel ühes ahelas ja millised kahte nukleotiidiahelat omavahel. 16. Komplementaarsuse mõiste. 17. DNA replikatsiooni mõiste. 18. Geneetilise koodi ja koodoni mõiste. 19. Mille poolest erineb RNA DNA-st? 20. Milles seisneb transkriptsioon valgusünteesil? 21. Millises raku osas toimub tegelik valgusüntees ja millised raku organellid on sellesse haaratud. 22. Informatsiooni RNA ja transpordi RNA ülesanne valgusünteesil? 23. Mis on translatsioon? 24. Geeni, lookuse ja alleeli mõiste. 25. Introni ja eksoni mõiste. 26. Mis on struktuursed geenid, mis reguleerivad geenid? 27. Kuidas jaotatakse reguleerivaid geene, mis on alaliikide ülesanded? 28. Geeni mõiste lähtudes tunnustest. 29. Dialleelsuse ja polüalleelsuse mõiste. 30. Homosügootsuse ja heterosügootsuse mõiste. 31. Organismi muutlikkuse liigid (koos alaliikidega) 32. Mutatsioonilise, kombinatiivse ja ontogeneetilise muutlikkuse olemus 33. Interkromosoomse rekombinatsiooni ja intrakromosoomse rekombinatsiooni olemus. 34. Geenimutatsioonide tekke põhjused ja olemus. 35. Spontaanse ja indutseeritud mutatsiooni mõiste 36. Kromosoommutatsiooni mõiste ja tüübid. 37. Euploidsuse ja aneuploidsuse mõiste 38. Mis on pärandumine? 39. Mendeli I seadus 40. Mendeli II seadus 41. Lahknemissuhete arvutamine 19

22 20 3. MOLEKULAARBIOLOOGIA JA REKOMBINANT-DNA TEHNOLOOGIA Rekombinant-DNA (hübriidse DNA) tehnoloogia on tänapäeva geneetika ja molekulaarbioloogia (ka mikrobioloogia, biotehnoloogia ja üldbioloogia) peamisi meetodeid. Selleta ei saa läbi ka veterinaarteadus ja -praktika. Rekombinant-DNA tehnoloogia kasutusele vôtmine on oluliselt avardanud vôimalusi uurida geenide molekulaarset struktuuri ning pärilikkuse biokeemiat. Ühtlasi on tänu rekombinant-dna tehnoloogiale astutud kvalitatiivne samm edasi biotehnoloogias ja nakkushaiguste diagnostikas. Rekombinant-DNA tehnoloogia pôhimeetodid on järgmised: (1) DNA molekuli lôhestamine e. lôikamine fragmentideks restriktsiooni ensüümide abil, mis lôhuvad sidemed nukleiinhapete (NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete järjetusega piirkonnas (iga ensüümi jaoks eri NH järjestus) (2) Nukleiinhappeline hübridiseerimine- tänu DNA, RNA molekulide vôimele siduda vabasid NHid on vôimalik tetaud NH-järjestusega vabade märgistatud DNA-fragmentide abil avastada komplementaarse järjestusega lôike uuritavas DNA vôi RNA molekulis. (3) DNA kloonimine- ühe DNA fragmendi alusel on vôimalik sünteesida sama fragmendi miljoneid koopiaid. (4) DNA fragmendi nukleotiidide järjestuse määramine (sekveneerimine- ingl k. sequencing), mis vôimaldab määratleda geenide NH-lise koostise, nende täpse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. (5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. 3.1 Restriktsiooni (ehk piiravad) ensüümid a. avastati, et paljudel bakteritel on omadus lõhustada bakterirakku tunginud võõrast DNA-d (peamiselt bakterviiruseid) fragmentideks. Ensüüme (nukleaase), mille abil viiruste DNA lôhkumine toimus hakati nimetama restriktsiooni ensüümideks, kuna nad olid määravaks teguriks

23 17 sellise nähtuse puhul nagu peremehepoolne bakterviiruste infitseerivuse piiramine (ingl.k. host restriction). Restriktsiooni nukleaasidel ehk restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA NH-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. (Vôrdlevalt näiteks DNA-aasid lõhustavad DNA'd juhuslikult). Praegu tuntakse üle 100 restriktsiooni ensüümi ning praktiliselt on vôimalik mistahes geen vôi mistahes DNA fragment genoomist ka välja lôigata. Alljärgnevalt on toodud näitena viie enamkasutatava restriktaasi äratundmis-järjestused ja lôikepiirkonnad. Peremees- Ensüümi Äratundmis-järjestus ja lõikepiirkond organism tähis Bacillus Bam HI 3'- C - C - T - A - G G - 5' amylolique- faciens 5'- G G - A - T - C - C - 3' E. coli Eco RI 3'- C - T - T - A - A G - 5' 5'- G A - A - T - T - C - 3' Haemophilus Hind III 3'- T - T - C - G - A A - 5' influenzae 5'- A A - G - C - T - T - 3' Providencia Pst I 3'- G A - C - G - T - C - 5' stuartii 5'- C - T - G - C - A G - 3' Haemophilus Hpa I 3'- C - A - A T - T - G - 5' parainfluenzae 5'- G - T - T A - A - C - 3' Joonis 3.1. Restriktsiooni ensüümid. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) vôi siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita.

24 18 Joonis 3.2 Restriktsiooni ensüümide talitlus Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant DNA molekulideks ning siit nimi ka kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lôhustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lõhustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat lôikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agargeelis liiguvad need fragmendid geelis erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid värvitakse vôi märgistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning määratakse nende molekulmass. Sel teel saame DNA restriktsiooni kaardi e. profiili. Selle alusel on vôimalik vôrrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH järjestust määramata. Samuti saab määrata näiteks erinevate mikroobitüvede geneetilist sugulust (mistôttu see on ka molekulaarepidemioloogia üks olulisi

25 19 meetodeid). 3.2 NH hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid. See on vôimaldanud luua kôrge tundlikkusega meetodid spetsiifiliste NH järjestuste avastamiseks uuritavas materjalis. Selleks kasutatakse puhastatud vôi kloonitud NH ahelate fragmente, millel on kindlaksmääratud NH järjestus ja mis on märgistatud kas keemilise markeri vôi radioaktiivse isotoobiga (signaal). Selliselt töödeldud DNA fragmente nimetatakse DNA sondideks (ingl. k. probes). Sondide abil on vôimalik määrata geenide lokalisatsiooni kromosoomides, defektgeenide olemasolu, geenide talitluslikku aktiivsust määrates nende poolt produtseeritava informatsiooni RNA hulka tsütoplasmas, aga ka näiteks viirusliku RNA vôi DNA olemasolu ja lokalisatsiooni kudedes ning rakkudes. Joonis 3.3 Nukleiinhapete hübridiseerimine

26 20 NH hübridiseerimise eri juhuks on ka sellised meetodid nagu Southern blotting ja Northern blotting ("lõuna" ja "pôhja" märgistamine). E.M. Southern töötas välja meetodi DNA fragmentide kindlakstegemiseks agaroosgeelis. Restrikataasi abil lôhustatud kaksikahelalise DNA fragmentide elektroforeetilise lahutamise järel denatureeritakse DNA topeltahelad üksikahelateks NaOH abil. Denatureeritud ahelad kantakse üle nitrotselluloos kilele. Kile viiakse sondi sisaldavasse lahusesse. Sond hübridiseerub vastava üksikahelise DNA fragmendiga ja tema asukoht elektroforegrammil on vôimalik kindlaks määrata, kuna sond on märgistatud. Northern blotting'iks nimetatakse RNA fragmentide määramist samal meetodil. 3.3 Rekombinant DNA ja DNA kloonimine DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme vôi polümeraas-ahelreaktsioooni Isepaljunevate süsteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage. Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-dna viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised (vt ka joonis 14.1.): 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasigas.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest.

27 21 Joonis 3.4 Kloonimine plasmiidide abil Teiseks DNA kloonimise vôimaluseks on polümeraas-ahelreaktsiooni (PCR- polymerase chain reaction) kasutamine. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust.

28 22 Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat ) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised (vt ka joonis 3.5): 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 C; sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 C juurde 30 sekundiks; 3) komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI). Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi. Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada. Saadud koopiate arv ulatub aga 30 tsükli järel juba miljonitesse, mis on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi. PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis. PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA-molekul, mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. RNA uurimiseks ja paljundamiseks PCR meetodil on esmalt vajalik RNA transkribeerida DNA-ks, mida saab teha ensüümi- pöördtranskriptaasi abil, mida leidub retroviirustest nakatunud rakkudes. Selmoel sünteesitud DNA-st on vôimalik saada hiljem taas

29 23 RNA-molekulid. Joonis 3.5 Polümeraas-ahelreaktsiooni etapid

30 DNA molekuli nukleiinhappelise (NH) järjestuse määramine Elektroforeetiliselt lahutatud DNA fragmentide NH järjestust on vôimalik kiiresti määrata kasutades selleks kas keemilist vôi ensümaatilist sekveneerimist. Keemiline meetod pôhineb nukleotiide valikuliselt lôhustavate kemikaalide kasutamisel. Esmalt märgistatakse radioaktiivse isotoobiga DNA ahela üks ots, misjärel jagatakse märgistatud fragmendid 4 katsuti vahel. Kasutades erinevaid kemikaale lõhustatakse üks või kaks N-alust (A,T,G,C) ahelas (igas katsutis erinevad). Saadakse erineva pikkusega DNA fragmente, mille elektroforeetiline uurimine vôimaldab määrata nukleotiidide järjestuse. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on jällegi erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. DNA NH järjestuse määramine on aluseks kôigile teistele meetoditele insenergeneetika vallas. See vôimaldab leida genoomi piirkonnad, mis kodeerivad proteiinide sünteesi ja määrata ka proteiinide aminohappelise koostise. 3.5 Rekombinant DNA tehnoloogia ja insenergeneetika Pôhiliselt on kolm ainevaldkonda, kus insenergeneetikal on lähiajal laiem perspektiiv. (1) Teatud spetsiifiliste molekulide tootmine suurtes hulkades. Siia kuuluvad esmajoones DNA ja RNA molekulid kuid samuti mitmesuguste proteiinide produktsioon, millele eelneb vastava geeni viimine sobiva peremehe genoomi (eelkôige bakterid, kuid ka taimed ja loomad). Sel teel on vôimalik produtseerida nii ensüüme kui hormoone kui näiteks ka viiruse kapsliproteiine, mida saab kasutada kui vaktsiine. (2) DNA-sondide loomine infektsioonide, defektsete geenide ja ka resistentsuse ja mistahes muid tunnuseid kandvate geenide lokaliseerimiseks genoomis. Perspektiivis vôib see saada ka tôuaretuses tôhusaks vahendiks loomade produktiivsuse tôstmisel. (3) Transgeensete (liigivôôraid geene omavate vôi teatud liigiomaste geenideta organismid) isendite ja organismide loomine. Esmajoones tulevad siin kõne alla mikroobsed organismid

31 25 (bakterid, seened), aga ka taimed, keda on vôimalik rakendada tôhusamalt teenima inimkonna huve. (4) Transgeensed kôrgemad loomad on aga olulised nii geenide talitluse kui pärilike defektide uurimisel. Näiteks on suudetud luua transgeenseid hiiri, kellel puuduvad terved geenid ning neid kasutatakse just geenide funktsioonide uurimisel. Insenergeneetilised vaktsiinid ja DNA-vaktsineerimine Rekombinant-DNA tehnoloogia areng ei ole mööda läinud ka vaktsiinide loojatest. Insenergeneetiliste meetoditega loodud vaktsiinid vôib jaotada kolme rühma: (1) rekombinant-antigeen-vaktsiinid (ingl.. k. - subunit vaccine) (2) rekombinant-vektor-vaktsiinid (3) geneetilise modifitseerimisega atenueeritud mikroobid Rekombinant-antigeen-vaktsiinide loomine pôhineb patogeenide antigeenseid omadusi määravate geenide siirdamises bakterite vôi pärmseente genoomi vôi ka imetajate rakkudesse koekultuurides. Selle tulemusena produtseeritakse suurel hulgal patogeenide antigeene, mis seejärel isoleeritakse, puhastatakse ja kasutatakse kui puhast antigeeni. Esimene rekombinant-vaksiin, mis ka praktikas osutus efektiivseks oli suu- ja sôrataudi viiruse vastane vaktsiin, mis pôhines peamise antigeeni- VP-1 tootmisel E. coli's. Esimene inimesel kasutatud samalaadne vaktsiin oli hepatiit-b viiruse vastane vaktsiin. Antud juhul kasutati transgeense organismina pärmseent. Töö käib ja mõningast edu on saavutatud transgeensete taimede loomisel, kus patogeeni antigeene tootvaid geene siiratakse taimedesse. See võimaldaks rohttaimede abil vaktsineerida suu kaudu nii metsloomi kui suurtel karjamaadel (eriti mägikarjamaadel) peetavaid kariloomi- on eriti oluline lõunapoolsetes vennas vaba- ja kuningriikides. Rekombinant-vektor-vaktsiinide e. DNA-vaktsiinide puhul manustatakse peremeesorganismi patogeeni antigeene produtseerivaid geene, kusjuures vektoritena (geeni kandjatena) kasutatakse kas apatogeenseid vôi atenueeritud viiruseid vôi baktereid vôi bakterite plasmiide. (Plasmiisdide kasutamisekorral on ôigem kônelda DNA-vaktsineerimisest, kuna geenikandja ei ole elusorganism vaid üksnes DNA-molekul.)

32 26 Nii inimese kui loomade viiruste vastaste vaktsiinide loomisel on sagedamini kasutatav vektor vaktsiinia viirus- atenueeeritud rôugeviirus, tänu oma lihtsale struktuurile. Joonisel 14.3 on kujutatud uue geeni lisamine vaktsiinia viiruse genoomi. Bakteritest on vektorina kasutatud Salmonella typhimuriumi atenueeritud tüvesid. Käesoleval ajal on maailmas registreeritud 5 rekombinant-vektorvaktsiini. Neist on 2 on veterinaarias metsloomadel kasutatavad marutaudivaktsiinid, kus vektorina on kasutusel vaktsiinia viirus. DNA vaktsineerimine Vektor-vaktsiini korral paljuneb vektorina talitlev mikroob organismis ja tema genoomis on ekspresseritud ka geenid, mis produtseerivad mõne patogeeni antigeene. Seevastu DNAvaktsineerimise korral viiakse organismi vaid rekombinantseid plasmiide. Huvipakkuv on asjaolu, et manustatud plasmiidid on võrdlemisi püsivad ning nende abil organismi viidud geenide ekspressioon on täheldatav kuude ja aastate vältel. Kuna katsed on seni viidud läbi vaid loomadel ja enamasti katseloomadel (hiired, rotid, küülikud, kanad), kelle elutsükkel on suhteliselt lühike, siis pole teada täpselt kui kaua geenide ekspressioon püsib. Katseloomadel on see olnud eluaegne. Katsed primaatide ja veistega on üsna alguses ja sealt on andmed esialgsed. Vôrreldes vektor-vaktsiinidega on DNA-vaktsiini eeliseks see, et imuunsupressiooni all kannatavad isendid ei satu ohtu saada kahjustatud vektor-organismi poolt, mida on täheldatud AIDS'i patsientide puhul vaktsiinia viiruse kasutamisel. Samas ei teata täpselt kuidas võib võõras geneetiline materjal organismi lõpuks mõjutada. Ehkki plasmiidiga organismi viidud DNA liitumist kromosomaalse DNA-ga pole täheldatud ei ole siin veel kôik selge. Siiski vôib uskuda, et fataalsete haiguste raviks hakatakse DNA vaktsineerimist kasutama kôige lähemas tulevikus. Lisaks patogeenide antigeene produtseerivatele geenidele on uuritud võimalusi kasutada vektoreid ka defektsete geenide asendamiseks normaalsete geenidega. Vektoriga liidetakse normaalne geen, mis viiakse organismi ja kompenseeritakse sellega vastava geeni defekt. Mikroobide atenueerimine geneetilise modifitseerimise teel seisneb mikroobi genoomi geeni lisamine, geeni kustutamine või selle asendamine teisega (kimäärsed mkroobid), mis muudab mikroobi apatogeenseks.

33 27

34 GMO GENEETILISELT MUUNDATUD ORGANISM Haldja Viinalass GMO on organism, mille pärilikkustegureid (genoomi) on inimese poolt muudetud viisil, mida looduses ei esine. Geneetiline muundamine leiab aset siis, kui kasutatakse vähemalt ühte järgmistest meetoditest: 1) rekombinantse nukleiinhappe tehnikaid, millega luuakse väljaspool organismi geneetilise materjali muundatud kombinatsioone ja mis viiakse peremeesorganismi, kus neid looduslikult ei esine, kuid milles on nad võimelised jätkuvalt paljunema; 2) väljaspool organismi valmistatud päriliku materjali organismi viimist; 3) looduses mitteesineval viisil kahe või enama raku ühinemisega muundatud geneetilise materjaliga elusrakkude saamist. Geneetiliseks muundamiseks ei loeta*: 1) viljastamist väljaspool vanemorganismi; 2) konjugatsiooni, transduktsiooni, transformatsiooni või mõnd muud looduslikku protsessi; 3) indutseeritud polüploidsust. 4) Mutatsioonide indutseerimist. * - kehtib tingimusel, et ei kasutata rekombinantse DNA molekule või geneetiliselt muundatud organismi. GENEETILISELT MUUNDATUD TAIMED Taimerakkude arengubioloogiline programm erineb loomarakkude omast ühe väga olulise iseärasuse poolest. Nimelt säilitavad kõik taimerakud kogu oma eluea vältel totipotentsuse ehk teisisõnu on teatud tingimustel võimelised dediferentseeruma ning alustama organismi ontogeneesi n.ö. otsast peale. Totipotentsus võimaldab sisuliselt ükskõik millisest kultuuri viidud taimerakust uuesti regenereerida tervikliku õitseva ja viljuva taime. Seetõttu on muuhulgas võimalik ka transgeensete taimede konstrueerimine, kasutades geenitehnoloogilisteks manipulatsioonideks diferentseerunud kudedest pärit rakke (nt lehe mesofülli rakud või juurerakud). Transgeensete loomade konstrueerimisel seevastu saab kasutada üksnes sügooti või väga varajases arengustaadiumis embrüonaalseid rakke, kuna üksnes need on veel säilitanud totipotentsuse. Diferentseerunud taimerakkudega töötamine ning nendest lähtudes uute terviklike taimede regenereerimine eeldab aga häid teadmisi taimede koekultuurist. Koekultuuri rakkudega õige manipuleerimine ongi peaaegu kõigi hetkel inimese käsutuses olevate transgeensete taimede konstrueerimise meetodite kasutamise eelduseks.

35 29 Võõraste geenide taimedesse viimiseks kasutatakse: 1) agrobakteri poolt vahendatud geeniülekannet, 2) otsene DNA sisseviimine keemiliselt, elektriliselt või mehhaaniliselt töödeldud protoplastidesse, 3) taimede pommitamine metalliosakestega, 4) taimede elektropoleerimine, 5) DNA sisseviimine mikroskoopiliste fiibritega või ultraheliga mehhaaniliselt vigastatud taimekudedesse. Milleks lisatakse toiduainetele geene? Mais: vastupidavus putukate ja taimekaitsevahendite suhtes Sojauba: vastupidavus taimekaitsevahendite ja viiruste suhtes Raps: õli koostise muutmine, vastupidavus taimekaitsevahendite suhtes Kartul: vastupidavus putukate ja taimekaitsevahendite suhtes, suurem tärklisesisaldus Vaarikad: küpsemise aeglustamine Melon: küpsemise aeglustamine Nisu: vastupidavus taimekaitsevahendite suhtes, tärkllisesortide muutmine Päevalill: õli koostise muutmine Köögiviljad: vastupidavus tainekaitsevahendite suhtes, parem säilivus Õun: vastupidavus haiguste suhtes, küpsemise aeglustamine. Kloonimine Kõrgemate loomade kloonimise põhimõttelisi meetodeid on kaks: 1. Embrüokloonimine embrüo tükeldamine pärast sügoodi pooldumist (blastomeeride eraldamine) ja saadud embrüote siirdamine surrogaatemadesse. 2. Somaatilise raku tuuma siirdamine munarakku kloonitava organismi rakutuum eraldatakse ja viiakse munarakku, mille tuum on eelnevalt eemaldatud. Võimalik on ka somaatilise raku ja tuumata munaraku liitmine elektriimpulsi abil. Mõlemal juhul hakkab munarakk arenema nagu normaalne sügoot ning see siiratakse surrogaatemasse pärast esmaseid lõigustumisi. Kuidas saadi Dolly? 1. Lamba udaranäärmest eraldati rakud, mida kasvatati rakukultuurina katseklaasis 2. Rakkusid näljutati, et nad lõpetaksid pooldumise. 3. Soikeseisundis rakkudelt võeti tuumad ja viidi munarakkudesse.

36 30 4. Munarakule anti elektriimpulss, mis aitas tuumal tsütoplasmaga ühineda ja aktiveeris raku ning see hakkas uuesti poolduma 5. Saadud sügoodid viidi lamba muanjuahasse, kus need arenesid moorula faasi. 6. Embrüod loputati välja ja valiti siirdamiseks sobivad embrüod, mis siirati surrogaat uttedele st munarakust saadi 29 siirdamiseks sobivat embrüot, millest sündis üks tall - Dolly Veise kloonimine: 1. Ühelt lehmalt võeti üheksa päeva vanune loode 2. Lootest eraldati rakud 3. Rakke kasvatati kultuuris 4. Teiselt lehmalt võeti munarakk 5. Munarakust eraldati tuum koos kromosoomidega

37 31 6. Hoides pipeti vahel munarakku, viidi sinna doonorraku tuum 7. Munarakud viidi asendusemasse, kes kandis loote lõpuni. Kui Dolly puhul kasutati kloonimiseks täiskasvanud looma rakku, siis vasika kloonimiseks kasutati looterakku. Loote teatud rakkudele on iseloomulik väga kiire paljunemine ja võime areneda kõigi kudede rakkudeks. Seetõttu on loote rakutuumast järglase loomine suhteliselt lihtsam. Kui Dolly saadi 277. katsel, siis 1999.a. jaanuaris sündinud kolmikvasikate loomine õnnestus umbes 50. katsel. Kõige üldisemalt toimub looterakkude abil kloonimine järgmiselt: 1) Lootelt pärinevaid rakke kasvatatakse algul katseklaasis, lisades neile kasvu ja arengut stimuleerivaid aineid 2) Valitakse välja sobivate püsivate omadustega rakuliin (rakukloon) 3) Viljastatud munarakult eemaldatakse tuum 4) Kloonitud looterakk ühendatakse elektriimpulsi abil munarakuga 5) Munarakk hakkab jagunema, arenedes mitmekümnest rakust koosnevaks embrüoks 6) Embrüo siiratakse lehma emakasse, kus ta areneb vasikaks. Sarnaselt toimides on võimalik ühe rakuklooni rakkudest saada piiramatul hulgal vasikakoopiaid, kellel on kõigil ühesugused geneetilised omadused. Käesolevaks ajaks on juba loodud embrüokloon, mille rakud sisaldavad inimese seerumi albumiini sünteesiks vajalikku geeni. Seerumi albumiini vajadus kasvab järjest kogu maailmas, sest AIDS-i ohu tõttu kasutatakse doonorivere asemel üha rohkem sünteetilisi vereasendajaid, mille üks koostisosa on inimese seerumi albumiin. Lehmad, kes oma piima koostises toodaksid seda hinnalist valku, oleksid eriti väärtuslikud farmaatsiatööstustele. Sellest tulenevalt toetavadki maailma juhtivad farmaatsiakompaniid geenisiirdamise ja kloonimisega seotud uuringud. Lisaks tuntakse huvi hemofiiliahaigete raviks hädavajalike vere hüübimise toimeainete tootmise ja inimestele transplantatsiooniks sobivate kudede ja organite kasvatamise vastu.

38 32 GEENITEHNOLOOGIA HÜVED JA RISKID Poolt GT annab lootust, et peagi leitakse seni ravimatute haiguste (vähk, AIDS) ravimid. Vähenevad kulutused ensüümide, hormoonide, vaktsiinide jne. tootmiseks. Selle asemel, et neid aineid loomade elunditest saada, on võimalik bakteritesse vajalikud geenid lisada ning soovitud ühendeid nende abil toota. Saab suurendada põllukultuuride saagikust ning vastupidavust kahjurputukatele, veepuudusele või öökülmade vastu, pikendada saagi säilimisaega. On võimalik vähendada toiduainete tootmise kulusid. Näiteks on aretatud kalu, mis kasvavad kiiremini ja saavutavad suurema massi, kuna neil tekib rohkem kasvuhormooni. Vastu GMO-de käitumist looduses ei ole võimalik pikaks ajaks ennustada. GMO-sid katsetatakse enne loodusesse päästmist ainult ühe kasvuperioodi jooksul. Katsete läbiviimise eest vastutavad tootjad ise. Võõrgeenid võival kas risttolmlemise või viiruste kaudu sattuda looduslike (sugulas)liikide DNA-sse. Kui umbrohutõrjevahenditele vastupidavuse geen satub umbrohu DNA hulka, võivad tekkida superumbrohud, mille vastu kemikaalid enam ei aita. Kahjurputukate suhtes vastupidavad taimed toovad neil putukatel kaasa uue kohastumise. Ohtlik võib olla antibiootikumiresistentsuse geeni sattumine inimese soolestikus elunevate organismide kasulike bakterite DNA hulka. On tõestatud antibiootikumiresistentsete geenide kandumist kariloomade soolebakteritest inimese soolebakteritesse. Toit, milles on geenid, mis pärinevad organismidelt, mis pole kunagi inimtoidu hulka kuulunud, võib esile kutsuda allergianähte. Parapähklipuu metioniinirikka valgu geeni ülekandmine sojapähklitesse suurendas lisaks toiteväärtusele ka allergianähtude hulka. GMO-sid sisaldava toote pakendamine ja märgistamine (Eesti RK seadus nr 4, Geneetiliselt muundatud organismide keskkonda viimise seadus, vastu võetud ): 1. Toodet tohib turustada pakendatult ja märgistatult. 2. Toote pakendil olev märgistus peab sisaldama: 1) teksti Toode sisaldab geneetiliselt muundatud organismi või teksti Toode võib sisaldada geneetiliselt muundatud organismi juhul, kui selle sisaldumine tootes ei ole kindlalt teada; 2) tootes oleva geneetiliselt muundatud organismi nimetust; 3) tootja nime või nimetust; 4) toote omadusi ja tootele sobivaid looduslikke tingimusi.

39 33 Kontrollküsimused ptk Mis on rekombinant-dna? 2. Rekombinant-DNA tehnoloogia põhielemendid. 3. Mis on restriktaasid, mille poolest erinevad nad tavalistest nukleaasidest? 4. Mis on DNA restriktsiooni fragmendid ja mis on DNA restriktsiooni kaart? 5. DNA ahela nukleiotiidse järjestuse määramise keemiline meetod. 6. DNA ahela nukleiotiidse järjestuse määramise ensümaatiline meetod. 7. Nukleiinhappelise hübridiseerimise põhimõte. 8. Mis on DNA-sond ja milleks neid kasutatakse? 8. DNA kloonimise mõiste. 9. Nimeta isepaljunevaid süsteeme DNA kloonimiseks. 10. Loetle põhietapid DNA kloonimisel isepaljunevas süsteemis. 11. Polümeraas-ahelreaktsioonis (PCR) vajaminevad põhikomponendid. 12. Polümeraas-ahelreaktsiooni põhietapid. 13. Milleks kasutatakse PCR-i? 14. Insenergeneetika põhilised rakendusalad. 15. Rekombinant-antigeen-vaktsiini valmistamise põhimõte. 16. Rekombinant-vektor-vaktsiini mõiste 17. Mikroobide insergeneetiline atenueerimine 18. Mis on GMO? 19. Millal leiab aset geneetiline muundamine? 20. Mida ei loeta geneetiliseks muundamiseks? 21. Mis on taimede geneetilise muundamise eesmärgiks? Tooge näiteid. 22. Mis on loomade geneetilise muundamise eesmärgiks? Tooge näiteid. 23. Mis on mikroobide geneetilisemuundamise eesmärk? 24. Mida tähendab mõiste organismi kloonimine? 25. Millised loomade kloonimise meetodid on kasutusel? 26. Loetlege geenitehnoloogia hüvesid. 27. Milles nähakse geenitehnoloogia ohte?

40 33 4. GENEETILISED ANOMAALIAD Geneetiline anomaalia on geneetiliselt määratud, looma tervise või tõuliste omaduste seisukohalt soovimatu kõrvalekalle normist. Teisisõnu looma genotüübist tulenev organismi kasvu ja/ või arengu häire ja/ või düs-, hüpovõi hüperfunktsioon. Geneetiline (pärilik) vrs. päritav Geneetiline anomaalia võib olla päritav, kuid võib olla ka mittepäritav. Päritavad anomaaliad on põhjustatud retsessiivsetest geenidest või mitteletaalsetest geenidest, mistõttu kahjulik geen võib ühest põlvkonnast teise edasi kanduda. Mittepäritavad anomaaliad on tekkinud isendi ontogeneesi käigus toimunud genotüübi muutuste tagajärjel. Kui selle tulemuseks on isendi viljatus või hukkumine enne suguküpsuse saabumist (letaalse, subletaalse-, semiletaalse-, subvitaalse geeni tekkimine), siis muutunud geeni edasikandumine järgmistele põlvkondadele ei ole võimalik. Selle näiteks võib tuua loote geenide kahjustumise teratogeensete tegurite toime tagajärjel. Mingis mõttes võib siia hulka lugeda ka mutatsioonid, mis tekivad vanemisendi sugurakkude geenides, mille tõttu defekt avaldub küll antud isendi järglasel, kuid ei pärandu edasi järgmistele põlvkondadele. Wiesner ja Willer (1974) jaotavad pärilikke (geneetilisi) anomaaliaid järgmiselt: GENEETILINE ANOMAALIA Kōrvalekalded tõulistes omadustes Pärilikud patoloogiad Pärilikud haigused Geneetiline puudulikkus

41 34 Haiguste pärilik eelsoodumus Mitmete haiguste puhul on täheldatav pärilik eelsoodumus- st., et teatud loomaliinides või ka tõugudel esineb haigust rohkem kui teistel sama liigi isenditel. Eelsoodumuse puhul avaldub haigus teatud eksogeensete tegurite mõjul. Eelsoodumus on seotud organismi reaktsiooniga väliskeskkonna mõjudele. Eelsoodumused on determineeritud polügeenselt, kusjuures peamiste geenide efekti võivad mõjutada modifikaatorgeenid. Täpsemalt käsitletakse haiguste eelsoodumusega seotud küsimusi edaspidi. järgmiselt: Geneetilisi anomaaliaid põhjustavaid geene saab jaotada sõltuvalt fenotüübilisest avaldumisest Defektne geen Letaalgeen Morbiidgeen Vitaalgeen embrüosurm haigus tõuliste omaduste puudulikkus loote resorptsioon mittesurmav väärareng abort surnultsünd surm enne suguküpsust Letaalmorbiidne geen surm pärast suguküpsust Letaalgeenideks nim. geene, mis põhjustavad isendi surma enne tema suguküpsuse saabumist. Letaalgeenid on enamasti retsessiivsed ja nende toime avaldub valdavalt homosügootidel (aa). Dominantne letaalgeen, mis avaldab oma toimet ka heterosügootsena, esineb harva, sest need eemaldatakse populatsioonist automaatselt loodusliku valiku poolt. Dominantne letaalgeen säilib populatsioonis ainult juhul, kui tema penetrantsus pole absoluutne või siis, kui neid mutageneesi teel pidevalt juurde tekib. PENETRANTSUS- teatud geenile vastava tunnusega isendite proportsioon seda geeni omavate isendite hulgas.

42 35 Arvestades letaalgeenide penetrantsust klassifitseeritakse neid järgmiselt (Rosenbauer, 1969): Geeni tüüp Penetrantsus (%) Letaalne 100 Subletaalne > 90 Semiletaalne > 50 Subvitaalne < 50 Morbiidseid ja vitaalseid geene iseloomustab lisaks penetrantsusele ka ekspressiivsus. EKSPRESSIIVSUS- (mutantse) tunnuse fenotüübiline varieeruvus isenditel, kellel see on olemas. Näitab geeni avaldumise tugevust tunnuse väljaarenemise tugevuse alusel (minimaalsest- maksimaalseni) 4.1. PÄRILIKUD TERATOOMID JA DEFEKTID Loomadel esineb geenidefekte sageli. Geeni defekt põhjustab hälbeid organi arengus. Defekte esineb kõikides geenides ja organites. Lisaks organite väärarenguile esineb ka ensüümide defekte (ensümopaatiad), mille tagajärjeks on organismi talitluse häired. Väärarendite klassifikatsioon: Fenotüübiliselt jaotatakse väärarendeid (Wiesner ja Willer, 1979): 1) liigväärarendid e. ekstsess väärarendid.- organ on üliarenenud või on neid arvult normaalsest enam. 2) vaegväärarendid e. defitsiit väärarendid - organ on puudulikult arenenud või on neid arvult normist vähem. 3) düstoopia- organite väärpaiknemine Lisaks sellele jaotatakse väärarendid fenotüübiliselt ka üksik- ja kaksikväärarenditeks sõltuvalt sellest, kas väärastunud järglane on üksik või kaksik. Väärarenditest tuleb eristada atavisme, mis on liigi varasemas fülogeneesi etapis normaalse tunnuse avaldumine tänapäeval. Atavism on küll anomaalia, kuid mitte tüüpiline väärarend. Väärarendite tekkepõhjused

43 36 Väärarendite tekkepõhjused on geneetilised (vt. Ptk. 3.2) või mitmesugused keskkonnategurid eksogeensed faktorid. Neist tingitud väärarendeid nimetatakse eksogeenseteks. Eksogeenseid väärarendeid võivad tekitada järgmised faktorid: - füüsikalised; - keemilised; - infektsioossed; - toiteelementide vaegus ja toitumishäired. Pōllumajandusloomade arengudefektide iseloomustus organsüsteemide ja kehaosade kaupa vt. R. Teinberg (1983): "Pōllumajandusloomade erigeneetika" või "Loomatervise käsiraamat III" ptk. IX J. Parre: "Pärilikud haigused". Viimases on toodud ka rahvusvaheline koduloomade letaaldefektide nimistu. Saksa ja venekeeles vt. Wiesner ja Willer (vastavalt 1974 ja 1979) 4.2. GENEETILISTE ANOMAALIATE ETIOLOOGIA Kaasasündinud anomaaliate geneetilistest põhjustest on esikohal geenmutatsioonid. Vähem esineb kromosoomi mutatsioonidest tingitud anomaaliaid. Ka kombinatiivne muutlikkus ja vead geenide rekombinatsioonil võivad põhjustada defektsete geenide teket Mutatsioonid kui anomaaliate geneetilised põhjused Geenmutatsioonide tagajärjel tekivad uued alleelid. Enamik letaalmutatsioone ja pärilikke väärarendeid põhjustavaid mutatsioone on geenmutatsioonid, mida iseloomustab lihtne mendeleerumine. Defektgeeni toime mingi koe või organi arengule võib olla otsene või kaudne. Otsene- ebanormaalne rakkude diferentseerumine Kaudne- blokeeritakse mõne ensüümi süntees. Mutatsioonide kromosomaalse lokalisatsiooni järgi jaotatakse nad autosoomseteks ja gonosoomseteks (suguliitelisteks). Kui mutatsioon on tekkinud ontogeneesi käigus somaatilistes rakkudes, on tegemist somaatilise mutatsiooniga. Sellisel isendil on seega normaalse genotüübiga rakkude kõrval ka mutantsed rakud. Sellist isendit nimetatakse mosaiikseks.

44 37 Funktsionaalselt eristatakse järgmisi geenmutatsioone: amorfsed (inaktiivsed alleelid)- tingivad tunnuse kadumise hüpomorfsed (alatoimelised alleelid)- tingivad tunnuse nõrgenemise hüpermorfsed (ületoimelised alleelid)- tingivad tunnuse tugevnemise neomorfsed (kodominantne alleel normaalalleeliga)- kvalitatiivselt uue tunnuse ilmnemine antimorfsed (normaalalleelile antagonistlik alleel)- pärsivad tunnuse avaldumist Enamiku geenmutatsioonidest tingitud väärarendite ja defektide esinemissagedus on madal. Sageduse suurenemist täheldatakse juhtudel, kui ristuvate isendite arv populatsioonis on piiratud. Selle põhjuseid vaatleme edaspidi GENEETILISTE DEFEKTIDE PÄRITAVUS JA DEFEKTGEENIDE REKOMBINATSIOONID Enamik pärilikke defekte on monogeensed ja nende päritavust iseloomustab mendeleerumine autosoomsete või suguliiteliste geenide pärandumise reeglite järgi. Dominantsed defektid- päranduvad ainult juhul, kui nad ei põhjusta varast surma või viljatust. Esinevad peamiselt heterosügootsetes isendites. Homosügootsus on enamasti letaalne, kui just ei ole tegemist mittetäieliku penetrantsusega. Defektse isendi ristumisel normaalsega: Aa X aa -> 1/2Aa + 1/2aa, on pooled järglased defektiga. Retsessiivsed defektid- defektgeen pärandub varjatult heterosügootses genotüübis. Defekt avaldub sel juhul, kui kahe heterosügootse vanema defektgeenid rekombineeruvad homosügootsesse genotüüpi: Aa X Aa -> 1/4AA + 1/2Aa + 1/4aa

45 38 A B Joonis 4.1. Defekti retsessiivne ja dominantne päritavus Suguliitelise dominantse defekti korral on defektse emaslooma pooled tütred ja pooled pojad defektiga, defektse isa korral on aga vaid tütred defektiga. Xx* yx -> A0+ Aa + 0a + aa Suguliiteline retsessiivne defektgeen pärandub heterosügootse emaslooma kaudu, kuid avaldub peaaegu alati ainult isasloomadel: xx * XY -> 1/4AA + 1/4A0 + 1/4aA + 1/4a0 Eri lookuste defektgeenide koostoime korral tekkiv väärarend on polügeenne defekt. Polügeensete defektide päritavuse analüüsil tuleb lähtuda geenipaaride inter- ja intrakromosoomse rekombinatsiooni seadustest.

46 KROMOSOOMIDE HÄLBED Kromosoommutatsioonidest on koduloomadel tuntud deletsioonid, duplikatsioonid, inversioonid ja translokatsoonid, samuti (ka genoommutatsioonidena tuntud) euploidia ja aneuploidia. Kõige sagedasemaks on translokatsioonid. Kui translokatsioonid on tasakaalustatud seisundis (vastastikune translokatsioon- kromosoomiosade vahetus kahe mittehomoloogse kromosoomi vahel), on nende fenotüübiline avaldumine nõrk ja seetõttu leviku risk suur. Translokatsioonid mõjutavad peamiselt loomade sigivust ja seda negatiivselt. Näiteks tasakaalus translokatsiooniga kuldiga paaritamisel võib keskmine pesakonna suurus emistel väheneda kuni kaks korda. Teiseks enamtuntud translokatsiooni vormiks on tsentromeeride liitumine, kus kaks akrotsentrilist kromosoomi liituvad üheks metatsentriliseks kromosoomiks. Veisel ja lambal on tuntud 1. ja 29. kromosoomi liitumine (1/29 liitumine), mis veisel põhjustab sigivushäireid. Samas lambal ei ole kõrvalekaldeid normist täheldatud. Translokatsioonid põhjustavad sigimishäireid, kuna gameetide moodustumisel meioosis omandab vaid 50% neist tasakaalustatud kromosoomi. Deletsioone esineb oluliselt harvem. Nende fenotüübiline avaldumine on tunduvalt tugevam ning homosügoodid enamasti ja heterosügoodid sageli on eluvõimetud. Eluvõimelistel heterosügootidel on sagedased väärarendid. Sellest tulenevalt ei püsi need mutatsioonid populatsioonis kaua. Duplikatsiooni puhul on geenil kaks koopiat. Geenide duplitseerumine on evolutsiooni üks võtmemehhanisme. Kui geen on korra duplitseerunud, siis võivad kummaski koopias järgnevates põlvkondades toimuda muutused, mis viivad kahe erineva geeni moodustumisele. Duplikatsioonid tekivad tavaliselt ebavõrdse krossing-overi tõttu, mis leiab aset ebatüüpiliselt reastunud homoloogsete kromosoomide vahel meioosi käigus (sugurakkude moodustumisel). Tulemusena tekib ühes kromosoomis geeni duplikatsioon ja tema sõsarkromosoomis deletsioon. Duplikatsioonid võivad olla ka teatud haiguslike seisundite põhjuseks. Teatud vähkkasvajate puhul mängivad duplikatsioonid olulist rolli. Nad võivad põhjustad perifeerset neuropaatiat. Talasseemia (raskekujuline aneemia vorm) on põhjustatud hemoglobiini geeni kordistumisest. Inversioonide kohta koduloomadel on andmed kõige napimad ja puudub teave nende osast väärarendite tekkes. Tõenäoliselt on see marginaalne, kuna geneetilist materjali kaduma ei lähe, mistõttu ka fenotüübilised muutused on vähetõenäolised.

47 Ebanormaalne kromosoomiarv Euploidia Euploidial on tõenäoliselt oluliselt tähtsam roll loomade sigimishäiretes, kui selle kohta on esitada teaduslikke fakte. Seda seepärast, et euploidsed looted enamasti hukkuvad ja hukkunud loodete uurimine on alati keeruline. Kõige põhjalikumad andmed pärinevad uurimustest kanadel. Nii on leitud ühes uurimuses, 5,2%-l kanaembrüotest karüotüübi hälbeid. Nendest 81% puhul oli tegemist euploidiaga: kas haploidia või polüploidiaga. Haploidsed karüotüübid olid moodustunud ainult spermi kromosoomistikust. 90% triploididest oli tekkinud munaraku meioosi vigadest ja 10% dispermiast (munaraku viljastamine kahe spermiga). Kõikidel tetraploididel oli kaks kromosoomi komplekti kummaltki vanemalt ja arvatakse, et nende tekkimise põhjuseks oli mitoosi häired sügoodi esimestel jagunemistel pärast viljastumist. Pentaploidid (keda oli vaid kaks üle 9000-st uuritud embrüost) olid moodustunud tetraploidse munaraku ja normaalse spermi ühinemisest. Nagu näitavad teise uurimise tulemused, hukkub enamik euploidseid isendeid prenataalses või varases postnataalses eas. Nimelt kanapopulatsioonis, kus tuvastati 5-13%-l embrüotest kromosoomihälbeid, ei leitud neid ühelgi 3-6 nädalasel tibul. Karüotüübi hälbed kui embrüonaalse suremuse põhjus on selget tõestust leidnud nii lammastel, veistel kui sigadel. Veistel on hinnatud mitmesuguste karüotüübi hälvete sageduseks embrüotel 1-10%, sigadel 8-27%, lammastel 6-12%. Samas sündinud isenditel on nimetatud hälbed üliharvad. Sigadel on hinnatud, et 25% kogu embrüonaalsest suremusest on põhjustatud kromosoomihälvetest. Inimesel aborteerub ca 20% loodetest spontaanselt. Seejuures 30% spontaansetest abortidest on põhjustatud karüotüübi hälvetest. Aneuploidia Aneuploidial on oluline osa sigimishäirete põhjusena nii loomadel kui inimesel. Näiteks on ühes uurimuses täheldatud 69 %-l sigimishäiretega märadel X kromosoomide ebanormaalsust. Seejuures olid kõik uuritud märad väliselt normaalsed. Sigimiselundite patoloogiatena täheldati östraaltsükli ebaregulaarsust või puudumist, emaka ja munasarjade alamõõdulisust, munasarja folliikulite puudumist. 50%-l naistest, kellel puudub menstruatsioon on samuti tegemist X kromosoomi hälvetega.

48 41 Autososoomide aneuploidia Mõistetavalt esineb võrdselt gonosoomide aneuploidiaga ka autosoomide aneuploidiat, kuid et viimase puhul on embrüo eluvõime enamasti oluliselt kahjustunud, siis sünnijärgselt võib seda täheldada oluliselt harvemini. Kõige enam näiteid võib seejuures tuua inimeselt, keda on selles osas kõige enam uuritud. Kõige sagedamini esinev autosoomi aneuploidiast tingitud sündroom inimesel on Down'i tõbi, mida põhjustab 21. kromosoomi trisoomia. Oluline on märkida, et autosoomide monosoomiat ei ole täheldatud ühelgi elusana sündinud loomal ega inimesel. Hiirtel tehtud uurimused näitavad, et monosoomsed isendid hukkuvad embrüonaalse arengu väga varases järgus. Sugukromosoomide aneuploidia Kõige sagedamini esinev hälve on ühe X kromosoomi puudumine (eelnimetatud uurimuses märadel üle poolte X-kromosoomi hälvetest). Seda nähtust nimetatakse monosoomiaks täpsemini X- kromosoomi monosoomia. X kromosoomi monosoomiat on täheldatud ka hiirel, rotil, kassil, seal ja inimesel. Teiseks on täheldatud ka X kromosoomi trisoomiat, mis tähendab, et isendil on üks X kromosoom üleliia. XXX isenditel funktsioneerib vaid kaks X kromosoomi. XXX isendid on küllaltki sageli sigimisvõimelised ja nad on andnud normaalse karüotüübiga järglasi. Nii mono- kui trisoomia põhjuseks on meioosi hälve, nimelt kromosoomide mitte-lahknemine meioosis. See võib toimuda mistahes kromosoomiga kas I või II meioosis. Sugukromosoomide puhul sõltub sellise mittelahknemise tulemus isendi soost kus see aset leiab. Emaste puhul on asi lihtne: mistahes faasis mittelahknemine ka ei toimu, on tulemuseks üks kahe X kromosoomiga munarakk ja üks X-kromosoomita munarakk. Isaste puhul on asi keerulisem, ja kõiki võimalikke olukordi kirjeldab joonis 4.1. "Tasakaalustamata" sugurakud on sageli võimelised osalema sügoodi moodustamisel. Tabel 4.1. illustreerib võimalikke sugukromosoomide kombinatsioone sügoodis. Tabel 4.1. Võimalikud sugukromosoomide kombinatsioonid sügoodis

49 42 Sperm Normaalne Ebanormaalne X Y XY XX YY 0 Munarakk Normaalne X XX XY XXY XXX XYY X0 Ebanormaalne XX XXX XXY XXXY XXXX XXYY XX 0 X0 Y0 XY XX YY0 0 Tabelis 4.1 esitatud kombinatsioonidest vaid 0, Y0 ja YY0 karüotüüpi ei ole ühelgi imetajal täheldatud. Võib eeldada, et selline sügoot ei ole eluvõimeline ja hukkub üsna kohe pärast viljastumist. Kõik teised kombinatsioonid on esinenud vähemalt ühel imetajaliigil. XXXY ja XXY isenditel on enamasti isase fenotüüp, kuid sellega kaasneb isasele omase seksuaalkäitumise alaareng või puudumine ning steriilsus. Koduloomadest on seda täheldatud veisel, lambal ja seal. Inimesel on see tuntud Klinefelter'i sündroomina. Kokkuvõte: karüotüübi hälvetel on oluline osa embrüonaalse suremuse põhjusena. Kui embrüonaalses eas on täheldatav nii euploidia kui aneuploidia suhteliselt sageli, siis sündinud isenditel esineb seda üliharva. Sugukromosoomide aneuploidiaga kaasnevad loomadel sigimishäired ja seksuaalhälbed. Karüotüübi hälvete sagedus on perekonniti erinev, olles seega iseenesest geneetiliselt reguleeritud.

50 Joonis

51 SOOMÄÄRATLUSE HÄIRED Soomääratluse häired on kōige sagedamini seotud sugukromosoomide aneuploidiaga. Aneuploidia peamine pōhjus on meioosi patoloogia- kromosoomide mittelahknemine I vōi II anafaasis (Vt. joonis 4.1.) Aneuploidia tagajärjeks on sageli hermafrodiitsus vōi pseudohermafrodiitsus. Tōelise hermarodiitsuse korral on isendil mōlema sugupoole sugunäärmed, seevastu pseudohermafrodiidil on ühe sugupoole sugunäärmed, aga välised sugutunnused on vastassoolised vōi intersekssed Frimartinism Frimartiniks nimetatakse steriilset emast kaksikisendit. Frimartinism on kimäärsusest (XX/XY kimäärsus) tulenev soomääratluse anomaalia. Kimääriks nimetatakse isendit, kelle organismist vōib leida vähemalt kahe isendi rakke. Ehkki frimartinismi esineb kōikidel koduloomadel ja ka lindudel, on seda enam täheldatud veisel. 90% eri sugu kahe-munaraku kaksikvasikana sündinud lehmikutest on frimartinid. Frimartinismi pōhjuseks on eri sugu kahe-munaraku kaksiku koorionite liitumine ja veresoonte anostomooside kaudu vereringete ühinemine, mille kaudu toimub vereloomerakkude ja mōnede veel lōplikult selgitamata substantside vahetus. Ilmselt on frimartinism seotud H-Y antigeeniga, ehkki mitte kōik kimäärsed isendid ei ole frimartinid. Frimartinit iseloomustab vererakkude kimäärsus. Tema gonaadid on maskuliniseerunud ja ta on sigimatu. Kuid kimäärsusel on lisaks eelnimetatule veel muid mōjusid organismile, millest osa on mōlemale soole sarnased ja osa sooti erinevad. Soost sōltumatud tagajärjed: 1) Vererakkude kimäärsus- XX/XY kimäärsus % leukotsüüte pärineb teiselt isendilt; 2 erütrotsütaarset veregruppi kummalgi kaksikul 2) Tolerantsus koe transplantaadi suhtes. Erinevalt teistest kahe-munaraku kaksikutest, ei ole vähimatki antagonismi teiselt kaksikult siiratava koe suhtes.

52 45 Tagajärjed isasele kaksikule: Kuigi suguorganid on morfoloogiliselt normaalselt, vōib sageli täheldada sigimisvōime langust, mille pōhjuseks on madal sperma tihedus ja vähene liikuvus. Tagajärjed emasele kaksikule: Frimartini kujunemine. Suguorganite alaareng on erineva raskusastmega. Enamasti koosneb üks vōi mōlemad munasarjad nii munasarja kui testise koest (ova-testis). Vahel vōivad aga munasarjade asemel olla miniatuursed testised. Välised suguorganid on enamasti normaalse välimusega v.a. kliitoris, mis on enamasti suurenenud. Emaka arengus vōib täheldada kōiki variante alates normaalsest kuni selle puudumiseni. Frimartinismi diagnoosimine Enamik frimartinseid vasikaid on vōimalik avastada 3-6 nädala vanuses lihtsa kliinilise vaaatluse abil. Kaks tunnust, mille alusel vōib seda teha on: 1) lühike tupp (<12cm) 2) emaka ava puudumine Nimetatud moel ei ole vōimalik avastada kōiki frimartine. Täiendavalt vōib uurida leukotsüütide karüotüüpe. Ka sel testil on piiratud tundlikkus, kuna mōnedel frimartiinidel on kimäärsete leukotsüütide proportsioon väga väike. Samas ei ole maskulinisatsiooni aste sōltuvuses kimäärsete rakkude proportsioonist. Lōpuks tuleb märkida, et frimartinismi esineb ka üksikult sündinud vasikate seas. Seda saab seletada vaid looteeas isase kaksiku hukkumise ning loote resorptsiooniga XX-isased ja XY-emased Sugu päritakse lihtsal mendelistlikul viisil. Imetajatel määrab sugu Y-kromosoomi olemasolu sügoodis. Y-kromosoomi toime soo määramisel pōhineb tema omadusel mōjutada rakkudevahelist "koostööd ja teineteisemōistmist". Rakkude koostööd vahendavad rakumembraani proteiinid, mida nimetatakse ka retseptoriteks. Y-kromosoomis paiknev geen (SRY-geen) produtseerib membraaniproteiini, mille ülesanne on selgitada kudede omavahelist sobivust. Sellest tulenevalt nimetatakse seda proteiini Y-kromosoomi koesobivuse faktoriks e. koesobivus-antigeeniks, lühendatult H-Y antigeen (ingl.k. histocompatibility antigen).

53 46 (Retseptorite nimetamine antigeenideks tuleneb sellest, et nad indutseerivad ka antikehade moodustumist.) Tänaseks on selge, et kōik heterogameetse soo isendite (näit.: XY-kromosoomidega imetajatel) normaalsed rakud produtseerivad H-Y antigeeni. See antigeen on eri loomaliikidel immunoloogiliselt identne ja biokeemiliselt tähelepanuväärselt lähedane. Mis veelgi üllatavam- ta on väga sarnane ka heterogameetsetel lindudel esineva vastava retseptoriga. Lindudel on heterogameetideks emased (omavad ZW-kromosoome) ja neil on H-Y antigeeni analoog seotud W-kromosoomiga. H-Y antigeeni olemasolu mōjutades rakkude diferentseerumist määrab ära kas munasarjade ja testiste ühistest "eellastest" kujunevad ühed vōi teised. Testised omakorda eritavad naissuguorganite algete arengut pärssivat faktorit ja androgeeneisassuguhormoone, mis soodustavad isassuguorganite arengut. Selle eelduseks, et isassughormoonid toimet saaksid avaldada, peavad suguorganite algete rakud olema omakorda varustatud retseptoritega, mille abil hormoonid ära tuntakse. Geneetilise defektina esineb isassuguhormoonide retseptori defitsiit (retsessiivne suguliiteline defekt). Sellisel juhul arenevad välja väliselt emase isendi sootunnused. Testised jäävad kōhuōōnde, kuid ka emakas ei arene välja. Saame väliselt emase isendi kellel on aga XY sugukromosoomide paar. Kirjeldatud anomaaliat nimetatakse testikulaarfeminisatsiooniks e. testikulaar ebaliitsugulisuseks, ja seda on täheldatud paljudel loomaliikidel. XX-kromosoomistikuga isase fenotüübi põhjuseks on enamasti Y kromosoomi väikese lõigu insertsioon ühes X kromosoomis. XY- emase fenotüübi põhjuseks võib olla lisaks eelkirjeldatud testikulaarfeminisatsioonile, SRY-geeni deletsioon või defekt, mis pärsib H-Y antigeeni produktsiooni ja seetõttu arenevad XY isendil välja emassugunäärmed Vahesugulisuse klassifikatsioon Nicholas (1987) on esitanud vahesugulisuse klassifikatsiooni sōltuvalt selle etioloogiast: 1) kromosomaalne interseksuaalsus: kromosoomide hälvetest, peamiselt aneuploidiast tingitud soomääratluse anomaaliad (vahesugulisus) 2) gonaadne interseksuaalsus: normaalne emas vōi isas karüotüüp, kuid vastassugupoole gonaadid, vōi alaarenenud gonaadid (frimartinism) 3) fenotüübiline interseksuaalsus: normaalne kromosomaalne ja gonaadne soomääratus, kuid osa vōi kōik välised sootunnused vastassugupoolelt (testikulaar feminisatsioon).

54 LIIKIDE RISTAMINE Eri liiki isenditelt ristandite saamine on haruldane ja vōimalik vaid fülogeneetiliselt lähedaste liikide puhul. Selle eelduseks on mitte ainult kroomosoomide arvu ja struktuuri vōrdsus, vaid ka suure osa geneetilise materjali sarnasus. Liikidevahelise ristamise tulemusena saadud järglased on enamasti steriilsed, kuid üksikutel juhtudel vōib saada ka viljakaid järglasi. Üheks näiteks seejuures on veise (Bos taurus) ja pühvli ristand (Bos indicus). Veise ja püh <<Avli kromosoomistikus on erinev vaid Y kromosoomi suurus. Samas veise ja ameerika piisoni (Bison bison) ristandid on enamuses steriilsed, vaid üksikud emased on sigimisvōimelised, ehkki kahe liigi kromosoomiarv on vōrdne (2n=60). Hästi on tuntud hobuse ja eesli ristandid. Hobusetäku ja eeslimära ristandina saadakse hobueesel ning eeslitäku ja hobusemära ristandina muul. Seejuures on kummagi liigi kromosoomiarv erinev: hobusel 2n=64 ja eeslil 2n=62. Ristanditel on kromosoomiarv 2n=63, mis tähendab, et üks kromosoom on ilma paariliseta. Lisaks on kromosoomide struktuuris olulisi erinevusi. Siiski on tegemist fülogeneetiliselt lähedaste liikidega ning geneetilise materjali sarnasus vōimaldab ristandjärglaste saamist. Kōik isased järglased on steriilsed, kuid üksikuid teateid on olnud sigimisvōimelistest emastest ristanditest. Liikide ristamise abil on vōimalik selgitada täpsemalt liikidevahelisi evolutsioonilisi seoseid. Kirjandus F.W. Nicholas. Veterinary Genetics. Clarendon Press, Oxford, 1988, 2000 R. Teinberg. Põllumajandusloomade geneetika, Valgus, Tallinn, R. Teinberg. Põllumajandusloomade erigeneetika, Valgus, Tallinn, E. Wiesner, S. Willer. Veterinäärmedizinische Pathogenetik. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1974, 424 S.

55 Kontrollküsimused IV ptk kohta: Geneetilise anomaalia mõiste veterinaargeneetikas 2. Geneetiliste anomaaliate põhiliigitus (Wiesneri ja Willeri järgi) 3. Haiguse päriliku eelsoodumuse mõiste 4. Millised geneetilised anomaaliad on päritavas, millised mitte? 5. Letaalgeeni, morbiidgeeni, vitaalgeeni mõiste. 6. Penetrantsuse mõiste ja letaalgeenide liigitus sõltuvalt penetrantsusest. 7. Ekspressiivsuse mõiste. 8. Väärarendite fenotüübiline klassifikatsioon. 9. Ekstsess väärarendi mõiste 10. Lahkkaksikute klassifikatsioon 11. Liitkaksikute klassifikatsioon. 12. Defektgeeni otsene ja kaudne toime organi arengule 13. Somaatilise mutatsiooni mõiste 14. Geneetilise mosaiiksuse olemus 15. Mutatsioonide funktsionaalne liigitus 16. Autosoomse ja gonosoomse (e. suguliitelise) defekti mõiste 17. Millised translokatsiooni liigid on loomadel sagedasemad? Nende tekkemehhanism. 18. Milline on translokatsiooni mõju organismile? 19. Miks avastatakse loomadel vähe deletsioone? 20. Milline on duplikatsioonide mõju organismile? 21. Milline on inversioonide mõju organismile? 22. Milline sugukromosoomide aneuploidia vorm on enamlevinud? 23. Mis on sugukromosoomide aneuploidia tekkemehhanism? 24. Miks on autosoomide aneuploidiat leida nii vähe? Tooge näide. 25. Mis on tavaliselt euploidia tagajärjeks? 26. Nimeta eupolidia tekkemehhanisme (3)! 27. Mida ütled euploidia esinemissageduse kohta embrüotel ja sündinud isenditel? Kuidas kommenteerid? 28. Suguliitelise retsessiivgeeni pärandumine ja defekti fenotüübiline avaldumine 29. Autosomaalse dominantse defektgeeni pärandumine ja defekti fenotüübiline avaldumine 30. Suguliitelise dominantse defektgeeni pärandumine ja defekti fenotüübiline avaldumine 31. Autosomaalse retsessiivse defektgeeni pärandumine ja defekti fenotüübiline avaldumine 48

56 49 Ptk 4.3/ H-Y-antigeeni osa soomääratluses 2. Mis on eelduseks isassugunäärmete väljakujunemisele kudede diferentseerumisel? 3. Millest sõltub teiseste sootunnuste kujunemine. 4. Testikulaar feminisatsiooni olemus. 5. XX isase fenotüübi tekke põhjus 6. XY emase fenotüübi tekke põhjused 7. Sugukromosoomidega seotud aneuploidia tagajärjed. 8. Hermafrodiitsuse ja pseudohermafrodiitsuse mõiste. 9. Kes on frimartin, mis teda iseloomustab? 10. Kimäärsuse mõiste. 11. Frimartinismi põhjused. 12. Vererakkude kimäärsuse soost sõltumatud tagajärjed. 13. Vererakkude kimäärsuse mõju isasele isendile 14. Vererakkude kimäärsuse mõju emasele isendile 15. Frimartinismi diagnoosimine. 16. Mis on kromosomaalne interseksuaalsus? 17. Mis on gonaadne interseksuaalsus? 18. Mison fenotüübiline interseksuaalsus? 19. Mis on eelduseks liikidevaheliste ristandite saamiseks?

57 50 5. ÜKSIKU GEENI DEFEKTIST TINGITUD AINEVAHETUSHAIGUSED (BIOKEEMILINE GENEETIKA) Biokeemiline geneetika käsitleb pärilike haiguste biokeemilisi mehhanisme. Tegelikult on võimalik mistahes patoloogiline protsess "tõlkida" biokeemilisse "keelde". Biokeemiline geneetika tegeleb siiski kõige otsesemas mõttes organismi pärilike biokeemiliste anomaaliatega s.o. ensümopaatiatega ja rakuainevahetuse defektidega. Biokeemilise geneetika uurimisobjekti iseloomustab piltlikult joonisel 5.1. toodud skeem FnA FnB FnC FnD FnE funktsioonid A B C D E proteiinid a - b - c - d - e geenid Joonis 5.1. Biokeemilise geneetika uurimisobjekt Vaid väikese osa geneetiliste ensümopaatiate biokeemiline mehhanism on tuvastatud kõigis patoloogilise protsessi etappides. Ensümopaatiate diagnoosimisel on suurem tähtsus väikeloomade meditsiinis. Põllumajandusloomadel diagnoositakse puht praktilistel põhjustel ensümopaatiaid harva. Kõik tänaseks tuntud ensümopaatiad on tingitud geenmutatsioonidest. Mutatsioonid võivad esineda teoreetiliselt kõikides geenides. Tegelikult kõiki neid me ei avasta, kuna mõned elutähtsad funktsioonid nagu DNA ja RNA sünteesi defektsus on letaalsed ning selline gameet ei arene edasi sügoodiks ega lähe üle järgnevatesse arenguetappidesse. Teised letaalid aga põhjustavad surma loote hilisemas arenguastmes. Tavaliselt avaldub mutatsioon kas polüpeptiidis oleva aminohappe asendumisega teisega või

58 51 võimetusega üldse sünteesida vastavat polüpeptiidi. Kui sünteesub mutantne polüpeptiid, siis sellest tulenev funktsiooni häire võib olla väga erinev sõltuvalt sellest, kas peptiid asub ensüümi funktsionaalses tsentris või mujal. Sõltumata sellest kas funktsionaalne polüpeptiid on mutatsiooni tagajärjel kaotanud osa oma aktiivsusest või seda peptiidi üldse ei sünteesi, on tagajärg sama- vastava ensüümi defitsiit ja sellest tulenevalt vastava ensüümi poolt vahendatava füsioloogilise protsessi häire. Ühe metaboliidi defitsiit võib põhjustada vahel ka teise ülekülluse. Näiteks: kui reaktsiooniahelas A -> B -> C -> D osalevaid metaboliite kodeerivatest geenidest ühes tekib mutatsioon (olgu selleks geen c), siis vastavat peptiidi (C) ei sünteesita piisaval hulgal. Selle tagajärjel ei moodustu ka ahelas järgmist metaboliiti (D). Reaktsiooniahel blokeerub ning tekib vastava füsioloogilise talitluse häire. Samas metaboliiti B tekib ülekülluses, kuna protsessi seiskumise tõttu ei kasutata seda ära. Erinevate pärilike ensümopaatiate olemuse ja biokeemia paremaks mõistmiseks vaatleme mõnda neist lähemalt. 1) Kaasasündinud püruvaatkinaasi defitsiidist tingitud hemolüütiline aneemia: (esineb Basenji koertel). Biokeemiline protsess, milles esineb anomaalsus on anaeroobne glükolüüs erütrotsüütides, mille käigus moodustub ADP-st ATP. Protsessi normaalne kulg on järgmine: Glükoos (+ADP) ->...-> Fosfopüruuv hape--> Püruuvhape-> Piimhape (+ATP) Püruvaatkinaas Vt. ka ja

59 52 Skeemist selgub, et püruvaatkinaasi defitsiit põhjustab: 1) glükolüüsi puudulikkust, 2) fosfopüruuvhappe ja teiste ahelas eespool olevate vaheproduktide kuhjumise organismis, 3) mis kõige tähtsam- püruuvhappe ja piimhappe alaproduktsiooni ja sellega kaasneva ATP- vaeguse punalibledes. ATP-vaegus vähendab aga erütrotsüütide eluiga, mille tagajärjeks on hemolüütiline aneemia. Muud kliinilised tunnused on nõrkus, unisus, südame rütmihäired, tahhükardia, kahvatus jne. Tegemist on retsessiivse haigusega, st. kliinilised tunnused avalduvad defektse geeni suhtes homosügootsetel isenditel: haiged on dd, terved aga DD ja heterosügoodid Dd (Vt joonis 5.2 A). Seejuures on Dd isenditel PK aktiivsus ca 50 %. Sellest järeldub, et PK-aktiivsust silmas pidades on defektne geen kodominantne, kuna avaldab toimet ka heterosügoodil, kuid toime on osaline võrreldes homosügoodiga. Sellest tuleneb, et genotüüp ja fenotüüp ei ole üks-üheses vastavuses (üks geen - üks tunnus e. feen). Fenotüüp on suhteline mõiste ja sõltub sellest, mis tasandil me tunnuseid vaatleme. Antud juhul on meil PK-aktiivsuse suhtes kolm fenotüüpi: (1) PK-aktiivsus 100% (genotüüp DD); (2) PK- aktiivsus 50% (Dd); (3) PK-aktiivsus 0% (dd). Kliinilise haiguse suhtes on meil vaid kaks fenotüüpi: haiged (dd) ja terved (DD+Dd). Joonis 5.2. A B

60 53 2) Kaasasündinud lüsosomaalse katabolismi häired Lüsosoomid on rakumembraaniga seotud organellid, mis asuvad tsütoplasmas. Nad sisaldavad kataboolseid ensüüme, mis lõhustavad polümeere monomeerideks (aminohapeteks, nukleotiidideks, monosahhariidideks, lipiidideks). Kui mõne ensüümi produktsioon osutub defitsiitseks, kuhjuvad nendesse või mujale raku tsütoplasmasse vastava polümeeri varud. Kliiniliselt avaldub see haigus noorlooma aeglases kasvus, närvihäiretes. Haigus on progresseeruva iseloomuga ja lõpeb alati surmaga. Tänaseks on teada 11 erinevat lüsosomaalse katabolismi häiret, mille pärilik iseloom on tuvastatud. Majanduslikult kõige tähtsam neist on veiste mannosidoos Anguse tõul (oligosahhariidide kuhjumine). Põhjustab vasikate surma esimese eluaasta vältel. On olnud probleemiks Uus-Meremaal. Friisi tõugu veistel esineb GM 1 gangliosidoos. Põhjuseks on β-galaktosidaasi aktiivsuse langus 70-80% ja galaktoosi kuhjumine ganglioni rakkudesse. Kliinilised tunnused (tagajäsemete järelvedamine, liikumatus e. lamamine, lihaste pingulolek) ilmnevad esimestel elunädalatel. Vasikas sureb esimese eluaasta jooksul. Mikroskoopiliselt leitakse neuronite vakuolisatsiooni. On oluline veiste BSE diferentsiaaldiagnostikas, kuna vakuoolid on histoloogiliselt eristamatud BSE puhustest vakuoolidest. Vaid vakualisatsiooni lokalisatsioon (BSE puhul peaajus) ja haigete iga võimaldavad patomorfoloogiliselt eristada ühte haigust teisest. Chediak-Higashi haigus on naaritsate autosomaalne retsessiivne haigus. mis esineb harva ka hiirtel, kassidel, veistel, vaaladel ja inimesel. Iseloomulikud on pigmentatsiooni häired, millega kaasneb osaline albinism, suured graanulid leukotsüütides, kõrgenenud haigusvastuvõtlikkus ja varane surm. Närvihäired puuduvad. Retsessiivse geeni suhtes homosügootseil naaritsail, on karvkate spetsiifilise pigmentatsiooniga, mida nimetatakse Aleuudi tooniks. Aleuudi toon on olemuselt Chediak-Higashi haigusega kaasnev pigmentatsiooni defekt. Seega aretades Aleuudi tõugu naaritsaid selekteeritakse pidevalt loomi ka C-H haiguse geenide suhtes. Sellest tulenevalt on C-H haigus ka Aleuudi tõugu naaritsate seas äärmiselt levinud. C-H haigusega kaasneb loomade resistentsuse langus infektsioonide suhtes. Sellest tulenevalt täheldati ka Aleuudi haiguse (plasmotsütoosi) viiruse levikut esmalt vaid Aleuudi tõugu loomadel, kusjuures viiruse patogeensus oli äärmiselt kōrge. Tänapäeval, kus on teada, et Aleuudi haiguse viirus levib kõigi naaritsatõugude hulgas, on selgunud, et Aleuudi tõugu isendite suremus on nakatumise korral 5-8 korda suurem võrreldes teiste tõugudega.

61 54 (täiendavaks lugemiseks vt.: 3) Dermatosparaksis On sidekoe pärilik defektsus, mis esineb lambal ja veisel. Sellega kaasneb naha kärisemine (latseratsioon). On autosoomne retsessiivne haigus. Prokollageen-peptidaasi defitsiidi tagajärjel moodustub ebanormaalne prokollageen ja sellest kollageeni ei moodustu. Selle asemel moodustab prokollageen lamedaid, põimunud ribasid. (vt. Selle haigusega sarnase kliinilise pildiga on naaritsatel, koertel ja kassidel esinev naha asteenia (autosoomne dominantne haigus). Kuid antud juhul ei ole ilmselt tegemist ensümopaatiaga vaid kollageeni kiudude defektiga, mille tagajärjeks on nende liitumishäired. Kui esimesel juhul oli tegemist defektiga struktuurses geenis, mis kodeerib prokollageeni "töötlemist" reguleeriva ensüümi-peptiide, siis teisel juhul on tõenäoliselt tegemist kollageeni enda sünteesi kodeeriva struktuurse geeni defektiga. Nähtust, kus sarnaste kliiniliste tunnustega haigustel on erinev geneetiline taust ja biokeemiline mehhanism nimetatakse haiguse geneetiliseks heterogeensuseks (HGH). HGH on enamasti liikidevaheline, kuid võib olla ka liigisisene (viimasel juhul on haiguse etioloogia selgitamine väga keerukas). Piisavalt on alust arvata, et retsessiivsed haigused on seotud ensüümi defitsiitidega ja dominantsed haigused mitteensümaatiliste polüpeptiidide defektidega. Seda hüpoteesi kinnitab ka eeltoodud näide sidekoe defektidest. 4) Pärilikud hemofiiliad Vere hüübivus on seotud veresoonte seinte, trombotsüütide ja hüübivusfaktorite talitlusega. (vt. joonis ja Vere hüübimise protsess on keerukas biokeemiliste reaktsioonide ahel, milles osaleb arvukalt erinevaid proteiine ja ensüüme. Mõne teguri puudumine või talitluse häire põhjustab vere hüübimatuse.

62 55 Vaatleme siinkohal hüübivusfaktorite defitsiidiga seotud hemofiiliaid, kuna nende Pōhjuseks on sageli ühe geeni defekt. Loomadel on leitud geneetilise etioloogiaga hüübivusfaktorite defitsiite I, II, VII, VIII, IX, X, XI ja XII faktori osas. Suures enamuses avaldub heterosügootsetel isenditel haigus ka kliiniliselt, seda küll kergekujuliselt. Antud juhul on seega geeni toime "haiguse" kui tunnuse suhtes sama, mis "hüübivusfaktori" suhtes ning me võime öelda, et defektne geen on normaalse suhtes kodominantne. Kuna ükski loetletud faktoritest ei ole ensüüm, siis eelmises alalõigus tehtud üldistus peab ka antud juhul paika. Siiski on II, VII, X ja XI faktor ensüümide prekursoriteks, millest tuleb järeldada, et 50% prekursori kontsentratsioon organismis ei ole piisav kliiniliste tunnuste vältimiseks. Hüübivusfaktorite defitsiidiga seotud hemofiiliate hulka kuuluvad ka hemofiilia- A ja hemofiilia-b, mis on vastavalt seotud VIII ja IX faktori defitsiidiga. Need on retsessiivsed haigused, mistõttu heterosügootidel kliinilisi tunnuseid ei ilmne, vaatamata sellele, et neil ilmneb faktori kontsentratsiooni langus. Teine omapära on nimetatud haigustel see, et nad on suguliitelised haigused, mistõttu vaid emased võivad olla heterosügootsed ja seega kandjad ning isased on tabandunud X kromosoomi olemasolul alati haiged, või kui X kromosoom ei ole tabandunud, siis terved homosügoodid. Kahe viimase haiguse puhul tekib

63 56 küsimus, kuidas on võimalik, et mitteensümaatilise proteiini defektiga kaasnev haigus saab olla retsessiivne. Kuigi lõplikult on asi tänaseks selgitamata arvatakse, et mis puudutab hemofiilia-a-d, siis põhjus on selles, et faktor VIII on proteiin, mis reguleerib hüübimisprotsessi ja seda on vaja suhteliselt väikeses koguses, nii et piisab ka sellest, mida heterosügoot on võimeline produtseerima. Hemofiilia-B puhul võib kehtida sama reegel, kuid faktiline tõestusmaterjal selle kinnitamiseks ei ole piisav. 5) Kaasasündinud immuundefitsiidid Kuna immuunsuse geneetikat käsitleme eraldi peatükis, siis siinkohal esitame lühidalt vaid mõned põhimõtted antud küsimuses. Kõrgemate loomade immuunsüsteem jaguneb laias laastus kaheks: raku poolt vahendatud immuunsus (RVI) ja humoraalne, e. antikehadega seotud immuunsus. Joonisel 5.5. on esitatud lihtsustatud immuunsüsteemi skeem, kus on osutatud ka kohtadele, kus võib esineda defekte, mis takistavad immuunsuse väljakujunemist. Luuüdi tüvirakud 1 Lümfoidkoe eelrakud 2 3 Tüümus Kaudaal bursa või selle analoog T-rakud B-rakud 4 RVI Antikehadega seotud immuunsus Joonis 5.5. Lihtsustatud immuunsüsteemi skeem koos blokeeritud piirkondadega kaasasündinud immuundefitsiitide puhul.

64 57 Üheks paremini uuritud immuundefitsiidiks loomadel on Araabia hobustel esinev nn. kombineeritud immuundefitsiit (KID), mis on autosoomne retsessiivne haigus. Selle puhul puuduvad nii T kui ka B lümfotsüüdid, kuna blokeeritud on tüvirakkude areng (blokeering punktis 1). Kliinilisteks tunnusteks on lümfopeenia, Ig-defitsiit, RVI puudumine ja põrna ning lümfisõlmede väiksus. Varssadel ilmneb seetõttu vastuvõtlikkus infektsioonidele ja nad surevad esimese 5 elukuu jooksul. KID biokeemiline mehhanism ei ole selge. Analoogse haiguse põhjal inimestel võib oletada, et tegemist on puriini ainevahetuse defektiga. Immuundefitsiite on täheldatud ka veisel. Näiteks taani mustakirjul tõul esineb RVI puudulikkus (blokeerumine punktis 2). Haigust iseloomustab tüümuse alaareng. Tabandunud vasikad surevad esimese 4 elukuu jooksul. Taani punasel tõul on täheldatud selektiivselt erinevate Ig tüüpide defitsiite (kas Ig G või Ig M; blokeering punktis 4). Hobustel on aga leitud täielikku Ig-puudulikkust e. agammaglobuliineemiat (blokeering punktis 3). Enamik immuundefitsiite on harvad. Selle Pōhjuseks on defekti letaalsus, mis piirab defektse geeni levikut populatsioonis. Kontrollküsimused V ptk. kohta 1. Biokeemilise geneetika määrang ja uurimisobjekt. 2. Mis on ensümopaatiate pōhjuseks? 3. Kuidas mõjutab organismi funktsioone ensüümi kodeeriva geeni defekt, võrdlevalt nimetatud geeni "väljalangemisega"? 4. Organismis esineva metaboolse ahelreaktsiooni ühe metaboliidi defitsiidi võimalikud tagajärjed. 5. Fenotüüpide arv püruvaatkinaasi defitsidi puhul sõltuvalt haiguse kliinilisest avaldumisest ja püruvaatkinaasi aktiivsusest. Kirjelda fenotüüpe mõlemal juhul. 6. Lüsosomaalse katabolismi häirete olemus. Too näiteid. 7. Haiguse geneetilise heterogeensuse mõiste sidekoedefektide näitel. 8. Defektgeeni avaldumine sõltuvalt sellest kas ta kodeerib ensüüme või kudede struktuurseid proteiine. 9. Kuidas iseloomustada hüübivusfaktorite defitsiiti tingivate defektgeenide toimet normaalgeeni suhtes (enamasti)? 10. Mis on immuundefitsiit? Näited 11. Miks esineb pärilikke immuundefitsiite suhteliselt harva?

65 58 6. MULTIFAKTORIAALSED POLÜGEENSED PÄRILIKUD HAIGUSED. HAIGUSE PÄRILIK EELSOODUMUS Paljud haigused on nn. perekonnahaigused. See tähendab, et haiguse esinemissagedus teatud perekonnas on kõrgem kui populatsioonis keskmiselt. Haiguse "perekondlik iseloom" võib olla tingitud (1) ühesugustest elutingimustest e. keskkonnast või (2) mõnest patogeenist, mis antud perekonna liikmete seas levib (infektsioonide vertikaalne levik) või (3) ühistest geenidest või (4) on põhjuseks kolme loetletud tingimuse kombinatsioon. Eelmistes peatükkides kõneldud haiguste puhul on kerge vastata küsimusele, miks nad on perekonna haigused, kuna põhjuseks oli üksiku geeni defekt ja nende haiguste pärandumine allub Mendeli seadustele. Kuid on olemas rühm haigusi ja anomaaliaid, mis on selgelt perekondliku iseloomuga ka siis, kui kõigi keskkonnategurite mõju on välistatud, kuid ei allu Mendeli pärandumisseadustele. Sellistel puhkudel räägime haiguste multifaktoriaalsusest, polügeensusest ja pärilikust eelsoodumusest. Polügeensed fenotüübi anomaaliad Erinevate geenide koostoime tagajärjel tekkiv fenotüübi anomaalia on polügeenne defekt. Geenide koostoime võib olla kvalitatiivse või kvantitatiivse iseloomuga. Geenide kvalitatiivse koostoime puhul on igal geenil iseseisev selgesti avalduv toime. Niisugustel juhtudel esineb järglaskonnas kvalitatiivne lahknemine kooskõlas polügeense mendeleerumise reeglitega. Fenotüübitunnuse variatsioon on sellisel juhul määratud geenialleelide arvuga. Geenide fenotüübiline avaldumine, nende penetrantsus ja ekspressiivsus olenevad modifikaatorgeenide toimest. Modifikaatorgeenide toime eraldi on nõrk, kuid olles polümeerses koostoimes peamiste geenidega võivad tugevdada, piirata või täielikult alla suruda geeni toime. Geenide kvalitatiivse koostoimega on tavaliselt tegemist juhtudel, kui koostoimivate geenide arv on piiratud (oligogeensed tunnused). Näiteks melanogeneesi (pigmentatsiooni) geneetiline kontroll on tagatud polügeenselt, kus juures geenide koostoimel on kvalitatiivne iseloom. Veiste spastilise pareesi põhjuseks arvatakse olevat viie geenipaari komplementaarne toime. Kvantitatiivsel geneetilisel alusel põhinevad tunnused on määratud väga paljude erinevate geenide poolt ja üksiku geeni toime tunnusele on vaevumärgatav. Klassikalised kvantitatiivsed tunnused (e arvtunnused) on nii öelda mõõdetavad tunnused (pikkus, kaal jne.). Selliste tunnuste variatsioon

66 59 populatsioonis on statistilises mõttes pidev. See tähendab, et tunnuse väärtustele on iseloomulik lineaarsus (piisavalt suures populatsioonis on mistahes tunnuse väärtusega isendeid). Selliste tunnuste alusel jaotuvad populatsiooni loomad tavaliselt vastavalt normaaljaotusele. Loomade arv Tunnuse väärtus Joonis 6.1. Tunnuse x suhtes normaaljaotusele vastav populatsioon Kvantitatiivsed tunnused (seega ka fenotüübi anomaaliad) arenevad välja geenide polümeerses koostoimes ja üksikute geenide toime tunnusele on aditiivne e. summeeriv. See tähendab, et geenide toime tunnusele on samasuunaline. Lisaks sellele, et kvantitatiivsed tunnused on määratud paljude geenide poolt, mõjutab nende väljakujunemist ka keskkond. Geneetiliselt on määratud tunnuse potentsiaal (maksimaalne määr), keskkonna tingimustest sõltub mil määral seda potentsiaali kasutatakse tunnuse kujundamiseks. Geenide aditiivse koostoime tagajärjel kujunevate anomaaliate korral on iseloomulik, et tabandunud isendite hulgas on esindatud anomaalia erinevad raskusastmed. Kliinilisest seisukohast võib lihtsustatult öelda, et populatsioon jaotub skaalale väga terve-väga haige normaaljaotuse alusel. Näiteks nägemisvõime on tunnus, mida on suhteliselt lihtne mõõta. Populatsioonis on väga mitmesuguse nägemisvõimega isendeid ning teatud piirist alates räägime me nägemise puudulikkusest. Kvantitatiivsele tunnusele on iseloomulik, et keskmisele väärtusele lähedase tunnuse väärtusega isendeid on populatsioonis enam. Nii on ka selliste anomaaliate puhul kergema haigusvormiga isendeid rohkem kui raskema haigusvormiga isendeid. Eeltoodud näites oli meil tegemist olukorraga, kus geenide aditiivne toime tunnusele oli avaldus kõikidel isenditel. Enamiku fenotüübi anomaaliate puhul on meil aga tegemist olukorraga, kus

67 60 anomaalia avaldub alles siis, kui aditiivsete geenide hulk (anomaalia genetiline komponent) on kumuleerunud järglaskonnas teatud tasemeni. Sellisel juhul on tegemist geenide "lävidoosi" fenomeniga, mis fenotüübi anomaaliate seisukohast tähendab seda, et haigus avaldub vaid juhul kui isendi genotüübis on teatud hulk defektseid geene. Selliseid fenotüübi tunnuseid, mis kujunevad aditiivsete geenide kumuleerumisel teatud piirini nimetatakse lävitunnusteks (threshold trais). Lävitunnuste päritavus sarnaneb oligogeense tunnuse päritavusega, mille avaldumist mõjutavad modifikaatorgeenid. Seetõttu on sageli raske eristada oligogeenseid anomaaliaid polügeensetest anomaaliatest. Soodumus ja lävi Kuna kvantitatiivsel geneetilisel alusel kujunevad fenotüübianomaaliad on tugevasti mõjutatud keskkonna tingimustest, siis on just nende puhul kasutuses mõiste eelsoodumus. Hõlmamaks mõlemat selliste haiguste etioloogias tähtsust omavat komponenti genotüüp ja keskkonna tingimused, on Nicholas (1988) soovitanud kasutada mõistet soodumus. Ka mõiste haiguse lävi, omandab selles kontekstis laiema tähenduse Soodumuse kontseptsiooni paremaks mõistmiseks rakendame neid mõisteid esmalt monogeense defekti iseloomustamiseks. Olgu meil autosomaalse retsessiivse geeni poolt tingitud haigus. Seega kõik retsessiivse geeni suhtes homosügoodid e. kaksik-retsessiivid (dd) on haiged, kaksik-dominandid (DD) ja heterosügoodid (Dd) aga mitte. See haigus on "kõik või ei midagi" (dihhotoomse) tunnuse näide. Soodumuse kontseptsioonist lähtudes järeldub, et antud haiguse eelsoodumus on piisavalt kôrge haiguse avaldumiseks neil isenditel, kellel on kaks retsessiivset geeni (dd). Seega on antud haiguse soodumus määratud genotüübi poolt (mis on monogeensete defektide puhul ka tüüpiline). SOODUMUS-(LIABILITY)- geneetiliste ja väliste tegurite kompleks, mille mõju tagajärjel areneb isendil suurema või väiksema tõenäosusega välja haigus või defekt Mõiste lävi paremaks mõistmiseks vaatleme joonist 6.1. Näite puhul, kus haiguse soodumus oli

68 61 määratud genotüübiga, asetseb haiguse lävi piltlikult öeldes haigust põhjustava ja seda mitte põhjustavate genotüüpide vahel. % terved haiged lävi DD Dd dd Genotüüp Joon Haiguse soodumus ja lävi HAIGUSE LÄVI on patogeense(te) teguri(te) mõju selline tase, mille esinemisel haigus avaldub e. soodumuse aste, mis on piisav haiguse avaldumiseks. (Läve mõistet võib piltlikult kirjeldada ka kui organismi taluvusläve.) Meie näite puhul on patogeenseks teguriks retsessiivsed geenid genotüübis ja haiguse läveks on kahe retsessiivi (dd) esinemine. Mittetäielik penetrantsus ja haiguse lävi Võtame järgmiseks pisut keerulisema olukorra. Sigadel esineb monogeenne autosomaalne retsessiivne defekt MHS (ingl. k. malignant hyperthermia syndrome)- pahaloomulise hüpertermia sündroom e. sigade stressi sündroom. Sel puhul esineb sigadel kehatemperatuuri tõus, lihaste jäikus ja metaboolne atsidoos, mille tagajärjel loom lõpeb. Haigus avaldub sigadel tugeva stressi tagajärjel (laadimine ja transport). Seda saab esile kutsuda ka kunstlikult, halotaani aurude inhalatsiooniga. MHShomosügootsed sead reageerivad halotaanile 2 minuti jooksul tagajalgade lihaste jäigastumisega. Kui inhalatsioonil 3 minuti jooksul jäikust ei teki - klassifitseeritakse siga areaktiivseks e. MHS-resistentseks.

69 62 Kuid halotaantest annab ka vale-positiivseid ja vale-negatiivseid tulemusi. Ristluses haige x haige saadakse vaatamata sellele, et järglased on homosügootsed kaksikretsessiivid, 98% reaktiivseid ja 2% mittereaktiivseid isendeid. Seega on tegu olukorraga, kus kaksikretsessiividel dd on erinev soodumus. Joonis 6.3. selgitab antud olukorda piltlikult. % terved haiged lävi DD Dd dd dd Genotüüp Joon Genotüüpide jaotus osalise penetrantsuse korral. Joonisest ilmneb, et antud juhul genotüüp ei ole ainus tegur, mis määrab haiguse avaldumise, ehkki tal on oluline osakaal patogeensete faktorite seas. Juhtudel, kus haiguse pärandumises on vaid väike erinevus võrreldes üksiku geeni pärandumisega ja kus nende kõrvalekallete põhjused on ilmselt keskkonnalised (mitte geneetilised), on otstarbekas käsitleda selle haiguse pärandumist kui üksiku osalise penetrantsusega geeni pärandumist. Soodumuse multifaktoriaalne mudel Kasutame näitena koera puusaliigese düsplaasiat, mille tagajärjeks on iseeneslik puusaliigeste nihestumine ja invaliidsus. Haigust diagnoositakse varases staadiumis röntgenoloogiliselt arsti subjektiivse hinnangu alusel. Saksa lambakoeral on leitud, et ristluses haige x haige saadakse 86% haigeid järglasi. Labradoridel on haigete järglaste osakaal 63%. Seega, võttes aluseks eelmise mudeli mõisted, on retsessiivse (puusaliigese düsplaasia) geeni a penetrantsus labradoridel 63% aa-dest ja saksa lambakoertel 86%. Teisisõnu on labradoridel aa isenditest 63%-l soodumus piisavalt kôrge, et haigus avalduks ja 37%-l

70 63 piisavalt madal, et see ei avalduks. Antud olukorda võib graafiliselt kujutada järgmiselt: %. terved lävi haiged 37% 63% Soodumus Joon Soodumus ja lävi retsessiivse geeni osalise penetrantsuse korral. Puusaliigese düsplaasia väljakujunemist mõjustab hulk väliseid tegureid nagu näiteks treeningu ja söötmise tase looma kasvueas. Ületreenitutel ja ülesöödetutel avaldub haigus sagedamini. Lisaks sõltub haiguse avaldumine alati ka diagnoosimisest ning nagu eespool nimetatud, on haiguse diagnoosimine algstaadiumis subjektiivne. Seetõttu võib väärklassifitseerimine olla varieeruvuse allikaks haiguse registreerimisel aa-isenditel. Lisaks välistele teguritele mõjutavad düsplaasia kujunemist teised geenid, mis samuti reguleerivad puusaliigeste arengut. Eelnevat kokkuvõttes võime väljenduda, et puusaliigese düsplaasia on tingitud üksiku geeni retsessiivsest defektist, mille avaldumise soodumust homosügootidel (aa) mõjutavad mitmed välised ja geneetilised faktorid. Oluline on siinkohal mõista, et haigus avaldub vaid isenditel, kelle soodumus (geneetiliste ja väliste patogeensete tegurite koosmõju tase) on kõrgem kui lävi. Kuna antud näite puhul on defektse geeni avaldumine mõjutatud arvukatest teguritest, siis selle pärandumist ei ole praktiliselt võimalik kirjeldada mendelistliku pärandumise reeglite alusel. Seetõttu ei

71 64 ole otstarbekas ka kasutada üksiku geeni osalise penetrantsuse mõistet ja kontseptsiooni. Kui haiguse avaldumine on mõjutatud arvukate geneetiliste ja keskkonna tegurite poolt, siis on õigem käsitleda seda kui multifaktoriaalset haigust. Kui haigus on multifaktoriaalne, siis võime eeldada, et ka teistsuguse genotüübiga isenditel (AA ja Aa) võib haigus avalduda. Piltlikult näeks sel juhul meie graafik välja järgmine: a) % terved lävi haiged Soodumus. b) % terved lävi haiged Soodumus Joon Soodumus ja lävi multifaktoriaalse haiguse korral võrdlevalt lähtudes osalise penetrantsuse kontseptsioonist (a) ja multifaktoriaalsest mudelist (b) Multifaktoriaalse mudeli eelised selliste nähtuste seletamisel tulevad veelgi selgemalt esile, kui

72 65 vaatleme osalise dominantsusega geenide toimet. Sellisel juhul avaldub haigus juba olulisel osal heterosügootidest samuti, mis muudab genotüübi kasutamise lävitunnuse määrajana praktiliselt võimatuks. Multifaktoriaalse mudeli puhul on võimalik määratleda pärilikkuse teguri osakaal haiguse tekkes (teatud mõttes võib seda nimetada ka päriliku eelsoodumuse arvuliseks väljenduseks). Seda tehakse tunnuse päritavuse e. heritaabluse leidmisega. Käesolevas kontekstis käsitleme heritaablust kui tunnuse geneetilistest teguritest tingitud variatsioon populatsiooni koguvariatsioonis. Antud juhul on meil tunnuseks soodumus. Soodumuse variatsioon tähendab populatsiooni loomade erinevust soodumuse osas teatud anomaalia suhtes. Soodumuse heritaablus on loomade geneetilisest erinevusest tingitud soodumuse erinevuse proportsioon loomade soodumuse koguvariatsioonis. Kui soodumuses täheldatav variatsioon on tingitud ainult geneetilistest teguritest (st., kogu populatsiooni mõjutavad keskkonnalised tegurid on võimalik välistada), on haiguse soodumuse heritaablus 100%. Kui isendid on ühesuguse genotüübiga geenilookuse osas, mis peaks olema soodumuse põhjuseks, kuid soodumuses on täheldatav teatud varieerumine, siis soodumuse heritaablus on 0%. Neid äärmusi multifaktoriaalsete haiguste korral tegelikkuses muidugi ei esine. Tavaliselt on soodumuse päritavus vahepealne 0,05-0,6 e. 5-60%, mis näitab, et keskkonna faktorid mõjutavad soodumust oluliselt. Tunnus 2 Tunnus 1 Geneetilised faktorid Keskkonna tegurid

73 66 Mitme lävega haigused Mitme lävega haigustest räägime juhul, kui haigusel on selgelt määratletavad raskusastmednäiteks morfoloogilise defekti ulatus. Sellistel puhkudel on defekt seda raskem, mida suurem on soodumus. Ühtlasi on võimalik antud juhul määratleda mitu läve sõltuvalt defekti raskusastmest. Näiteks kaasasündinud persistentne arterioosjuha (PA) avaldub koertel kas juha osalise sulgumisena (PAO) või täieliku avatusena. Antud juhul võib eristada 2 läve. Tabandunud vanemate ristamisel saadakse järglasi järgmiselt: Ristamise viis Järglaskond Normaalsed (N) PAO PA PA X PA 17% 17% 66% PA X N (I astme PA 33% 22% 45% sugulane) * PA X N 78% 12% 10% *Esimese astme sugulased on vanemad ja täis õved e. sibs'id e. õed-vennad Toodud andmed illustreerivad ilmekalt mitme lävega haigustele omaseid seaduspärasusi: 1) Tabandunud järglaste saamine normaalsetelt vanematelt on (nii sageduse kui defekti raskuse poolest) sõltuvuses sellest, kui lähedases suguluses on vanemad tabandunud isendiga. 2) Defekti raskus on sõltuvuses soodumusega seotud geenide "doosist", mille isend omandab vanematelt 3) Defekt on sagedasem ja raskem raskemaastme defektiga tabandunud isendite sugulastel. Kokkuvõtteks perekonnahaigustest 1) Haigestumuse kordaja Lihtne ja tõhus meetod haiguse päritavuse selgitamiseks on haigestumuse võrdlemine haige indiviidi perekonnas ja populatsioonis tervikuna. Meetod on kõige sobivam muidugi "kõik või mitte midagi" haiguste puhul. See seisneb haigestumuse suhtarvu arvutamises: haigete isendite sagedus haigete sugulastel haigete sagedus kogupopulatsioonis.

74 67 Haigestumuse suhtarvu väärtus võib olla teoreetiliselt mistahes arv, mis on nulli ja lõpmatuse vahel. Dominantsed ja retsessiivsed monogeensed haigused on suhteliselt harvaesinevad kogupopulatsioonis (0,001-0,1%), kuid haige lähisugulaste hulgas on need väga kôrge sagedusega (haigestumuse suhtarv: ). Multifaktoriaalsed haigused seevastu on populatsioonis tervikuna sagedamini ettetulevad (0,05-1%), kuid haige lähisugulastel suhteliselt väiksema sagedusega (haigestumuse suhtarv: 5-100). 2) Päritavus e. heritaablus. Päritavuskoefitsient- h 2 Heritaablus laiemas mõistes kujutab endast geneetilise determineerituse astet. Seda saab kasutada nii monogeensete kui polügeensete ja multifaktoriaalsete haiguste puhul (vt. eestpoolt ja joonis 6.6). Joonis 6.6. Heritaablus laiemas mõistes Kitsamas mõistes näitab heritaablus millisel määral kandub tunnus edasi vanematelt järglastele. Teisisõnu, ta näitab, kuivõrd sugulased teineteisega sarnanevad. Lihtne moodus sugulaste sarnasuse leidmiseks on teha seda haigestumuse suhtarvu kalkuleerimise abil. Kui kitsamas mõttes heritaablus=0, siis haigus ei ole sugulaste hulgas sagedasem kui kogu

75 68 populatsioonis tervikuna ja haigestumuse suhtarvu väärtus on 1. Kui heritaablus kitsamas mõttes on 100%, siis haigestumuse suhtarv on oluliselt suurem kui 1 ning sugulaste sarnasuse määrab nende ühiste geenide proportsioon, mida mõõdetakse korrelatsioonikoefitsiendiga r. Esimese astme sugulastel r = ½; teise astme sugulaste puhul (poolõved; vanavanemad ja lapselapsed) r = ¼ jne. Heritaabluse kalkuleerimine sugulastevahelise korrelatsiooni ja haigestumuse suhtarvu alusel on matemaatiliselt keeruline ja ei kuulu meie huviorbiiti. Oluline on aga tulemus, mis sellest kalkulatsioonist saadakse. See on esitatud joonisel 6.7. Joonisel esitatud diagrammi kasutades on võimalik heritaablus (kitsamas mõistes) leida teades haigestumust lähisugulastel ja kogupopulatsioonis. Haigestumuse suhtarv Joonis 6.7. Kogupopulatsiooni haigestumuse ja õvede suhtelise haigestumuse suhe mõnede pärilike defektide ja haiguste puhul inimesel (Nicholas, 1987)

76 69 Kokkuvõtteks oluline on meeles pidada, et kui haiguse heritaablus on suurem kui 0, on võimalik selle esinemissagedust vähendada selektsiooni abil. Mida suurem on heritaablus, seda suurem on ka selektsiooniefekt.

77 70 Kontrollküsimused VI ptk. kohta 1. Perekonnahaiguse mõiste. 2. Mis võivad olla haiguse perekondliku iseloomu põhjusteks? 3. Haiguse sageduse mõiste. 4. Geenide kvalitatiivse koostoime olemus 5. Mis määrab tunnuse variatsiooni populatsioonis geenide kvalitatiivse koostoime korral? 6. Mis on modifikaatorgeenid? 7. Geenide kvantitatiivse koostoime olemus 8. Milline on geenide koostoime iseloom kvantitatiivse koostoime korral? 9. Kvantitatiivse fenotüübitunnuse mõiste 10. Milline on kvantitatiivsete tunnuste variatsioon populatsioonis? 11. Millest sõltub kvantitatiivsete tunnuste avaldumine? 12. Mis iseloomustab aditiivsel kvantitatiivsel geneetilisel alusel kujunevaid fenotüübianomaaliaid? 13. Lävitunnuse mõiste 14. Haiguse soodumuse mõiste. 15. Haiguse lävi (mõiste). 16. Multifaktoriaalse haiguse mõiste. Too näiteid. 17. Kuidas jaotuvad defektgeeniga isendid kliiniliselt tervete ja haigete rühma defektgeeni mittetäieliku penetrantsuse korral? 18. Kuidas jaotuvad kogu populatsiooni isendid kliiniliselt tervete ja haigete rühma multifaktoriaalse haiguse puhul (puusaliigese düsplaasia näitel). 19. Mille poolest erineb osalise penetrantsusega geeni poolt põhjustatud ja multifaktoriaalse haiguse avaldumine eri genotüüpidega isendeid silmas pidades? 20. Millised on mitme lävega haigused? Kuidas on seotud soodumus ja haiguse raskusaste? 21. Mis on pärilik eelsoodumus haiguse soodumuse kontseptsioonist lähtuvalt? 22. Heritaablus laiemas mõistes. 23. Heritaablus kitsamas mõistes. 24. Haigestumuse suhtarvu kalkuleerimine. Mida see näitab? Mida on võimalik selle alusel määrata? 25. Millisel juhul on võimalik haiguse esinemissagedust populatsioonis muuta selektsiooni teel? 26. Milline on prognoos selektsiooni efekti suhtes sõltuvalt tunnuse heritaablusest?

78 71 7. PÄRILIKE HAIGUSTE GENEETILINE JA VÄLINE KONTROLL 7.1. PÄRILIKE DEFEKTIDE LEVIK POPULATSIOONIS Selleks, et olla võimeline diagnoosima ja hiljem ka pärilikke haigusi tõrjuma, peab tundma seaduspärasusi, mis määravad defektsete geenide levikut populatsioonis. Populatsioon- ühte liiki kuuluvate ja omavahel vabalt paaruvate isendite kogum teatud territooriumil, mis on eraldatud teistest sama liigi isendite kogumitest mõne isolatsioonivormiga. Populatsiooni üheks oluliseks tunnuseks on suhteline püsivus. Populatsioon säilib antud territooriumil küllalt pikka aega so palju põlvkondi. Oluliseks tunnuseks on ka isendite populatsioonisisene vaba paarumine panmiksis, mille aste võib periooditi varieeruda, kuid on populatsioonisiseselt alati suurem kui populatsioonidevaheliselt Geeni- ja genotüübisagedus Genotüübisagedus on teatud genotüübi osakaal kõigi antud alleeli genotüüpide hulgas, mis populatsioonis esinevad. Sarnaselt genotüübisagedusele on võimalik leida ka geenisagedus. Selleks tuleb leida huvipakkuvate geenide arv populatsioonis ja arvutada selle osakaal analoogsete geenide koguhulgas. Geenisageduse arvutamine genotüübisageduse põhjal: h q= r , kus 2 q- geenisagedus r- homosügootse genotüübi sagedus h- heterosügootse genotüübi sagedus Geeni- ja genotüübisagedusi võib selliselt kalkuleerida mistahes loomarühma kohta. Kõige paremini kehtib see meetod aga selliste loomarühmade puhul, kus toimub loomade juhuslik ristumine ning loomadel on seetõttu teatud hulk ühiseid geene, mis päranduvad vastavalt Mendeli seadustele. Sellisteks loomarühmaks võib olla nii liik tervikuna kui üks tõug, kari või väiksem loomarühm karja sees, kus toimub loomade vaba ristumine. Siinjuures oluline märkida: geneetiliste defektide suhtes on ristumine peaaegu alati

79 72 juhuslik e. vaba. Eelkirjeldatud meetodil geeni- ja genotüübisageduste määramine on lihtne sel juhul, kui igale genotüübile vastab kindel fenotüüp (st. uuritav geen on kodominantne). Kui tegu on retsessiivse geeniga, siis heterosügoodid homosügootsetest kaksikdominantidest ei erine. Sellistel puhkudel tuleb rakendada kaudseid meetodeid geenisageduste määramiseks. Lähtutakse Hardy-Weinbergi geneetilise tasakaalu seadusest, mis ütleb, et: p² + 2pq + q² = 1 ehk (p + q)²=1, kus: p- dominantse alleeli sagedus; q- retsessiivse alleeli sagedus. Tähendab, et: Panmiktilises populatsioonis, mis on geneetilise tasakaalu seisundis, püsivad geeni- ja genotüübisagedused põlvkonniti konstantsed. Valemi tuletus: Ristamisel võivad kohtuda erinevate alleelidega gameedid järgmiselt: Spermid Munarakud p q p p x p p x q q q x p q x q Seega vastavad p² ja q² ja pq sisuliselt genotüübisagedustele. Siit tulenevalt, teades homosügootse genotüübi sagedust, on meil võimalik leida toodud valemi abil teise alleeli ja ka ülejäänud genotüüpide sagedused. Kui meil on tegemist retsessiivse defektiga, mille sagedus populatsioonis on: q²= 0,25% e. 0,0025. Siis vastava geeni sagedus on populatsioonis: q= 0,0025 = 0,05. Seega normaalse alleeli sagedus on:

80 73 p= 1-0,05 = 0,95 Siit järeldub, et kaksikdominantse genotüübi sagedus populatsioonis on: p²= 0,9025 Ja siit omakorda, et heterosügootse genotüübi sagedus on: 2pq= 1-0,9025-0,0025= 0,095 e. 2 x 0,05 x 0,95 = 0,095 Pannes toodud avaldiste tulemused taas H-W valemisse tagasi näeme, et tulemuseks on 1. Juuresolev joonis demonstreerib, kuidas on seotud alleelisagedus ja genotüübisagedus lihtsa dialleelse tunnuse korral. Joonis 7.1. Geenisageduse ja genotüübisageduse vaheline seos Eeltoodu põhjal on võimalik teha mõningaid üldistusi, mida on oluline arvestada pärilike defektide leviku hindamisel: 1) Panmiktilises populatsioonis on teatud genotüübiga isendite ristumise tõenäosus võrdne vastavate genotüüpide sageduste korrutisega. 2) Järglastel esinev genotüübisagedus on määratud vastava geeni sagedusega vanempõlvkonnas. Homosügootide sagedus on võrdne vastava geenisageduse ruuduga. Heterosügootide sagedus on võrdne vastavate geenisageduste kahekordse korrutisega. 3) Järglastel esinev geenisagedus on võrdne vanematel esineva geenisagedusega. Siinkohal tuleb taas korrata, et nimetatud seaduspärasused kehtivad täielikult ideaalses

81 74 panmiktilises populatsioonis, mis on piisavalt suur ja kus ei esine geenisageduse muutusi. Reaalsed populatsioonid ei vasta kõigile neile tingimustele, mistõttu võib näha küllaltki suuri kõrvalekaldeid toodud seaduspärasusest, mistõttu Hardy-Weinbergi valemi abil kalkuleeritud geeni- ja genotüübisagedused on nö. eeldatavad sagedused ja kehtivad teatud tõenäosusega. Juhtudel, kus on võimalik fenotüübiliselt eristada homo- ja heterosügootseid isendeid, on võimalik leida tegelikkuses esinevad geenisagedused fenotüübi alusel. Seejärel on võimalik kasutades Hardy-Weinbergi valemit kalkuleerida eeldatavad genotüübisagedused ning võrrelda neid reaalselt eksisteerivatega. Sellega me hindame populatsiooni geneetilise struktuuri vastavust Hardy-Weinbergi proportsioonidele. Erinevusi hinnatakse statistiliselt χ² testiga, mille valemiline väljendus on järgmine: χ 2 =Σ(t-e) 2 / e kus t- tegelik genotüübisagedus e- eeldatav genotüübisagedus Erinevuste statistilist olulisust iseloomustab χ² väärtuse p-väärtus, mille annab meile vastav tabel või arvutiprogramm. Juhul kui statistiline analüüs ütleb meile, et tegelik populatsiooni struktuur vastab Hardy- Weinbergi proportsioonidele, siis võime deklareerida, et: 1) uuritava geenilookuse suhtes toimib populatsioonis juhuslik ristumine; 2) antud lookuse suhtes ei toimu selektsiooni, geenide migratsiooni, muteerumist ja juhuslikku geenitriivi. Kuna enamiku fenotüübiliste tunnuste suhtes (ka geneetilised defektid) toimib juhuslik ristamine, siis ka enamike populatsioonide geneetiline struktuur on lähedane Hardy-Weinbergi proportsioonidele. Hardy-Weinbergi seaduse kehtivus laieneb ka: 1) Rohkem kui kahe alleeli poolt määratud tunnustele: Kui p, q ja r on teatud lookuse alleelisagedused populatsioonis, siis genotüübi sagedused on vastavalt p², q², r², 2pq, 2pr, 2qr. Alleelide arvule vastavalt võib seda rida pikendada lõputult. 2) Suguliitelistele tunnustele: Sugu on selline tunnus, mille suhtes ristamine ei ole juhuslik. See tähendab, et ristuda saavad

82 75 vaid kaks eri sugupoole genotüüpi omavat isendit. See tekitab esmapilgul pisut segadust. Kuna isastel on ainult üks X-kromosoom, siis suguliiteliste alleelide sagedus vastab genotüübisagedusele ja samuti fenotüübisagedusele. Emaste puhul toimib kõik vanaviisi, kuna neil on võimalikud kolm genotüüpi. Kalkuleerides genotüübisageduse alusel geenisagedused ilmneb tegelikkuses, et see on väga lähedane emastel ja isastel isenditel. Erinevused ilmnevad tunnuse fenotüübilisel avaldumisel eriti retsessiivsete tunnuste korral. Kuna isastel on vaid üks X-kromosoom, siis vastava alleeli olemasolu isasel isendil tähendab koheselt ka tunnuse avaldumist, mistõttu tunnus avaldub isastel sagedamini kui emastel (emastel avaldub homosügootidel). Isastel on homosügootse genotüübi sagedus q ja emastel q². Matemaatiliselt väljendatuna aga: q>q². Näiteks: kui q=0,1, siis q²=0, Selektsiooni ja mutatsiooni mõju geeni- ja genotüübisagedusele populatsioonis Reaalsed populatsioonid on allutatud mitmetele mõjuritele, mis muudavad neis geeni- ja genotüübisagedust. Seejuures on selektsioon (nii kunstlik kui looduslik valik) üks tähtsamatest. Selektsioon toimib fenotüübi kaudu ja üldistatult võib öelda, et eelistatud on välistele tingimustele fenotüübiliselt paremini kohastunud isendid. Selektsiooni tasakaalustavaks nähtuseks mitmeski mõttes on mutatsioonid. Mutatsioonide abil taastoodetakse alleele, mis selektsiooni teel võivad olla populatsioonist elimineeritud. Joonis 7.2. Populatsiooni geenisagedust mõjutavad tegurid mutatsioon, migratsioon ja selektsioon

83 76 1) Selektsioon dominantse letaalgeeni vastu Dominantse letaalse geeni suhtes toimib negatiivne selektsioon, mis viib vastava geenisageduse kiirele vähenemisele kuni kadumiseni. Seda protsessi tasakaalustab mutatsiooniline muutlikkus, mille tulemusena toimub pidevalt vastava letaalse defekti taasproduktsioon populatsioonis. Seega eksisteerib selektsiooni-mutatsiooni tasakaal. Olukorras, kus letaalse geeni suhtes toimib täielik selektsioon, on selektsiooni- ja mutatsioonirõhu tasakaalu tingimustes letaalse geeni sagedus (p) populatsioonis võrdne antud alleeli mutatsioonisagedusega (mutation rate µ) ühes põlvkonnas (p=µ) Teisi sõnu, on dominantse letaalgeeni minimaalsagedus populatsioonis võrdne mutatsioonisagedusega. Mutatsioonisagedus on geenides tavaliselt väga madal 1: : isendi kohta põlvkonnas, siis on selge, et tasakaalu puhul on dominantse letaalgeeni sagedus samuti üsna madal. Sellest tulenevalt on homosügootsete dominantide esinemissagedus praktiliselt 0, mistõttu võime öelda, et mutantse geeni sagedus võrdub 1/2 heterosügootse genotüübi sagedusest (p=2pq/2). Kuna dominantne geen avaldub fenotüübiliselt juba heterosügootidel, siis võime öelda, et letaalse fenotüübi (P) sagedus võrdub kahekordse letaalgeeni sagedusega (P=2p), mis tähendab omakorda, et fenotüübisagedus on võrdne kahekordse mutatsioonisagedusega (P=2µ). 2) Mitteletaalse dominantse defektgeeni vastu suunatud selektsioon Mitteletaalse dominantse defektgeeni vastu suunatud selektsioon toimib aeglasemalt kui täieliku penetrantsusega letaaldefekti puhul. Geeni vastu suunatud selektsiooni kiirust mõõdetakse põlvkondade arvuga, mis on vajalik geenisageduse vähendamiseks populatsioonis teatud ühiku võrra. Geenisageduse muutumist populatsioonis mitteletaalse defekti korral mõjutavad: a) selektsioonirõhk, mida väljendab selektsioonikoefitsient s b) dominantse geeni sagedus (p) vaatlusperioodi alguses. s on tõenäosus, millega teatav genotüüp ei osale järgmise põlvkonna moodustamisel (väärtus: 0 1). Geenisageduse muutumist ühes põlvkonnas saab väljendada järgmise valemiga: p= -sp(1-p)²/{1-sp(2-p)}. Sõltuvalt s väärtusest on vajalik erinev arv põlvkondi geenisageduse vähendamiseks. Mitteletaalset dominantset defektgeeni ei elimineerita populatsioonist koheselt, vaid osa selle

84 77 kandjatest osaleb ka järgneva põlvkonna moodustamisel, mistõttu populatsioonis on erineva päritoluga defektgeene- mutatsiooniga tekkinud ja pärandunud geenid. Selles olukorras on mutatsiooni- ja selektsioonirõhu tasakaal väljendatav seisundina, kus populatsiooni ilmuvate uute mutantsete defektgeenide arv võrdub selektsiooni tõttu väljaviidavate geenide arvuga. Mida nõrgem on defektgeeni mõju fenotüübi kohastumusele, seda väiksem on s ja seda suurem on tasakaalu seisundist sõltuv minimaalne geenisagedus populatsioonis. Näiteks kui fenotüübiline kohastumus väheneb 50% on minimaalne (tasakaalu) geenisagedus kaks korda suurem dominantse letaalgeeni sagedusest. Kui kohastumus väheneb vaid 10% on see 10 korda suurem letaalgeeni sagedusest. Suurendades selektsioonirõhku tunnusele (geenisagedusele) saab efektiivselt vähendada ebasoovitava dominantse geeni sagedust ja vastava fenotüübi sagedust populatsioonis. Tugeva selektsiooniga (s=1) on võimalik selline geen populatsioonist elimineerida. Sellisel juhul vastab dominantse geeni sagedus populatsioonis geeni mutatsioonisagedusele (vt. eespool) ning vastava fenotüübi sageduse saab arvutada valemiga P= 2µ/s. Näiteks kollane karvavärvus labradori tõugu koertel, sarved lehmadel on saavutatud dominantse geeni vastu suunatud selektsiooniga. 3) Selektsioon retsessiivse geeni vastu Retsessiivne geen avaldub fenotüübiliselt ainult homosügootidel. Teostades selektsiooni fenotüübi alusel ei ole võimalik retsessiivgeeni populatsioonist elimineerida, kuna heterosügoodid säilivad ja osalevad järgnevate põlvkondade moodustamisel. Retsessiivse geeni sageduse muutust ühes põlvkonnas väljendab valem: q= -sq²(1-q)/(1-sq²) Valemit kasutades on võimalik kalkuleerida põlvkondade arv, mis on vajalik geenisageduse viimiseks miinimumini sõltuvalt selektsioonirõhust (s) ja geenisagedusest. Seda kirjeldab ka alljärgnev joonis: q Joonis 7.3. Selektsioon retsessiivse geeni vastu

85 78 Retsessiivse geeni vastu suunatud selektsiooni korral valitseb seaduspära, et homosügootsete retsessiivide elimineerimisel suureneb proportsionaalselt heterosügootsetes isendites peidus olevate retsessiivsete geenide osakaal populatsioonis. Seetõttu on geenisageduse vähendamine homosügootsete retsessiivide elimineerimise abil alates teatud geenisageduse tasemest praktiliselt võimatu. See on võimalik ainult juhul, kui on võimalik heterosügootsete isendite avastamine ja nende elimineerimine populatsioonist. Pidades silmas retsessiivsetest geenidest tingitud fenotüübi anomaaliate vältimist ei ole seda aga ilmtingimata vaja teha. Kuna anomaalia avaldub vaid homosügootidel, siis on vaid vaja vältida heterosügootide vahelisi ristamisi. Ristates heterosügooti dominantse homosügoodiga haigeid järglasi ei saada. Seega on heterosügootsete isendite avastamine vajalik, kuid sellega ei välistata heterosügootide kasutamist aretuses. Kui heterosügootseid isendeid populatsioonist ei elimineerita ja elimineeritakse ainult homosügoodid, siis selektsiooni mutatsiooni tasakaalust tulenev minimaalne geenisagedus (q) on kalkuleeritav valemiga q= (µ/s) ja vastava fenotüübi (Q) minimaalne sagedus on võrdne Q=µ/s. Arvestades seda, et µ väärtus on väga väike, siis on ilmne, et ka väikese selektsioonirõhu juures on selektsiooni mutatsiooni tasakaalust tulenev minimaalne geenisagedus populatsioonis väga madal. Kui heterosügootsed isendid populatsioonist elimineeritakse koos retsessiivsete homosügootidega on meil tegemist analoogse olukorraga nagu dominantse geeni puhul, kus nii homosügootse kui heterosügootse fenotüübi suhtes s=1 ja kõik mutatsiooni tagajärjel populatsiooni ilmuvad geenid elimineeritakse koheselt ning minimaalne geenisagedus populatsioonis võrdub mutatsioonisagedusega µ. Kui me tuvastame heterosügoote, kuid ei elimineeri neid populatsioonist vaid kasutame neid paarituses dominantsete homosügootidega, siis pärast retsessiivsete homosügootide elimineerimist populatsioonist edasi otsest retsessiivse geeni vastast selektsiooni ei toimu ning selle sagedus hakkab vähehaaval populatsioonis kasvama. Siiski, on see kasv vaevumärgatav ning ei avalda geenisagedusele olulist mõju sadade generatsioonide vältel. 4) Heterosügoote soosiv selektsioon Heterosügoote soosiv selektsioon leiab aset, kui heterosügootse isendi kohastumus on suurem kui homosügootsetel isenditel. Paremat kohastumust esineb ka defektgeenide suhtes heterosügootsetel isenditel. Arvatakse, et see on seotud geenide pleiotroopsuse ja aheldumisega. Heterosügoote soosivale selektsioonile viitab teatud geenialleeli eeldatust suurem sagedus populatsioonis, eriti kui on tegemist

86 79 alleeliga, mille puhul homosügootsus tingib isendi kohastumuse vähenemise. Koduloomade populatsioonides võib heterosügoote soosiv selektsioon olla tingitud sellest, et defektgeen on seoses mõne inimese poolt aretatava tunnusega. Holstein-friisi tõugu veistel esineb varvaste liitumine, ja köntjalgsus mis on retsessiivsed letaalsed defektid. Arvatakse, et nimetatutd defektsete alleelide suhtes heterosügootsete isendite piimatoodang ja piima rasvasisaldus on kõrgem kui teistsuguse genotüübiga isenditel, mis tingib nende valikut aretuseks. Sigade stressisündroomi geeni kandvate sigadel on tailiha osakaal rümbas suurem kui teistel genotüüpidel. Kuid heterosügoote soosiv selektsioon toimib ka loodusliku valiku korral. Inimese puhul võib näiteks tuua tsüstilise fibroosi, mille põhjuseks oleva alleeli suhtes heterosügootsed isendid osutusid ilmselt vastupidavamaks kooleratekitajatele, mistõttu maades, mida laastasid koolera epideemiad 19. sajandil on tänapäeval tsüstilist fibroosi põhjustava alleeli sagedus ebaproportsionaalselt kõrge. Heterosügoote soosiva selektsiooni korral on selektsioonirõhk suurem selle alleeli suhtes, mille suhtes homosügoodi kohastumus väheneb rohkem. Et aga heterosügoodi kohastumus on kõrgem ka dominantsest homosügoodist, siis defektgeeni minimaalne geenisagedus populatsioonis on palju suurem võrreldes tavalise retsessiivse geeni sagedusega, mille vastu toimib selektsioon. 5) Heterosügootide vastu suunatud selektsioon Esineb ka olukordi, kus heterosügootsetel isenditel on madalam kohastumus võrreldes nii dominantsete kui retsessiivsete homosügootidega. Sellisel puhul on samuti populatsiooni geenisagedused eeldatust oluliselt erinevad ja iseloomulik on geenisageduste ebastabiilsus põlvkonnast põlvkonda. Selle põhjuseks on asjaolu, et selektsiooni tulemusena viiakse iga heterosügoodiga populatsioonist välja võrdne arv dominantseid ja heterosügootseid alleele, see aga vähendab proportsionaalselt rohkem selle alleeli sagedust, mida populatsioonis on vähem. Ühtlasi viib see suurema sagedusega alleeli kinnistumisele populatsioonis Muud geeni ja genotüübisagedust mõjustavad tegurid 1) Juhuslik geenitriiv Juhuslik geenitriiv tuleneb sellest, et mõnel juhul kõik genotüübid ei ole esindatud antud loomarühmas või ei vasta genotüübisagedused Hardy-Weinbergi seadustele, mistõttu ristamistel domineerivad teatud genotüübid. Juhuslik geenitriiv on põhiliselt väikeste populatsioonide häda. Mida väiksem populatsioon, seda suurem on geenitriivi jõud populatsiooni geneetilise struktuuri mõjutamisel.

87 80 Joonis 7.4 Juhusliku geenitriiviga seondub ka nn. loomise efekt (founder effect) populatsiooni geenisagedusele. Nimelt, kui väikese isendite arvu baasil luuakse uus populatsioon, siis selles isendite rühmas ei ole ilmselt esindatud kõik genotüübid samades proportsioonides, kui lähtepopulatsioonis, samuti on erinevad ka geenisagedused. Sel moel kinnistuvad uues populatsioonis geenisagedused, mis oluliselt erinevad lähtepopulatsiooni omast ning need kaks populatsiooni kaugenevad ajas teineteisest geneetiliselt. Juhusliku geenitriivi tulemusena võivad kaduda populatsioonist teatud geenid või kinnistuda lähtepopulatsioonis harvaesinenud geenid. 2) Immigratsioon Immigratsioon võib olla oluline tegur defektgeenide levimisel ühest populatsioonist teise. Immigratsiooni mõjutab tugevamini väikeste populatsioonide geneetilist struktuuri. Looduslikes populatsioonides toimub isendite vahetus lähestikku asuvate subpopulatsioonide vahel. Sel moel toimub sujuv populatsioonide geenisageduste ühtlustumine Inbriiding (sisearetus) Inbriiding mõjutab genotüübisagedust populatsioonis. Ta soodustab alleelide, sealhulgas mutantsete geenide homosügotiseerumist ja seega ka retsessiivsete defektgeenide fenotüübilist avaldumist populatsioonis. Seejuures tuleb rõhutada, et homosügotiseerumise tulemusena

88 81 geenisagedused populatsioonis ei muutu, vaid geenid jaotuvad ümber homosügootsetesse genotüüpidesse. Populatsiooni homosügotiseerumise kiirust inbriidingu puhul iseloomustab inbriidingu koefitsient (F). Inbriidingu koefitsiendi kalkuleerimist vaata Teinberg 1978 (Põllumajandusloomade geneetika lk. 231). Retsessiivgeenidest tingitud pärilike anomaaliate esinemissagedus suureneb F suurenemisega peaaegu lineaarselt. F suurenemisega väheneb loomade eluvõime, viljakus ja halveneb jõudlus tervikuna. Sellist nähtust nimetatakse inbriidingdepressiooniks. Inbriidingu negatiivne toime oleneb lähtepopulatsiooni genofondist. Kui inbriidinguks kasutatavatel isenditel geenidefekte pole, siis inbriidingu depressioon ka koheselt ei avaldu. Kuna defektgeenid tekivad paratamatult mutatsioonide tagajärjel, siis pikas perspektiivis avaldub inbriidngdepressioon teataval määral igas populatsioonis, mis on allutatud inbriidingule. Samas on teatud puhkudel täheldatav inbriidingdepressiooni nõrgenemine mõni aeg pärast inbriidingu alustamist populatsionis. Nimelt võib tekkida olukord, kus tugeva inbriidingdepressiooni tagajärjel praagitakse vähemeluvõimelised genotüübid populatsioonist välja, ning järgi jäänud eluvõimelisemate isendite ristamisel inbriidingdepressioon järglaste hulgas ei ole enam nii tugev. Inbriidingdepressiooni aitab vähendada range selektsioon, mis tähendab, et loomade inbred liinide aretamisel valitakse paarituseks vaid kõige elujõulisemad ja kõrvalekalleteta isendid. Põllumajandusloomade kunstliku seemenduse korral kasutatakse populatsiooni taastootmisel suhtelist väikest arvu isaseid isendeid. Samas on isaste arv reeglina piisavalt suur, et inbriidingu koefitsient põllumajandusloomade populatsioonides ei suurene. Inbriidingukoefitsiendi suurenemine järgmises põlvkonnas kalkuleeritakse valemiga: F=1/2 Ne, kus Ne efektiivne populatsioon (arvutatakse paarituses kasutatud isas- ja emasloomade arvu põhjal) Ne=4 N isane * N emane / ( N isane + N emane ) Siit tulenevalt: F=1/8N isane +1/8N emane Kui lehma seemendamiseks kasutatakse 100 pulli, siis: F=1/8*100 +1/8* = 0, e. 0,1% Seega ei ole homosügotiseerumine sellises populatsioonis oluline. Inbriidingukoefitsiendi muutumise alusel on võimalik hinnata võimalikku inbriidingdepressiooni mõju populatsioonile. Koduloomade puhul on rusikareegel selline, et

89 82 inbriidingukoefitsiendi 1%-line suurenemine vähendab sigivuse ja eluvõimega seotud näitajaid 1% võrrra e. teisisõnu suureneb inbriidingdepressioon nimetatud tunnuste osas 1% võrra. Muude tunnuste osas on inbriidingdepressiooni suurenemine tavaliselt väiksem kui 1%. Mõistagi esineb inbriidingdepressiooni suurenemises suur varieeruvus, kuid oluline on meeles pidada, et üldiselt kaasneb inbriidinguga sigivuse ja eluvõime oluline langus.

90 PÄRILIKE DEFEKTIDE DIAGNOSTIKA Pärilike haiguste diagnoosimine seisneb: 1) Anomaalia fenotüübilises kirjeldamises; 2) Selle geneetilise määratuse tõestamises ja pärandumise viisi selgitamises. (1) Pärilike haiguste geneetilise määratuse tuvastamine Üldised printsiibid, mis juhivad tähelepanu geneetilise etioloogia võimalikkusele: 1) Haigust esineb rohkem teatud perekondades, liinides või tõul, kui populatsioonis tervikuna, 2) Sarnane haigus esineb mõnel teisel liigil ja selle pärilikkus on tõestatud. Haiguse perekondliku iseloomu selgitamisel alustatakse haigete isendite perekonnaandmete uurimisest. Alustatakse defektse isendi lähisugulastest. Uuritakse defekti esinemissagedust lähematel eellastel, õdedel-vendadel ja nende järglastel. Seejärel määratakse defekti esinemissagedus kogupopulatsioonis. Haiguse suurem sagedus mõnes perekonnas või liinis ei ole veel lõplik tõestus geneetilisest etioloogiast. Anomaalia geneetilise etioloogia selgitamisel peab arvesse võtma kõik võimalikud keskkonnalised tegurid, mis võivad põhjustada haiguse levimuse perekondlikku iseloomu. Selleks analüüsitakse andmeid võttes arvesse võimalike keskkonnategureid kasutades selleks vastavaid statistilise analüüsi meetodeid või uuritakse populatsioone, mis on allutatud erinevatele keskkonnatingimustele. Kui kõikide keskkonnategurite mõju on suudetud elimineerida ja haiguse levimuses ilmneb endiselt perekondlik iseloom, siis on haiguse geneetiline määratus suure tõenäosusega kinnitust leidnud. Sellele järgnevalt on vajalik välja selgitada defekti pärandumise seaduspärasused. Selleks viiakse läbi võimalikult ulatuslik põlvnemisandmete uurimine Uuritakse täpsemalt defekti esinemist isendi eellastel ja järglastel arvestades nende sugulusastet uuritava isendiga ja sugu. Põlvnemisandmete alusel on võimalik määrata pärandumise viisi (kas on tegemist retsessiivse või dominantse, autosomaalse või suguliitelise defektiga) ning selgitada, kas on tegemist polügeensuse või fenokoopiaga. Samuti võib hinnata tunnuse penetrantsust ja ekspressiivsust. Alustada võib lihtsalt defektiga isendi sugupuu väljajoonistamisest. Selleks kasutatakse kokkuleppeliselt spetsiaalseid tingmärke (joonis 7.2.1).

91 84 Isane Emane Normaalne Normaalne, (number tähistab isendite arvu) 4 3 Tabandunud Proband (uuritav loom) Surnud Heterosügoot autosomaalse lookuse osas Heterosügoot sugukromosoomi lookuse osas Sugu teadmata Abort või surnultsünd sugu teadmata Ristamine, ja sealt saadud järglased (rooma number tähistab põlvkonda) I II Joonis Tingmärgid sugupuude koostamiseks Vahel on võimalik juba sugupuu visuaalsel hindamisel saada informatsiooni defekti pärilikust iseloomust ja pärandumise seaduspärasustest. Sugupuu koostamine võib vahel osutuda aga väga

92 85 töömahukaks. Vaatamata sellele on see meetod kasulik ja seda kasutatakse sageli haiguse geneetilise etioloogia selgitamise algfaasis. Ka on tänapäeval olemas spetsiaalne tarkvara, mis hõlbustab sugupuude koostamist ja nende analüüsimist. Järgnevalt on esitatud mõned kriteeriumid, mis võimaldavad määratleda haiguse pärandumise viisi põlvnemisandmete alusel. I. Autosomaalne dominantne 1) Defekt esineb kõigis põlvkondades. 2) Igal defektsel järglasel on vähemalt üks defektne vanem (välja arvatud uued mutandid). 3) Tabandunud isendid jaotuvad sugude vahel võrdselt. 4) Tabandunud vanema normaalne järglane ristatuna normaalse isendiga annab normaalseid järglasi ja viimaste järglased on samuti normaalsed. 5) Kui defekt on harv, kuid mitteletaalne, siis enamus tabandunud isendeid sünnib risatamisest normaalne X tabandunud (aaxaa), mille puhul eeldatavalt on pooled järglastest tabandunud. 6) Kui defekt on letaalne, siis esineb teda väga harva ja selle esinemus on võrdne kahekordse mutatsioonisagedusega. II. Autosomaalne retsessiivne 1) Defekt võib mõnes põlvkonnas mitte avalduda. 2) Kahe defektse vanema kõik järglased on defektsed. 3) Enamasti defekt (haigus) esineb ristluses Bb x Bb, mistõttu sageli on tabandunud isendi vanemad tavaliselt normaalsed. 4) Tabandunud isendid jaotuvad sugude vahel võrdselt. III. Suguliiteline dominantne 1) Defektiga isane x normaalne emane defekt kandub tütardele, mitte poegadele. 2) Kui defekt on harvaesinev, siis tabandunud emane x normaalne isane pärandab defekti pooltele poegadele ja pooltele tütardele. 3) Kui defekt on harvaesinev, siis emastel on defekt kaks korda sagedasem kui isastel. 4) Igal tabandunud isendil on vähemalt üks tabandunud eellane (väljaarvatud uued mutandid).

93 86 IV. Suguliiteline retsessiivne 1) Defekt võib mõnes põlvkonnas mitte ilmneda. 2) Tabandunud vanemate kõik järglased on defektsed. 3) Kogupopulatsioonis on haiguse sagedus väiksem emastel ja suurem isastel. 4) Kui haigus on harv, siis enamik haigeid on isased, kelle vanemad on normaalsed. 5) Tabandunud isane x normaalne emane pärandab kõigile oma tütardele defektse geeni. 6) Tabandunud emane x normaalne isane- kõik pojad on haiged, tütred on kandjad. Kui põlvnemisandmete põhjal leiab kinnitust haiguse tõenäoline pärilik iseloom, siis pärandumise seaduspärasuste täpsemaks hindamiseks (defektgeeni pärandumisviisi vastavus ühele või teisele mendelistliku pärandumise seaduspärasusele) viiakse läbi lahknemisanalüüs (segregation analysis). Selleks on võimalik kasutada spetsiaalseid ristamiskatseid, kus ristatakse teadaolevalt defektgeeni kandjaid isendeid erinevates kombinatsioonides ning vaadeldakse defekti avaldumist nende järglastel ning vastavaid lahknemissuhteid. Näiteks autosoomse retsessiivse defekti puhul on järgmiste ristamiste puhul lahknemissuhe järglaste hulgas järgmine: 1) Aa x aa -> järglaskonnas eeldatavalt 50 % defektseid 2) Aa x Aa -> järglaskonnas eeldatavalt 25 % defektseid Sageli pole spetsiaalsed ristamiskatsed võimalikud. Siis on võimalik kasutada ka olemasolevaid andmeid ning teha neil põhinev statistiline lahknemisanalüüs. Ometigi võib selline nn. tegelikel andmetel põhinev analüüs osutuda raskendatuks. Segavaks võivad osutuda sellise analüüsi juures nn. sporaadilised haigusjuhud, mis võivad olla tingitud kas mutatsioonidest või olla lihtsalt fenokoopiad või tingitud haiguse geneetilisest heterogeensusest. Samuti võib haigus mitte avalduda kõigil isenditel, kellel seda võiks eeldada. Kõrvalekaldeid lahknemissuhetes suurendab asjaolu, et mitte alati ei ole teada ja analüüsis arvesse võetud defektse või kandja isendi kõik normaalsed järglased. Komplitseeritumatel juhtudel võimaldab statistiline lahknemisanalüüs anda meile vastuse vaid küsimusele, kas defekt on tingitud üksiku geeni defektist või on tegemist pigem polügeense defektiga, mille puhul on õigem lähtuda haiguse multifaktoriaalsuse põhimõtetest. Abistavate meetoditena pärilikkuse selgitamisel kasutatakse mitmeid tsütogeneetilisi, immunogeneetilisi ja biokeemilisi uurimisi. Lisaks on tänapäeval tähtsale kohale tõusnud DNA uuringud, mis võimaldavad täpsemalt uurida geenidefekte (tuvastada nende asukoha genoomis, geenide siirdamisega selgitada nende talitluslikke omadusi jne.) või leida DNA markereid, mis on seostatavad teatud fenotüübiga. Viimasel juhul on võimalik uurida DNA-markerite olemasolu haigetel isenditel ning

94 87 teha sel moel selgeks haiguse pärilik etioloogia ja ka pärandumise seaduspärasused. Sellist analüüsimeetodit nimetatakse fenotüüp-marker analüüsiks. Rakendades seejuures ka statistilist modelleerimist, on saavutatud suurt edu konkreetsete geenide tuvastamisel, mille talitlus mõjutab anomaalia väljakujunemist PÄRILIKE HAIGUSTE TÕRJE Pärilike haiguste kontroll ja tõrje mittegeneetiliste meetoditega Selle all mõistame pärilike haiguste avaldumise mõjutamist või vältimist mittegeneetiliste meetoditega. Siia hulka kuulub mitmesuguste eelsoodumusega seotud keskkonnategurite mõju vältimine või vähendamine, aga samuti mitmete ainevahetuses osalevate metaboliitide puuduse leevendamine nende manustamisega. Näiteks puusaliigese düsplaasia korral on tegemist paljude mittegeneetiliste teguritega, mis selle haiguse sagedust mõjustavad. Esmane haiguse sageduse vähendamise meetod seisneb õige dieedi tagamises võõrutusjärgsel perioodil. Kanade lihasedüstroofia puhul, manustades penitsillamiini, on võimalik kliiniliste tunnuste avaldumist vältida. Liikumise võimaldamine ja difenüülhüdantoini süstimine kergendab oluliselt haiguse kulgu. Transplantatsiooni- ja korrigeeriv kirurgia Mõnel puhul on võimalik kirurgiliste meetoditega saavutada geenidefektist tingitud anomaalia leevendumine või korrigeerida fenotüübi defekt. Luuüdi siirdamine normaalselt loomalt haigele on andnud tulemusi näiteks püruvaatkinaasi defitsiitsusest tingitud hemolüütilise aneemia korral. Samuti saadud tulemusi luuüdi ja maksa siirdamisel hemofiiliate ravi eesmärgil. Kudede siirdamine kujutab endast sisuliselt geeni siirdamist- defektsete geenidega isendile siiratakse normaalsete geenidega rakke. Korrigeeriv kirurgia on olnud kasutusel pikemat aega fenotüübi defektide kõrvaldamisel või leevendamisel. Näiteks spastilise pareesi raviks vasikatel on kasutatud säärenärvi (n. tibialis) läbilõikamist. Puusaliigese düsplaasia korral koertel on rakendatud harjalihase (m. pectineus) läbilõikamist, mis on väidetavalt leevendanud düsplaasiast tingitud vaevusi.

95 88 Pärilike haiguste mittegeneetilise tõrje geneetilised tagajärjed Tõstes ebasoovitava genotüübi kohastumust raviga tõuseb populatsioonis ka defektse geeni reaalne sagedus, kuna defektse geeniga isendite arv populatsioonis suureneb (loodusliku valiku elimineeriv toime kõrvaldatakse). Kas selline geenisageduse tõus mõjutab ka geenisagedust järgnevas põlvkonnas, sõltub sellest, kuidas kasutatakse ravitud isendeid paarituses. Juhul kui ravitud defektgeeniga isendeid kasutatakse paarituses võrdsel määral normaalsete isenditega alaneb või lakkab ka defektse geeni vastu suunatud selektsioon, ning selektsioonikoefitsiendist sõltuv minimaalne geenisagedus populatsioonis tõuseb. Lisaks hakkab geenisagedus populatsioonis järkjärgult tõusma proportsionaalselt mutatsioonisagedusega antud geenis. Kuna mutatsioonisagedus on tavaliselt madal, siis on nimetatud suurenemine väga aeglane ja ei mõjuta oluliselt populatsiooni geneetilist struktuuri sadade põlvkondade vältel, e. võime öelda, et defektse geeni sagedus jääb populatsioonis suhteliselt stabiilseks (s.o. tasemele, mis on määratud selektsioonikoefitsiendi muutumisest). Siiski väga pikas perspektiivis on sellel populatsiooni genofondile negatiivne mõju. Selektsioonikoefitsiendi alanemise vältimiseks on oluline, et ravitud loomi ei kasutataks aretusloomadena Pärilike haiguste geneetilised tõrjemeetodid Geneetiliste haiguste tõrjeprogrammi eesmärk on vältida defektsetegeenide edasikandumist vanematelt järglastele. See saavutatakse geneetilise haiguse või defektgeeniga loomade praakimisega (ingl. k. culling). See ei tähenda ilmtingimata loomade tapmist, vaid seda, et selliseid loomi ei kasutata aretuses. Lemmikloomade puhul tuleks sellised loomad steriliseerida, põllumajandusloomade puhul kasutada nn. tarbeloomadena. See ei välista ka täielikult selliste loomade kasutamist paarituses, kuid vältima peab seda, et nad pääseksid olulisel määral mõjutama liigi või tõu genofondi. (1) Üksiku geeni defektist tingitud anomaaliate tõrje Kuna üksiku geeni defektide hulgas on kõige sagedasemad retsessiivsete defektgeenide poolt põhjustatud anomaaliad, siis üldiste tõrjeprintsiipide käsitlemisel kasutame näitena just retsessiivseid anomaaliaid. Samas on enamus neist printsiipidest rakendatavad väikeste erisustega ka muud liiki üksiku

96 89 geeni defektide puhul. Peamine printsiip retsessiivsete anomaaliate tõrjel on see, et olenemata sellest, kui suur on ebasoovitava alleeli sagedus populatsioonis, on defekti esinemist loomadel võimalik praktiliselt täielikult vältida, kui üks paarituses kasutatav vanem on homosügootne normaalse alleeli osas. Seega on geneetilise haiguse tõrjeprogrammi esmane ülesanne eristada normaalseid homosügoote heterosügootidest (kandjatest). Selle saavutamiseks on kasutusel erinevaid meetodeid Kliiniline seire Kliinilisel uurimisel on võimalik avastada paljusid geneetilisi defekte. Näiteks koertel on võimalik selliselt määrata paljusid geneetilisi silmadefekte progresseeruvat retinaalatroofiat, retinaaldüsplaasiat ja mitut liiki katarrakti. Kui defekt on tuvastatav enne looma paaritusiga, siis on võimalik ka efektiivselt teostada selle vastast selektsiooni. Loomade kliinilisel läbivaatusel rajanevad geneetiliste haiguste tõrjeprogrammis on võimalik rakendada järgnevaid meetmeid defekti esinemissageduse vähendamiseks: 1) defektsete isendite praakimine e. retsessiivsete homosügootide vastu suunatud selektsioon; 2) defektsete isendite vanemate praakimine, s.o. osaline heterosügootide vastu suunatud selektsioon; Nagu näha ei võimalda kliiniline seire üksinda selgitada heterosügoote retsessiivse defekti korral, mistõttu selle alusel toimiv tõrjeprogramm ei välista täielikult defektide ilmnemist populatsioonis. Kasutades täiendavalt meetmeid heterosügootide ja homosügootide eristamiseks, on võimalik tõrjeprogrammi oluliselt tõhustada. Põlvnemisandmete analüüs Põlvnemisandmete analüüsi eesmärk on määrata isendi homosügootsuse tõenäosus. Selleks on kasutusel spetsiaalne arvutitarkvara. Piisava hulga põlvnemisandmete olemasolul on võimalik välja selgitada, milline loom on kõige suurema tõenäosusega homosügootne ning kasutada seda paarituses. Testristamine Testristamised nõuavad palju aega ja raha, kuid võivad olla väga kasulikud. Ka testristamise eesmärgiks on selgitada välja kas loom on heterosügoot retsessiivse defektgeeni suhtes või homosügootne dominantgeeni suhtes. Sellest ka nimetus heterosügootsus test. Kõige tavalisemad ristamise variandid on: 1) ristamine defektse isendiga (retsessiivse homosügoodiga)

97 90 2) ristamine teadaoleva heterosügoodiga 3) ristamine uuritava looma enda järglastega 4) ristamine juhuvalimiga populatsioonist Kui testristamise tulemusena sünnib defektne isend, on selge, et meie uuritav isend on heterosügoot, kuna üks järglase defektgeen peab pärinema temalt. Kui testristamise tulemusena defektset isendit ei sünni, siis on võimalik, et uuritav isend on homosügoot või on juhuslikult andnud järglasele edasi dominantse alleeli. Sõltuvalt testristamise meetodist on vaja meil erinev arv järglasi, et piisava tõenäosusega deklareerida uuritav isend normaalseks homosügoodiks. Testristamise abil ei saa me kunagi 100% tõenäsusega isendi homosügootsust kinnitada. Ainus, mis me saame teha, on vähendada tõenäosust, et looma heterosügootsus jäi tuvastamata. Näiteks: Eeldame, et uuritav loom on heterosügoot (Aa), siis tema ristamisel retsessiivse homosügoodiga on eeldatavalt pooled järglased normaalsed, pooled defektsed. Seega, kui esimesel ristamisel sünnib normaalne järglane on heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus 0,5 (50%). Siit tulenevalt on teise järglase puhul heterosügootsuse tuvastamatus arvutatav: 0,5*0,5= (0,5) 2 = 0,25. Seega, iga järgmise järglasega väheneb heterosügootsuse tuvastamatus kaks korda. Kasutades avaldist (0,5) n on võimalik arvutada heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus n järglase kohta antud testristamise tüübi puhul. Teiste testristamise variantide puhul on heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus erinev ja on sõltuvuses lahknemissuhetest erinevate vanempaaride puhul. Tabel annab ülevaate heterosügootsuse tõestamatuse tõenäosustest erinevate testristamise tüüpide puhul ainupoegijatel. Hulgipoegijate puhul kehtivad põhimõtted on samad mis ainupoegijate puhul väikeste erinevustega tõenäosuste kalkuleerimisel. Selle kohta vaata R.Teinberg, 1983 (lk. 26). Arvestades testristamiste kulukust on need peamiselt kasutusel isasloomade heterosügootsuse selgitamisel ja sagedamini põllumajandusloomade puhul, kus populatsiooni taastootmisel kasutatakse väikest arvu isaseid. Veisekasvatuses on enamkasutatav meetod neljas testristamise tüüp, mis ei nõua spetsiaalsete ristamiste läbiviimist, vaid heterosügootsust testitakse paralleelselt pulli jõudluse hindamisega. See on osutunud praktikas tõhusaks mooduseks retsessiivsete defektgeenide sageduse hoidmisel madalal tasemel.

98 91 Tabel Heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus erinevate ristamise tüüpide puhul Ristamise tüüp Heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus n Vajalik järglaste arv, et vähendada heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosus kuni: järglase puhul 0,05 0,01 0,001?? x aa (0,5) n ?? x Aa (0,75) n ?? x??-järglased (0,875) n ?? x juhuvalim populatsioonist (1-0,5q) n, kus q- retsessiivse geeni sagedus populatsioonis = 0,2 0,1 0, Biokeemiline seire Kui haigust saab diagnoosida mõne proteiini koguse või ensüümi aktiivsuse alusel organismis, on võimalik tuvastadaselle alusel heterosügootseid isendeid.. Näiteks mannosidoosi puhul on heterosügoodi ensüümi aktiivsus 50%. Biokeemilist skriiningut on mannosidoosi tõrjel kasutatud edukalt Austraalias ja Uusmeremaal. DNA seire Loomade genoomi uurimise arenedes on üha enam aktiviseerunud ka DNA markerite otsimine, mis seonduvad pärilike anomaaliatega. DNA markeriks võib olla anomaaliat põhjustav geen ise või geenilookus, mis on aheldunud anomaaliat põhjustava geeniga. Viimasel juhul ei ole anomaaliat põhjustav geen täpselt teada, kuid defektsete loomade genotüpiseerimisel on leitud, et teatud geenilookuse polümorfismi alusel on võimalik defektgeeni olemaolu genoomis tuvastada. Kui anomaaliat põhjustav geen on teada, siis on suhteliselt lihtne ka teostada DNA seiret. Piisab vaid konkreetse geeni struktuuri uurimisest. Muude DNA markerite puhul ei saa me olla 100% kindlad defektse geeni olemasolu suhtes, kuid see viitab suurele tõenäosusele, et defektne alleel loomal esineb. DNA seiret rakendatakse edukalt sigade stressisündroomi põhjustava geeni kandjate avastamiseks.

99 92 Geeniteraapia Geeniteraapia on loogiline arendus kudede siirdamisele. Geeniteraapiaga on võimalik vältida kudede siirdamisega kaasnevaid probleeme, nagu transplantaadi irdumine (äratõukamine) ja selle vältimiseks läbiviidav agressiivne immuunsupressiivne kemoteraapia. Samas on tegemist sarnaselt mittegeneetiliste tõrjemeetoditega tegemist defektse genotüübi kohastumuse tõstmisega normaalsete geenidelisamisega organismi. See aga ei paranda genotüüpi tervikuna, mistõttu defektse geeni edasikandumine järgmisse põlvkonda on endiselt võimalik Geeniteraapia seisneb patsiendi genotüübi "parandamises" normaalsete geenide viimisega organismi. Selleks: 1) Patsiendilt eemaldatakse rakud ja kasvatatakse neid koekultuuris 2) Rakkudesse sisestatakse võõras normaalne geen. 3) Parandatud rakud viiakse patsienti tagasi. Geene on võimalik manustada ka vektorite abil, milleks kasutatakse teatud viiruseid (vaktsiiniaviirus, bakuloviirus, papillomaviirus). Või manustada vaba DNA-na, milleks on tavaliselt siis plasmiidne DNA. Peamist rakendust leiab selline teraapia geneetiliste defitsiitide korral, mis on põhjustatud üksiku geeni alatalitusest või selle puudumisest. Manustades normaalseid geene, on võimalik taastada organismi normaalset talitlust. Koduloomade puhul ilmselt geeniteraapia laialdast kasutust ei leia, kuna sama kiiresti kui arenevad geeniteraapia meetodid arenevad ka molekulaarsed meetodid defektsete geenide avastamiseks, mis loob võimaluse rakendada selektsiooni pärilike haiguste vältimiseks koduloomadel ning kalligeeniteraapia järele puudub praktiline vajadus. (2) Multifaktoriaalsete haiguste tõrje geneetiliste meetoditega Multifaktoriaalsete anomaaliate vastu, millel on kvantitatiivne geneetiline taust (haiguse saab klassifitseerida väga paljudesse raskuskategooriatesse), on võimalik teostada selektsiooni samadel põhimõtetel, kui mistahes muu kvantitatiivse tunnuse selektsiooni, mis põhineb looma aretusväärtuse määramisel vanemate, järglaste ja külgnevate sugulaste näitajate alusel. Haiguste puhul, mida saab käsitleda lävitunnusena või mida saab kategoriseerida vähestesse

100 93 raskusastmetesse (näiteks südame defektid), saab selektsiooni teostamisel lähtuda järeldustest, mis tulenevad perekonnahaiguste üldistest seaduspärasustest: 1) mida raskem on isendi defekt seda sagedasem ja raskem on defekt tema järglastel; 2) normaalsete isendite puhul, mida väiksem on nende sugulus defektsete isenditega ja mida suurem on tema sugulaste hulgas normaalsete isendite osakaal, seda harvem ja kergem on defekt tema järglaste hulgas. Sellise haiguse tõrjeprogrammi algfaasis tuleb lähtuda eelkõige esimesest printsiibist. Sellest lähtuvalt tuleb kõik potentsiaalselt paaritatavad isendid klassifitseerida vastavalt defekti esinemisele ja selle raskusastmele ning praakida võimalikult palju defektseid isendeid alustades raskemakategooria defektiga isenditest. Programmi edenedes defektsete isendite arv väheneb ja peagi saavutatakse olukord, kus normaalseid isendeid on rohkem kui paarituseks tegelikult vajatakse. Siis on õigem lähtuda paaritatavate isendite valikul eelnimetatud teisest printsiibist. Programmi järjekindlal rakendamisel on võimalik vältida defekti ilmnemist loomadel. Kontrollküsimused ptk. 7.1 kohta 1. Mis on populatsioon? 2. Mis on geeni- ja genotüübisagedus? 3. Kuidas kalkuleerida geenisagedus genotüübisageduse põhjal? Millisel juhul on seda võimalik teha? 4. Juhusliku e. vaba ristumise olemus. 5. Kuidas on seotud vanempõlvkonna geenisagedus ja järglaspõlvkonna genotüübisagedus homosügootse ja heterosügootse genotüübi sagedust silmas pidades (võib väljendada sümbolites)? 6. Milline suhe valitseb vanempõlvkonna ja järglaspõlvkonna geenisageduste vahel. 7. Milliste populatsioonide puhul kehtib Hardi-Weinbergi seadus täiel määral? 8. Millised tegurid põhjustavad populatsioonide geenisageduste muutusi? 9. Mis on selektsioon? Mille kaudu see toimib? 10. Miks esineb populatsioonides dominantseid letaalseid defekte, ehkki nende suhtes toimib 100%-line negatiivne selektsioon? 11. Milline seos valitseb mutatsioonisageduse ja defekti fenotüübilise avaldumise sageduse vahel dominantse letaalgeeni korral? 12. Mida tähendab mutatsiooni-selektsiooni tasakaal?

101 Millest sõltub geeni minimaalne sagedus populatsioonis? 14. Millest sõltub geenisageduse vähenemise kiirus populatsioonis (st. põlvkondade arv, mis on vajalik geenisageduse vähenemiseks teatud ühiku võrra)? 15. Selektsioonikoefitsiendi mõiste. 16. Kuidas on seotud organismi kohastumus ja selektsioonikoefitsient? 17. Kui defekt ei ole letaalne, siis esineb populatsioonis kahte päritolu defektgeene. Nimeta, millist päritolu? 18. Miks on retsessiivse geeni sageduse vähendamine populatsioonis aeganõudvam kui dominantse geeni sageduse puhul? 19. Kuidas on võimalik retsessiivne geen populatsioonist täielikult kõrvaldada? 20. Kuidas on võimalik vältida retsessiivseid defekte populatsioonis, kui me sealt defektgeeni suhtes heterosügootseid isendeid ei kõrvalda? 21. Kuidas muutub retsessiivse geeni sagedus populatsioonis, kus retsessiivseid heterosügoote kasutatakse paarituses dominantsete homosügootidega? Miks? 22. Kui populatsioonist kõrvaldatakse nii homo- kui heterosügootsed retsessiivid, milline on siis minimaalne retsessiivgeeni sagedus populatsioonis? 23. Mida tähendab heterosügoote soosiv selektsioon? Mis seda iseloomustab geenisagedusi silmas pidades? 24. Mida tähendab heterosügootide vastu suunatud selektsioon? Mis seda iseloomustab geenisagedusi silmas pidades? 25. Mis on juhuslik geenitriiv? 26. Mis iseloomustab juhusliku geenitriivi tagajärjel kujunenud geenisagedusi? 27. Milles seisneb geenide migratsioon 28. Milline on migratsiooni mõju populatsioonide geenisagedustele? 29. Mis on inbriiding? 30. Kuidas mõjutab inbriiding populatsiooni geenisagedust ja genotüübisagedust? 31. Mida iseloomustab inbriidingu koefitsient 32. Kuidas mõjutab inbriidingu koefitsiendi suurenemine geneetiliste anomaaliate esinemissagedust populatsioonis? 33. Mis on inbriidingdepressioon? Millest sõltub selle tugevus? 34. Milliseid fenotüübi tunnuseid mõjutab inbriidingdepressioon kõige enam?

102 95 Kontrollküsimused ptk. 7.2 ja 7.3 kohta 1. Milles seisneb pärilike haiguste diagnoosimine? 2. Millised on esmased tunnused, mis viitavad haiguse võimalikule geneetilisele etioloogiale? 3. Kuidas toimub haiguse perekondliku iseloomu selgitamine? 4. Millist informatsiooni on võimalik saada põlvnemisandmete uurimisel? Mis on põlvnemisandmete registreerimise tavapärane meetod? 5. Millised iseärasused ilmnevad põlvnemisandmetes autosoomse dominantse haiguse puhul? 6. Millised iseärasused ilmnevad põlvnemisandmetes autosoomse retsessiivse haiguse puhul? 7. Millised iseärasused ilmnevad põlvnemisandmetes suguliitelise dominantse haiguse puhul? 8. Millised iseärasused ilmnevad põlvnemisandmetes suguliitelise retsessiivse haiguse puhul? 9. Lahknemisanalüüsi eesmärk ja meetodid. 10. Abistavad meetodid haiguse päriliku etioloogia selgitamisel. 11. Milles seisneb fenotüüp-marker analüüs? 12. Milles seisneb pärilike haiguste mittegeneetiline tõrje. 13. Too näiteid pärilike haiguste mittegeneetilise tõrje meetoditest. 14. Kuidas mõjutab pärilike haiguste mittegeneetilise tõrje defektgeeni sagedust populatsioonis, kui ravitud loomi paarituses ei kasutata. 15. Kuidas mõjutab pärilike haiguste mittegeneetilise tõrje defektgeeni sagedust populatsioonis, kui ravitud loomi kasutatakse paarituses võrdselt tervete loomadega. 16. Milles seisneb pärilike haiguste geneetiline tõrje? 17. Kuidas on võimalik vältida retsessiivsete defektide esinemist olukorras, kus heterosügootseid isendeid populatsioonist ei kõrvaldata? 18. Mis on (retsessiivse) päriliku haiguse tõrjeprogrammi esmane eesmärk? 19. Mis on kliiniline seire? Mida on võimalik sellealusel teha pidades silmas defektsete geenide kõrvaldamist populatsioonist. 20. Kuidas on võimalik kliinilise seire puhul selgitada välja dominantseid homosügoote? 21. Mis on heterosügootsus test? 22. Millisedon järeldused, kui heterosügootsus testis sünnib defektne järglane ja siis kui sünnib normaalne järglane? 23. Kuidas saab vähendada heterosügootsuse tuvastamatuse tõenäosust heterosügootsus testis. 24. Milles seisneb biokeemiline seire?

103 Milles seisneb DNA-seire? 26. Geeniteraapia olemus ja põhiprotseduurid. 27. Uute geenide organismi viimise meetodid. 28. Geeniteraapia rakendatavus koduloomadel. 29. Kuidas toimub kvantitatiivsel aditiivsel geneetilisel alusel tekkiva geneetilise haiguse tõrje? 30. Millised on põhiprintsiibid, millest peaks lähtuma multifaktoriaalsete lävitunnuseliste haiguste tõrjel geneetiliste meetoditega?

104 97 8. ONTOGENEETIKA VETERINAARGENEETILISED ASPEKTID JA ONKOGENEETIKA 8.1 ONTOGENEETIKA PÕHIPRINTSIIBID 1) Ontogeneetika määrang Ontogeneetika on geneetika haru, mis uurib isendi arengu geneetilist määratust e. teisisõnu- uurib geneetilise informatsiooni realiseerumist. Isendiarengu nüüdisaegsete uuringute olulisimad probleemid on: (1) geeni toime ontogeneesis ja välisfaktorite toime sellele; (2) rakkude diferentseerumine ja morfogenees ning arengu patoloogia (k.a. onkogenees), (3) rakkude interaktsiooni mehhanismid, (4) arengu biokeemilised ja energeetilised seaduspärasused e. arengu molekulaarbioloogia. 2) Geneetilise informatsiooni realiseerumine Isendiareng e. ontogenees kujutab endast viljastatud munarakus oleva geneetilise informatsiooni realiseerumist. Areng saab seega alguse ühest rakust - sügoodist. Sellest moodustub paljudest rakutüüpidest, kudedest ja organitest koosnev ning kooskõlas funktsioneeriv hulkrakne süsteem. Ontogeneesi vältel muutuvad rakud ja neis sisalduvad ained. Mõistetavalt on organismi arengu algstaadiumis tekkivad rakud võrratult lihtsamad võrreldes täiskasvanud isendiga. Näiteks puuduvad sügoodis terved valkude rühmad, mis on omased täiskasvanud isenditele. Seega toimub arengu käigus genotüübis talletatud informatsiooni järkjärguline realiseerumine. Ontogeneesi käigus toimub põhiliste liigiomaste organismi tunnuste uuestiteke e. epigenees. Geneetilise informatsiooni realiseerumine toimub järgmistel tasemetel: (1) DNA valk; (2) informatsiooni kandumine valgult teistele molekulidele; (3) informatsiooni kandumine supermolekulaarsetele struktuuridele, mis määravad raku omadused ja raku talitluse ning (4) informatsioon elundite ja supertsellulaarsete struktuuride moodustumiseks. Ontogeneesis on eristatavad kolme tüüpi arenguprotsessid: (1) diferentseerumine (eri rakutüüpide ja kudede tekkimine); (2) morfogenees (alates molekulaarstruktuuridest lõpetades organitega ja tervikorganismi anatoomilise

105 98 ehitusega); (3) kasvamine. Nimetatud protsessid on omavahel seotud ja üksteisest sõltuvad ning toimuvad sageli samaaegselt. Siiski on nende osatähtsus eri ontogeneesi etappidel erinev. Lisaks geneetilistele faktoritele mõjutavad isendiarengut ka väliskeskkonna tegurid. Organismi kohanemine individuaalse arengu vältel mitmesuguste ümbruse teguritega kujutab endast ontogeneetilist adaptatsiooni. Ontogeneetiline adaptatsioon seisneb teatud geneetilise potentsiaali realiseerumises antud keskkonna tingimustes. Keskkonna tingimused võivad soodustada potentsiaali avaldumist (hea söötmistase kõrge toodang, tugev treening head sportlikud tulemused jne.) või seda pärssida. Ontogeneetilise adaptatsiooni avalduseks on ka tingitud reflekside kujunemine loomadel, aga samuti adaptiivsed immuunreaktsioonid. 3) Rakkude diferentseerumine Rakkude diferentseerumise all mõistetakse viljastunud munarakust pooldumise teel moodustuvate tütarrakkude järkjärgulist eristumist üksteisest, mille tagajärjeks on embrüo erinevate rakutüüpide ja kudede ning lõpuks organite ja elundite moodustumine. Rakkude diferentseerumine on samuti geneetilise kontrolli all nagu mistahes protsess organismis. Diferentseerumise tulemuseks on erineva ehituse- ja talitlusega rakkude moodustumine. Seejuures on spetsialiseerumine väga spetsiifiline - kindlaid ensüüme, hormoone jne. produtseerivad kindlad rakud. Samal ajal on kõikides rakkudes leiduv geneetiline informatsioon IDENTNE! Sellest järeldub, et eri rakkudes talitlevad erinevad geenid, mis tähendab, et geneetilist informatsiooni kasutatakse valikuliselt. Funktsionaalselt aktiivset genoomiosa diferentseerunud rakkudes nimetatakse raku epigenotüübiks. Epigenotüübis tuleb eristada kahte tüüpi aktiivseid geene: (1) obligaatselt aktiivsed geenid - on alati aktiveeritud, (2) fakultatiivselt aktiivsed geenid - on aktiivsed ainult teatud funktsionaalsete või metaboolsete seisundite puhul. 4) Diferentseerumise tegurid Diferentsiaalset geeniaktiivsust määravad tegurid ei ole genoomisisesed. Erinevad diferentseerumissuunad on määratud mitmesugustest tuumavälistest teguritest. Embrüo arengu algul tekkivate blastomeeride esmase eristumise allikaks on sügoodi tsütoplasma regionaalne

106 99 heterogeensus. Aineliselt ja struktuurselt koostiselt erinevate tsütoplasmaosade jaotumine blastomeeride vahel tingib nende tsütoplasmalise diferentseerituse. Selle tulemusena aktiveeruvad erinevad geenikompleksid erinevates blastomeerides. Blastomeeride esmane diferentsiaalne geeniaktiivsus põhjustab uute rakuspetsiifiliste valkude sünteesi, mis omakorda majutab valikulist geeniaktiivsust ja süvendab rakkude diferentsiaalseid biokeemilisi omadusi. Järgnevates arenguetappides nimetatud protsessid süvenevad. Gastrulatsioonis satuvad kontakti juba erineva geeniaktiivsusega rakurühmad, mis mõjutavad üksteist vastastikku. Rakusisestele tuuma ja raku interaktsioonidele lisanduvad teistest rakkudest lähtuvad signaalid (induktorid, regulaatorid). Sellisteks regulaatoriteks on mitmesugused mediaatorid ja hormoonid. Rakuväliste induktorite ja regulaatorite toime eelduseks on vastavate retseptorite olemasolu rakumembraanidel. Hormoonid ja teised regulaatorid ühinevad vastavat retseptorit kandva rakuga ja moodustunud kompleks kandub raku tuuma, kus ta mõjustab vastavate geenide talitlust. 5) Geenid ja tunnused Geneetilise informatsiooni realiseerumist fenotüübina nimetatakse fenogeneesiks. Geneetilise informatsiooniga määratakse otseselt vaid valkude primaarstruktuur. Edasine informatsiooni kandumine järgmistele struktuuritasanditele (vt eespool) on vaid kaudselt geenide poolt määratud. Tunnuste kujunemise aluseks on biokeemilised reaktsiooniahelad, mitmeastmelised diferentseerumis- ja morfogeneesiprotsessid. Sellest tulenevalt on kõik organismi tunnused sisuliselt polügeense määratusega. Siiski võib ühe geeni mutatsioon tingida mõne tunnuse puudumise. See viitab asjaolule, et tegemist on antud tunnust peamiselt määrava geeniga. Geenide talitlus ei ole iseseisev, vaid kollektiivne. Tunnuste arenemist kontrollivad geenid toimivad vastastikuses seoses. Geenide interaktsioon biokeemilises mõttes tähendab geenide produktide vastastikust mõjutamist ontogeneesi käigus. Nii osutub ühe geeni produkt teiste geenide induktoriks või repressoriks. 6) Genotüüp ja keskkond Genotüüp on koostoimivate geenide kogum, mis määrab organismi reaktsiooninormi erinevates keskkonna tingimustes. Fenotüüp on organismi tunnuste kogum, genotüübi realiseerumise tulemus teatud keskkonna tingimustes. Ontogeneesi käigus kujunevad tunnused võivad antud genotüübil varieeruda teatud

107 100 piirides. Neid nimetatakse fenotüübiliste muutuste piirideks e. reaktsiooninormiks. Reaktsiooninorm on seega teisisõnu ontogeneetilise adaptatsiooni piirid. Nende piiride ületamine toob kaasa organismi hävimise. Tulenevalt diferentseerumisprotsessi etapilisusest ja sellest, et ontogeneesi eri etappidel toimivad erinevad geenid, võib ontogeneesi jaotada tinglikult mitmeks staadiumiks. Seejuures on täheldatavad teatud üleminekuperioodid ühest staadiumist teise. Nimetatud üleminekuperioode loetakse fenokriitilisteks perioodideks, kuna sel perioodil on organism kõige tundlikum väliskeskkonna mõjudele. Üleminekuperioodidel toimuvad teatavas koes või organis valgusünteesi tüübi muutused, genoomi erinevate osade aktiivsuse vahetus. Kriitilised perioodid saabuvad iga liigi puhul erineval ajal. Näiteks kanadel on embrüonaalse arengu päev (hakkab formeeruma vereringe) ja päev (intensiivne diferentseerumine, kudede ja organite teke) ning 19. päev (kujuneb ümber hingamistüüp). Veistel on kriitilised embrüonaalse arengu esimesed päevad. Kõrgematel loomadel on keskkonna mõju embrüonaalsele arengule suhteliselt nõrk, kuna loode areneb organismi sees või munakoorest kaitstult. Seetõttu suuremat mõju avaldavad postnataalsel perioodil toimivad keskkonna tegurid. Postnataalsel perioodil toimivatest keskkonna tingimustest on kõige olulisema mõjuga söötmise ja pidamise tingimused, samuti patogeenide toime. Tinglikult võib tunnuseid jaotada ümbrusest sõltuvuse alusel kolme rühma: (1) tunnused, mis on määratud praktiliselt ainult geneetilistest teguritest (biokeemilised tunnused); (2) tunnused, mille areng oleneb nii geneetilistest kui keskkonna teguritest (näit. kehamass ja mõõtmed, kasvukiirus, psüühilised omadused); (3) tunnused, mille puhul genotüübi osa on väike (juhuslikud vigastused, väliste tunnuste tahtlik muutmine inimese poolt) VANANEMINE Eluiga on liigi tunnus st. see on geneetiliselt määratud. Siiski mõjutavad eluea pikkust oluliselt haigused. Seejuures osa haigusi on seotud isendi vananemisega, osa aga mitte. Pikaealisus on isendi kõrge kohastumuse näitaja, mis tõestab ka organismi kõrget resistentsust erinevate patogeensete tegurite suhtes. Liigi elukestus on tihedalt seotud muude liigiomaste tunnustega. Näiteks võib täheldada, et suure massiga loomadel on pikem eluiga kui väikestel, liigi viljakus ja elukestus on pöördvõrdelised suurused, lihasööjate eluiga on lühem kui rohusööjatel. Eluiga saab seostada muude ontogeneesi iseärasustega. Nimelt on eluiga võrdeline sugu-

108 101 küpsuse eelse kasvuperioodi kestusega - mida pikem see on, seda pikem eluiga. Arvatakse, et eluiga ületab ligi 6-10 korda perioodi sünnist suguküpsuseni. Näiteks hobune saavutab suguküpsuse 5. eluaastaks ja elab aastat. Veis 2. eluaastaks (eluiga kuni 20 aastat) jne. Ka liigi siseselt näib nimetatud reegel kehtivat. Nimelt on täheldatud, et mida aeglasem on roti areng, seda pikem on tema eluiga. Eluea pikkust seostatakse ka rakkude paljunemisvõimega. On leitud, et rakud võivad koekultuurides anda vaid teatud kindla hulga generatsioone. Inimese puhul on see näiteks maksimaalselt 50. Arvestades rakkude eluiga on saadud inimese maksimaalseks elueaks aastat. Vananemise põhjuste suhtes ei olda ühesel seisukohal. Üks on küll selge, et juba enne kui rakud lõpetavad paljunemise, ilmuvad nendesse mitmesugused jääkained. Peamised teooriad, millega vananemist seostatakse on järgmised: (1) DNA replikatsioonivigade teooria; (2) DNA ahelatevaheliste põikõmbluste moodustumise teooria; (3) vabade radikaalide teooria; (4) ajutalitluse häirumise teooria; (5) immuunmehhanismide vananemise teooria (autoimmuunsuse teke). DNA replikatsioonivigade teooria seletab vananemist somaatiliste mutatsioonide kuhjumisega organismis. DNA ahelatevaheliste põikõmbluste moodustumise teooria väidab, et tekkinud põikõmblused ei võimalda pidevalt toimuvat ensümaatilist DNA-reparatsiooni (parandamist). Vabade radikaalide teooria järgi on vananemise põhjuseks nn. vabad radikaalid, mis tekivad vananema hakkavates rakkudes. Vabad radikaalid kahjustavad rakku. Nende eest kaitseb E- vitamiin, mis toimib sünergistlikult C-vitamiiniga. Soodus on ka rasvhapete vähendamine toidus. Ajutalitluse häirete teooria tõstab esiplaanile hüpotaalamuse ja hüpofüüsi osa ainevahetuse häirumises. Immuunmehhanismide vananemise teooria seletab looma vananemist lümfotsüütide vananemisega. Viimane kaasneb vähi ja autoimmuunhaiguste kujunemisega (reumatism, glomerulonefriit, reumaatiline polüartriit, südameklappide tabandumine), mispuhul lümfotsüüdid ründavad kehaomaseid biopolümeere. Vananevate T-lümfotsüütide eemaldamine põrna eemaldamise näol kahekordistab hiire eluiga.

109 ONKOGENEETIKA Kantserogeneesi üldbioloogilised alused Nagu eelnevast selgub võib hulkrakset organismi vaadelda kui korrastatud rakuklooni (areneb välja ühest rakust - sügoodist), mille koostisosad - rakud, omavad küll ühesugust genoomi, kuid on spetsialiseerunud täitmaks erinevaid ülesandeid. Ühtlasi võib organismi vaadelda ka kui ökosüsteemi, mille koostiselementideks on koed ja rakud (makromaailmas oleksid analoogid vastavalt liigid ja isendid). Enamik "elusatele" ökosüsteemidele iseloomulikest tunnustest on kohandatavad ka organismile. Nendeks on: sünd, surm, käitumine e. talitlus, territooriumi piiritletus, populatsiooni arvukuse ja selle tunnuste säilitamine. Organism on siiski üks erakordne ökosüsteem, kuna normaalses olekus ei esine siin konkurentsi erinevate rakuliikide vahel. Kõik somaatilised rakud on määratud surema ja neist ei jää järele järglasi sõna otseses mõttes. Oma eksistentsi pühendavad nad täielikult sugurakkude elu tagamiseks. Vaid sugurakkudel on šanss ellu jääda ja kanduda edasi järgmisse põlvkonda. Ohverdades end sugurakkude eest, tagavad somaatilised rakud tegelikult seda, et neis sisalduv geneetiline informatsioon paljuneb, jätkab eksisteerimist ja levimist. Iga mutatsioon, mis põhjustab süsteemi üksikutes lülides, s.o. rakkudes, iseloomu muutusi, mis viivad rakkude "omakasupüüdlikule" talitlusele, ähvardab hävitada kogu süsteemi. Mutatsioon, konkurents ja looduslik valik on nähtused, mille ilmumine somaatiliste rakkude populatsiooni põhjustabki vähi teket. Vähk on seega haigus, mille puhul üksik mutantne rakk hakkab paljunema oma naabrite arvel. Ta on võimeline haarama naabrite territooriumi, jätma nad ilma toitainetest, mille tulemusena normaalsed rakud kaovad sealt, kus nad peaksid olema. Protsessi lõpptulemuseks on paratamatult kogu "rakkude ühiskonna" hukkumine, sealhulgas loomulikult ka kasvajarakkude hukkumine. Normaalse täiskasvanud looma organites ja kudedes püsivad rakkude paljunemine ja suremine tasakaalus nii, et teatud liiki rakkude arv püsib enamvähem ühesugune. Aegajalt tekib rakke, mis ei allu normaalsele "kasvukontrollile" (nende eluiga on normaalsest pikem ja paljunemiskiirus võib olla ka suurem). Sellised rakud panevad aluse rakuklooni kujunemisele, mis võib võtta märkimisväärsed mõõdud ja moodustada kasvaja. Kasvajat, mis ei ole võimeline lõpmatuks kasvuks ja mis ei haara naaberkudede "territooriumit" liiga suures ulatuses nimetatakse healoomuliseks. Kasvajat, mille rakkude paljunemine jätkub pidevalt ning mille tulemusena haaratakse üha

110 103 uusi naabruses asuvaid kudesid endasse, nimetatakse pahaloomulisteks. Pahaloomulistele kasvajatele on iseloomulik siirete e. metastaaside moodustamine. Metastaasid moodustuvad sel teel, et üksikud kasvajast irdunud rakud satuvad vere- või lümfiringesse, ning kanduvad selle abil teistesse organitesse ja kudedesse, kus nende paljunemine jätkub. Vähirakkudel on omadusi, mis eristab neid normaalsetest rakkudest: (1) Klonaalne päritolu: kõik kasvajarakud pärinevad ühest neoplastilisest rakust, milles on tekkinud kasvu reguleerivate mehhanismide defekt, mis pärandub edasi rakkude järglaspõlvkonnale. (2) Piiramatu kasv in vivo: piiramatu paljunemine, kuna ei allu normaalsetele kasvu piiravatele mehhanismidele. (3) Surematus in vitro: kunstlikes kasvutingimustes võib elus hoida praktiliselt lõputult, samas kui normaalsete rakkude kultuurid püsivad elus vaid piiratud arvu passaažide vältel. (4) Muutunud koespetsiifiline sobivus: vähirakud on võimelised kasvama ja paljunema ümbritsetuna teistliiki rakkudest. Mõnede vähiliikide puhul on vähirakud tolerantsed teatud kindlat liiki kudedega, mistõttu metastaasid esinevad sel puhul kindlates organites. (5) Muundunud biokeemiline talitlus: vähirakkude uudsed biokeemilised omadused põhjustavad nende invasiivsust ja võimet moodustada metastaase. Siia hulka kuulub: 1) ensüümide moodustamine, mis lõhustavad basaalmembraane ja sidekude; 2) angiogeense faktori produktsioon, mille abil tekivad kasvajasse veresooned, mille kaudu toimub kasvajakoe varustamine toidu ja hapnikuga; 3) suurenenud glükolüüs, mis võimaldab kasvajarakkudel paljuneda hapniku defitsiidi tingimustes. (6) Muundunud väliskuju: tekib muutuste tõttu rakumembraani koostises. (7) Ebanormaalne kromosoomistik: üldiselt on vähirakud aneuploidsed, lisaks esineb geenide deletsioone, translokatsioone ja duplikatsioone Rakkude pahaloomuline muundumine (transformatsioon) Rakkude normaalseid morfoloogilisi- ja kasvuomadusi võivad muuta keemilised kantserogeenid, kiirgused ning teatud viirused. 1) Keemiliste ja füüsikaliste kantserogeenide indutseeritud transformatsioon: Mõned keemilised ühendid on otseselt mutageensed, näiteks nagu alküleerivad ühendid. Teised muutuvad potentsiaalseteks mutageenideks läbides metaboolse muundumisprotsessi

111 104 organismis, enamasti maksa ensüümide toimel. Ultraviolettkiirgus põhjustab dimeerse tümiini moodustumist ja röntgenkiirgus põhjustab väga mitmesuguseid mutatsioone, sealhulgas ka kromosoomide lagunemist. Keemiliste ja füüsikaliste kantserogeenide poolt indutseeritavas pahaloomulises transformatsioonis on eristatavad kaks faasi: a) initsieerimise e. algatamise faas ja b) stimuleerimise faas. Initsieerimise faasis tekivad muutused raku genoomis, kuid see ei pruugi veel viia pahaloomulise transformatsioonini. Vajalik on stimuleerivate faktorite olemasolu, mis vallandaks muundunud raku paljunemise ja tagavad pahaloomulise transformatsiooni väljakujunemise. 2) Viiruse indutseeritud transformatsioon: Esimesena tõestas viiruse etioloogilist rolli kasvajate tekkes Rous a. (RNA-viirust, mis põhjustab kasvajaid kanadel, nimetati Rous i sarkoomiviiruseks (RSV). Seejärel on avastatud mitmeid kasvajaid põhjustavaid viirusi nii RNA- kui DNA-viiruste hulgast. Viirused võivad indutseerida transformatsiooni kahel viisil: (1) Produtseerides proteiine, mis põhjustavad infitseeritud raku transformatsiooni. Näiteks DNAviirused SV-40 ja polüoomi viirus, mille genoomid liituvad peremehe kromosoomi DNA-ga, misjärel produtseeritakse koos peremeesrakule omaste proteiinidega viiruse proteiine, sealhulgas ka raku pahaloomulist transformeerumist produtseerivaid proteiine (T- ja t-proteiinid). (2) Onkogeenide e. "vähi geenide" vahendusel. See on omane RNA viirustele, kes pöördtranskribeerivad oma genoomi DNA-ks, mis liitub peremehe genoomiga. Seda RNA-viiruste rühma nimetatakse retroviirusteks e. onkoviirusteks. Neile on iseloomulik, et nende genoomis leidub spetsiaalne, raku pahaloomulist transformatsiooni põhjustav geen- onkogeen. Siia kuuluvad sellised viirused nagu Rousi Sarkoomiviirus, veiste enzootilise leukoosi viirus, inimese T-rakulise leukeemia viirus jt. On tõestatud, et pahaloomulise transformatsiooni algatamiseks piisab üksnes viiruse onkogeeni viimisest rakku.

112 Onkogeenid ja vähiteke H. Temin püstitas a. hüpoteesi, et onkogeene leidub ka peremeesorganismi rakkudes, väites isegi, et viirused omandavad onkogeenid just raku genoomist. Ta nimetas raku onkogeenid proto-onkogeenideks e. tsellulaarseteks onkogeenideks (c-onc), et eristada neid viiruse onkogeenidest (v-onc) ndate keskel sai nimetatud hüpotees kinnitust ka vastavate geeniuuringute tulemuste alusel: Rousi sarkoomiviiruse v-onc analooge leiti kana genoomis. Seejärel on avastatud terve hulk mitmesuguseid c-onc-e. V- ja c-onkogeenide nukleotiidse järjestuse võrdlemine on näidanud, et tegemist on evolutsiooniliselt äärmiselt konservatiivse geenirühmaga, kuna sarnaseid geene on leitud nii inimesel, drosoofilal kui pärmseentel. See tõestab, et onkogeenide kodeeritavad proteiinid on seotud rakkude paljunemise ja diferentseerumise fundamentaalsete funktsioonidega. V- ja c-onkogeene eristab see, et c-onkogeenid koosnevad arvukatest eksonitest ja intronitest, kuid v-onkogeenid koosnevad ainult eksonitest. Seejuures on v-onc ja vastava c-onc homoloogia äärmiselt kõrge ning nende poolt kodeeritavad proteiinid vahendavad ühesuguseid funktsioone. Seetõttu ollakse tänapäeval seisukohal, et enamus, kui mitte kõik v-onc-d pärinevad peremehe genoomist, ning viirus on transkriptsioonil RNA-töötlemise protsessis jätnud intronid maatriksist välja. Onkogeenide funktsioonid: Normaalsetes rakkudes on onkogeenid üldiselt vähesel määral ekspresseeritud, ja nende talitlus on seotud raku kindla arengustaadiumiga. Onkogeenide produtseeritavad proteiinid talitlevad kui: (1) kasvufaktorid indutseerides rakkude proliferatsiooni; (2) kasvu pidurdavad faktorid; (3) raku surma (apoptoosi) reguleerivad faktorid. Vähk areneb juhul kui kasvufunktsioonid ja kasvu pidurdusfunktsioonid ei ole tasakaalus. Põhjused, mis võivad muuta proto-onkogeeni onkogeeniks, põhjustades rakkude kasvu regulatsioonis häireid summeerib järgnev skeem.

113 106 Normaalne rakk Transformeerunud rakk Protoonkogeenid Ekspressioon Rakkude kasvu ja paljunemist reguleerivad proteiinid Rakusurma reguleerivad proteiinid Mutageenid, Viiruse-onkogeen Retroviiruse transduktsioon c-onc-ga viirused, geneetiline eelsoodumus Raku-onkogeen Ekspressioon Joonis 8.1. Proto-onkogeenide muutumine onkogeenideks (J. Kuby, 1994 järgi) (1)Hüperaktiivsed proteiinid (2)Geenide kordistumine või translokatsioon: (3) proteiinide suurenenud või vähenenud produktsioon Seega rajaneb kantserogenees rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise mehhanismidel. Onkogeenid on aga normaalsed rakkude kasvu, paljunemist ning nende surma reguleerivad geenid ning kantserogenees saab võimalikuks häirete tõttu nimetatud protsessides. Kontrollküsimused VIII ptk. kohta 1. Ontogeneetika määrang 2. Epigeneesi mõiste 3. Geneetilise informatsiooni realiseerumise tasemed. 4. Arenguprotsesside tüübid ontogeneesis. 5. Milles seisneb ontogeneetiline adaptatsioon? 6. Kuidas tagatakse organismi erinevate rakkude erinev struktuur ja funktsioon rakkude identse genotüübi juures? 7. Epigenotüübi mõiste 8. Mis põhjustab blastomeeride esmast eristumist? 9. Millised faktorid reguleerivad geenide talitlust organismi hilisemates arengustaadiumides?

114 Fenogeneesi mõiste 11. Millised perioodid on organismi arengus fenokriitilised? 12. Mis on peamised välistegurid, mis mõjutavad eluea pikkust? 13. Kirjelda 3 organismi vananemise põhjust! 14. Millised "makro-populatsioonidele" omaste nähtuste ilmnemine organismi ökosüsteemis viib kasvajate tekkimisele? 15. Mis eristab healoomulist kasvajat pahaloomulisest? 16. Metastaaside tekkemehhanism vähi korral. 17. Mis on vähirakkude piiramatu kasvu põhjuseks? 18. Milles avaldub vähirakkude muutunud koespetsiifilisus? 19. Loetle vähirakkudele omaseid biokeemilise talitluse muutusi võrreldes normaalsete rakkudega. 20. Mida oskad öelda vähirakkude väliskuju ja kromosoomistiku kohta? 21. Millised faktorid põhjustavad rakkudes pahaloomulist transformatsiooni? 22. Keemiliste ja füüsikaliste kantserogeenide toimemehhanismi iseloomustus (2 etappi). 23. Viiruste indutseeritud transformatsiooni 2 liiki nende iseloomustus. 24. Mis on onkogeen? 25. Mis on v-onc, c-onc? 26. Mis eristab v-onc-i c-onc-st? 27. Milliseid funktsioone täidavad onkogeenide poolt sünteesitavad proteiinid? 28. Mis on vähi põhjuseks onkogeenide teooriast lähtuvalt?

115 FARMAKOGENEETIKA Farmakogeneetika määrang Ravimi toime sõltub sageli sellest, kui kiiresti ta aktiveeritakse organismis või kui kaua ta patsiendis aktiivsena püsib. Kuna mõlemad protsessid on otseselt seoses ensüümide talitlusega, ensüümid on geenide produktid, siis on organismi reaktsioon ravimitele vähemalt osaliselt geneetiliselt määratud. Ka ravimi organismist väljutamise kiirus on geneetiliselt määratletud. Farmakogeneetika uurib pärilikkuse osa organismi reaktsioonides ravimitele, nende reaktsioonide geneetilise kontrolli mehhanisme ja bioloogilist olemust. Farmakogeneetika uurib ka geenide talitluse muutumist ravimite toimel e. ksenobiootikumide mutageenset toimet. Organismi reaktsioon ksenobiootikumile (kehavõõrale keemilisele ühendile) seisneb: (1) retseptsioonis (ravimi või mõne teise võõraine seostumine raku retseptoritega); (2) biotransformatsioonis (metabolism); (3) immuunvastuses (ka madalamolekulaarsetele ühendite suhtes). Geenidefektidest tingitult võib reaktsioon ravimile puududa või olla väärastunud e. patoloogiline. Viimasel juhul tekib kas hemolüüs, idiosünkraasia või muud kõrvalnähud. Idiosünkraasia on ülitundlikkusreaktsioon ravimi suhtes. See avaldub tursete, kehatemperatuuri tõusu või järsu vererõhu alanemise ja hingamishäiretena. Enamasti on see tingitud üksikute ensüümide puudulikkusest. Geneetiline variatsioon reaktsioonis ravimitele Eri indiviidid reageerivad ravimitele olulisel määral erinevalt. On täheldatud, et need erinevused on seotud loomade põlvnemisega ja kuulumisega teatud liinidesse. Üks tähtsam geenide kogum, mis on seotud ravimite metabolismiga, on tsütokroom-p450 geenide perekond. Erinevate P450 rühma kuuluvate geenide arv eri loomaliikidel ulatub 60st 200ni. Need geenid kodeerivad ensüüme, mida nimetatakse mono-oksügenaasideks, ja mille ülesandeks on kaitsta organismi võõraste (madalmolekulaarsete) kemikaalide eest. Sel eesmärgil on nad võimelised

116 109 eraldama erinevatest ühenditest amino- ja alküülrühmi, hüdroksüülima ja redutseerima molekule muutes need organismile mittetoksilisteks. Paljude P450 geenide puhul on inimesel ja ka loomadel täheldatav suur varieeruvus, mis omakorda väljendub eri isendite erinevas reageerimises mitmetele ravimitele (psühhotroopsed preparaadid- antidepressandid, opioidid, beeta-blokaatorid, rahustid). Mutatsioonide korral nendes geenides esineb aga sageli ekstreemseid kõrvalnähte ja ravimite vastandlikku toimet. Teiseks on leitud küülikute eri liinides erinevusi võimes inaktiveerida isoniasiidi, mis on seotud maksas esineva atsetüül-transferaasi (AT) aktiivsusega. Viimast on täpsemini uuritud inimesel. Väheaktiivse AT-ga isendites inaktiveeritakse aeglaselt ka mitmeid teisi ravimeid, mis on keemiliselt lähedased isoniasiidile (näit. sulfoonamiidid) ning sellega kaasnevad ebasoovitavad kõrvalnähud. Atsetüül-transferaasi ülesandeks on aminorühmi sisaldavate ksenobiootikumide biotransformatsioon, mis seisneb aminorühmade seostamises äädikhappega - N-atsetüleerimises. Maksa AT aktiivsust reguleerib autosoomne geen, mille dominantne alleel kodeerib kõrge aktiivsusega AT sünteesi (kiire inaktivatsiooni alleel) ja retsessiivne alleel väheaktiivse AT sünteesi (aeglase inaktivatsiooni alleel). Aeglase isoniasiidi inaktivatsiooniga isendid on nimetatud alleeli osas homosügootsed retsessiivid. Aeglase inaktivatsiooni alleeli sagedus varieerub populatsioonides suures ulatuses (vt tabel 9.1). Tabel 9.1. Atsetülatoorse staatuse genogeograafia Populatsioon Aeglase Aeglase alleeli fenotüübi sagedus sagedus Kanada eskimod 0,22 0,05 Hiinlased 0,39 0,15 Jaapanlased 0,34 0,12 Araablased 0,91 0,83 Sudaanlased 0,80 0,65 USA afroameeriklased 0,71 0,51 USA valged 0,76 0,58 Sakslased 0,66 0,44 Soomlased 0,80 0,64 Saamid 0,53 0,28

117 110 Sarnast erinevust on täheldatud ka reaktsioonis anesteetikumidele. Loomade puhul on kõige paremini uuritud sigade reaktsiooni halotaanile (vt eestpoolt - halotaantest). Inimestel on paremini uuritud reaktsiooni suktsinüül-koliini (SK) manustamisel, mida kasutatakse anesteesia puhul müorelaksandina. Enamik indiviide vajab SK-manustamise järgselt hingamisaparaadi abi vaid lühiajaliselt. Osa indiviide on aga ülitundlikud SK suhtes ning vajavad hingamisaparaati mitu tundi. Nimetatud ülitundlikkust põhjustab jällegi autosoomne retsessiivne alleel. Multifaktoriaalne farmakogeneetika Eelkirjeldatud juhtudel olid erinevused reaktsioonis ravimitele seotud alleelidega üksikus geenilookuses. Enamikul juhtudel ei ole aga reaktsioon ravimile sõltuv vaid ühe lookuse alleelidest. Veelgi enam - ravimi metabolismi mõjutab teadmata arv geene ja väliseid tegureid. Tulemuseks on see, et manustades teatud hulgale isenditele standard-doosi ravimit saame neil erinevaid reaktsioone ning isendite jaotus efekti tugevuse skaalal on vastav normaaljaotusele (F. Nicolas,1993 järgi, vt joonis). Seejuures skaala alguses ravimil efekti ei ole ja lõpus on efekt toksiline. Loomade arv Ebaefektiivne Optimaalne efekt Toksiline efekt Ravimi kontsentratsioon seerumis Joonis 9.1. Ravimi efekt teatud kontsentratsiooni puhul seerumis (Nicholas, 1988) Eeltoodut on vaja arvestada kliinilises praktikas. Nimelt iga ravimi puhul tuleb arvestada, et patsiendid erinevad geneetilisest mitmekesisusest tulenevalt tundlikkuse poolest farmakonide terapeutilisele ja toksilisele toimele.

118 111 Ravimite kliiniliste omaduste (efektiivsus, potentsus ja toksilisus) määramiseks on vajalik läbi viia ravimi kliinilised katsed. Kliinilised katsed ravimite efektiivsuse määramiseks: Eesmärgid: ravimi efektiivsuse määramine ravimi efektiivsus ravim omab talle omistatavat toimet. standard-dooside määramine ravimi potentsuse määramine näitab millises doosis ravim avaldab eeldatavat toimet kõrvaltoimete selgitamine toksilisus üledoseerimise korral kõrvaltoimed e. toksilisus teistele organitele ja organismi talitluslike protsesside suhtes keskkonnaliste ja geneetilistest tegurite mõju selgitamine eelnimetatule Kliiniliste katsetega on vaja lahendada kaks mõneti vastuolulist ülesannet: (1) tõestada, et ravim avaldab organismis toimuvatele protsessidele reaalselt toimet ja mõõta selle efekti suurust. (2) tõestada, et ravim toimib kõigile populatsiooni isenditele ühetaoliselt. See eeldab erinevat lähenemist: Esimesel juhul on oluline, et katsealused oleksid sarnase genotüübiga ja allutatud ühesugustele keskkonnateguritele. Teisel juhul on oluline haarata katsesse võimalikult palju genotüüpe. Kummagi eesmärgi saavutamiseks on seetõttu kasutusel ka erinevad meetodid: (1) kaksikute meetod- kasutatakse geneetiliselt lähedasi isendeid; (2) välikatsed- kasutatakse suurt hulka sama haigust põdevaid patsiente ;

119 112 Kaksikute meetod Ühele kaksikutest või rühmale geneetiliselt lähedastest isenditest manustatakse ravimit teisele mitte ning jälgitakse organismis toimuvaid muutusi biokeemiliste analüüsimeetoditega või haigusprotsessi kulgu ravitud ja ravimata isenditel. Eelised: Välistab suuresti genotüübi erinevusest tulenevad erinevused ravimi toimes. Võimalik teostada kontrollitud keskkonnatingimustes- välistab keskkonnast tingitud erinevused. Võimalik täpselt määratleda haiguse staadiumeid, raskusastet jms. Tulemusi vôimalik saada suhteliselt kiiresti. Tulemuste saamiseks läheb vaja suurusjärgu vôrra vähem katsealuseid (kontrollitud eksperiment) Võimaldab: määrata ravimi bioloogilist aktiivsust ja terapeudilise toime mehhanisme; tõestada ravimi terapeudilise efektiivsuse antud katse tingimustes; määrata kõrvaltoimed antud katse tingimustes; Puudused: Ei arvesta genotüübi ja keskkonna erinevustest tulenevaid erinevusi ravimi toimes. Seega ei võimalda määrata ka nn. kliinilist efektiivsust; Väike patsientide arv ei võimalda määrata geneetilist variatsiooni reaktsioonis ravimitele, seega ka: standard-doose kõiki võimalikke kõrvaltoimeid Välikatsed- kasutades suurt hulka sama haigust põdevaid patsiente: Eelised iseloomustab populatsiooni geneetilist varieeruvust reaktsioonis ravimitele, kuna uurimise all on

120 113 praktilises mõttes kõik populatsioonis esindatud genotüübid. võimalik on iseloomustada erinevate keskkonnaliste tegurite mõju ravimi toimele; saadud tulemused on statistiliselt usaldusväärsemad Võimaldab määrata: Ravimi standard-doose; Ravimi kõrvaltoimed; kliinilise efektiivsuse. Puudused: raske on ühtlustada haiguse raskusastet, arengustaadiumit jms., erinevad keskkonnatingimused võivad varjutada ravimi efektiivsust; vajalik suur patsientide arv; katsete pikaajaline kestus. Kontrollküsimused IX ptk kohta 1. Farmakogeneetika määrang 2. Farmakogeneetika uurimisobjekt 3. Milles seisneb organismi reaktsioon ravimile? 4. Milles avaldub organismi patoloogiline reaktsioon ravimile? 5. Mis on ravimite suhtes esineva patoloogiliste reaktsioonide peamiseks põhjuseks? 6. Mis on mono-oksügenaaside ülesanne organismis ja milline on nende toimemehhanism. 7. Milliste ravimirühmade suhtes on atsetüül-transferaasi aeglase" fenotüübiga isendid ülitundlikud? 8. Milline võib olla ravimi standard-doosi toime organismile tulenevalt geneetilisest varieeruvusest reaktsioonis ravimitele? 9. Ravimite efektiivsuse määramisel kasutatavad 2 põhilist kliinilist meetodit. Põhimõte. 10. Nimetatud kliiniliste katsete üldised eesmärgid. 11. Mida võimaldab määrata kaksikute meetod ravimite efektiivsuse määramisel. 12. Kaksikute meetodi eelised, puudused. 13. Mida võimaldab määrata ravimi katsetamine arvukatel patsientidel? 14. Välikatsete eelised, puudused.

121 ERÜTROTSÜÜTIDE ANTIGEENNE POLÜMORFISM JA VEREGRUPPIDE GENEETIKA (IMMUNOGENEETIKA) Sissejuhatus Immunogeneetiliste uurimiste alguseks peetakse aastat 1900, mil K. Landsteiner avastas aglutinatsioonireaktsiooni alusel inimese veregruppide ABO-süsteemi a. sai selgeks ka veregruppide geneetiline määratus ja 1910.a. nende pärandumine Mendeli seaduste järgi. Veregruppe määravateks faktoriteks on erütrotsüütide membraanide pinnaretseptorid, mis on immunoloogiliselt aktiivsed e. talitlevad kui antigeenid. Seetôttu nimetatakse neid lihtsalt erütrotsüütide antigeenideks. Erütrotsüütide antigeenide kindlaksmääramiseks kasutatakse spetsiifilisi antiseerumeid, mis sisaldavad erütrotsüüdi teatud antigeeni vastaseid antikehi. Veregruppide määramine põhineb spetsiifiliste antigeenide olemasolu või puudumise tuvastamisel erütrotsüütide pinnal. Seega antigeeni olemasolu määratakse kindlaks antigeen-antikeha reaktsiooni e. immuunreaktsiooni alusel. Terminit "immunogeneetika" hakati seetôttu esmalt kasutama kui môistet, mis tähistab teadust, mis kasutab immunoloogia meetodeid isendite geneetiliste iseärasuste määramiseks. Tänapäeval on sama môiste omandanud uue tähenduse. Seoses inimvôimete täiustumisega geneetiliste uurimiste vallas on täna vôimalik selgitada ka immuunsuse faktorite geneetilist määratust ning seetôttu defineeritakse tänapäeval immunogeneetikat kui imuunsuse geneetikat e. teadusharu, mis uurib immuunsust tingivate faktorite geneetikat. Inimese ABO veregrupisüsteem Inimesel on neli erinevat AB0 süsteemi veregruppi sôltuvalt vastavate erütrotsüüdi retseptorite koostisest (struktuurist). Veregruppe tähistatakse: A, B, AB vôi 0. Nimetatud retseptorid kujutavad endast suhkrute ahelaid, mis on kinnitunud erütrotsüüdi membraanile valgulise jätke abil. Olemas on kolme erineva struktuuriga retseptoreid. Retseptorid erinevad üksteisest viimase suhkrumolekuli poolest ahela lôpus: B puhul on selleks galaktoos (G) A puhul galaktoosi derivaat N-atsetüül-galaktoosamiin (NG) 0 puhul jääb vimmane suhkrumolekul ahelalõppu liitmata. Kas ja milline suhkur ahela tippu seotakse, on määratud 9. kromosoomis paikneva alleeli poolt, mis kodeerib vastavalt kas galaktosüül-transferaasi (g) vôi N-atsetüül-galaktoosaminüül transferaasi (ng) sünteesi vôi ei kumbagi neist (0 e. i alleel). Sôltuvalt sellest, millist ensüümi alleel kodeerib, liidetakse vastav suhkur retseptorile. 0-alleel ei kodeeri ensüümi sünteesi üldse. 114

122 115 Retseptori terminaalse osa struktuurist sõltub omakorda, kas retseptor on ka immunogeenne e. kas immuunsüsteem tunneb selle ära kui antigeeni. Nii selgub, et vaid A ja B tüüpi retseptorid talitlevad kui antigeenid ning põhjustavad antikehade sünteesi, 0 retseptorid aga mitte. Retseptorite struktuur on esitatud joonisel Ensüüme kodeerivad alleelid on tähistatud analoogselt veregruppide tähistusele: A, B ja 0. Alleel A B 0 (i) Alleeli ng g - produkt (ensüüm) Galaktoos 0-retseptor A-retseptor B-retseptor Joonis Inimese AB0-veregrupisüsteemi antigeenide struktuur Seega on vastavas lookuses vôimalikud kolme tüüpi alleelid A, B ja 0. Kuna igal isendil on üks alleel isalt teine emalt, siis järelikult on vôimalikud 6 genotüüpi: AA, BB, AB, A0, B0, 00. Siit tulenevalt, teades alleelide talitluse biokeemilist tausta, on vôimalikud neli fenotüüpi e. veregruppi: A, B, AB ja 0. Alleelid A ja B on teineteise suhtes kodominantsed, kuna môlemad avalduvad AB fenotüübis. 0- alleeli nimetatakse aga "null"-alleeliks, kuna ta kodeerib antigeeni, mis pole avastatav. Null-alleeli loetakse seetôttu ka retsessiivseks. Veregrupisüsteemi all môistetakse antigeene, mida kontrollivad ühe lookuse alleelid. Näiteks inimesel on teine tuntud veregrupisüsteem seotud reesus faktoriga (Rh+ ja Rh-). 115

123 116 Rh- veregrupisüsteem on üks geen kaks alleli süsteemi näide. Geeni produktiks on RhD antigeen e. D antigeen. Geeni poolt kodeeritav proteiin on transmembraanne proteiin, mis koosneb üle 400 aminohappest (vt.joonis ) Joonis Reesus antigeen Vere tüüp Vere tüübiks nimetatakse isendi veregrupisüsteemide summaarset antigeenset valemit. Inmesel näiteks AB Rh positiivne; A Rh negatiivne, jne. 116

124 117 Loomade veregrupisüsteemid Loomadel on veregrupisüsteemide arv erinev. Rahvusvaheliselt on tunnustatud 11 veiste veregrupisüsteemi ja 94 faktorit, 16 sigade veregrupisüsteemi ja 79 faktorit, 7 lammaste veregrupisüsteemi ja 22 faktorit, 7 hobuste veregrupisüsteemi ja 34 faktorit. Loomadel on erütrotsüütide antigeenide pärandumises täheldatud järgmisi seaduspärasusi: (1) osa antigeene on määratud teatud lookustes asuvate üksikute alleelide poolt; (2) osa antigeene pärandub alati koos, moodustades antigeenide kombinatsioonid e. fenogrupid (veisel 2-10 antigeeni). Antigeenide koospärandumise pôhjus pole päriselt selge. Kôige tôenäolisem on, et üks alleel määrab rohkem kui ühe antigeeni sünteesi tugevasti aheldunud geeniosade tôttu. Sellisel juhul määrab üks alleel ära terve fenogrupi omadused. Seega tähistab môiste alleel immunogeneetikas kas antigeenide kompleksi, üksikut antigeeni või nende (selle) puudumist määrava geneetilise lookuse varianti, mis antakse vanemalt järglasele edasi tervikuna (näit. veisel tähistatakse ühte EAB- alleeli: D F G O ) (3) Veregruppe määravad alleelid on kodominantsed. Veregrupifaktorite tähistamine Veregrupi faktoreid tähistatakse suurte ladina tähtedega, millele lisatakse vajadusel ülakomasid ja alaindekseid (A, B, C, D, A', B', A 2 ). Faktoreid tähistatakse vastavalt avastamise järjekorrale, mistôttu näit. A, A' ja A 2 vahel ei ole antigeenset sugulust. Seroloogilisi alatüüpe tähistatakse alaindeksitega (näit. A 1, A 2 jne.). Veiste veregruppide tähistamine, nomenklatuur Veregrupi faktoreid tähistakse nende avastamise järjekorras suurte ladina trükitähtedega. Kuna veiste veregruppide antigeenide tähistamiseks ei piisanud ladina tähestikust, siis võeti täiendavalt kasutusele ülakomad ja indeksid (näit. A, A' ja A 2.). Veregrupi faktorite pärandumise alusel jaotati faktorid geneetilistesse süsteemidesse ja faktoreid, millistel esinesid lineaarsed seroloogilised alatüübid, tähistati alaindeksitega (näit. A 1, A 2 jne.). Geneetilised süsteemid tähistati samuti suurte ladina trükitähtedega. Uuele antiseerumile antakse rahvusvaheline tähistus ainult siis, kui see on valmistatud vähemalt kahes ja soovitatavalt kolmes laboris. Genotüüpe ja fenotüüpe identifitseeritakse lookuse sümboliga, veregrupi faktoreid fenotüüpides ja fenogruppides järjestatakse tähestiku järjekorras. Olemasolevat loomade geneetilist nomenklatuuri otsustati muuta sarnasemaks inimestel kasutatavaga a. tehti ettepanekud veiste, lammaste ja kitsede geneetilise nomenklatuuri täiustamiseks. Näiteks veiste erütrotsütaarste antigeenide (EA) geneetilistele süsteemidele (A, B, C, F, J, L, M, S, Z, R' ja T') soovitati anda uus lookuse tähistus - EAA, EAB, EAC jne. Rahvusvaheliselt 117

125 118 tunnustatud veregrupi faktorite nimetused jäeti muutmata. Väikeste ladina trükitähtedega tähistatakse retsessiivseid alleele. Erütrotsüütide antigeenide (EA) polümorfismi rakendamine EA polümorfismi kasutatakse loomade identifitseerimiseks ja pôlvnemise selgitamiseks. Eriti tôhus on see meetod liikidel, kellel on avastatud palju veregrupisüsteeme, kus on palju erinevaid alleele. See võimaldab kindlaks teha iga looma jaoks ainult temale omane veretüüp. Näiteks on veistel 11 veregrupisüsteemi, kuhu kuulub 94 antigeeni, mida määrab üle 1000 alleeli. Igal isendil on unikalne veretüüp. Igast veregrupisüsteemist omab indiviid kaks alleeli, millest üks pärineb isalt ja teine emalt. Järglasel ei saa olla ühtki verefaktorit, mida ei esine tema vanematel. Lisaks pôlvnemisandmete kontrollimisele on veregruppe kasutatud kui klassikalisi geneetilisi markertunnuseid, mis on seotud muude fenotüübiliste tunnustega (näiteks toodangunäitajate, haigusaresistentsusega). EA polümorfismi kasutatakse ka tõugude ja karjade genofondi ja geneetilise struktuuri uurimiseks, geneetiliste protsesside uurimiseks populatsioonides. On täheldatav teatud alleelide esinemine ühel tôul ja nende puudumine teisel. Samuti on erinevate alleelide sagedus tôuti erinev. Vereülekanded Enamuse veregruppide antigeensete faktorite puhul sünteesib organism antikehad talle vôôra antigeense faktori vastu alles vastava antigeeniga kokkupuutumisel (vereülekandel). Erandiks on siin inimese ABO-süsteem, veiste J-süsteem ja AB-süsteem kassidel, mille puhul esinevad nn. loomulikud antikehad isendile vôôraste antigeenide suhtes ka normaalselt, ilma vastava antigeeniga kokkupuudet. Sellest tulenevalt on vereülekanne inimesel ja kassil vôimalik vaid sobiva veregrupiga isendite vahel. Veiste puhul on J-süsteemi môju suhteliselt nôrk, mistôttu esmasel ülekandel suurt häda sellest ei tulene. Üldiselt loetakse vereülekannet loomadel suhteliselt ohutuks protseduuriks isegi juhul kui veri on tüpiseerimata. Silmas peab pidama siiski järgmisi aspekte: (1) Tüpiseerimata vere ülekandmine sensibiliseerib organismi vastavate antigeenide suhtes ning korduvad ülekanded ei ole vôimalikud; (2) Emasloom vôib sensibiliseeruda oma vôimaliku järglase erütrotsüütide suhtes. Seetôttu on ülekandeks alati soovitatav kasutada tugevat antikehareaktsiooni esilekutsuvate antigeenide suhtes tüpiseeritud verd. Kliinilisest aspektist tähtsamad veregrupisüsteemid on: Koeral A Kassil AB Hobusel A ja Q Veisel A, F ja B (môned antigeenid) 118

126 119 Vastsündinute hemolüütiline aneemia (ingl.k neonatal isoerythrolysis) Pôhjuseks on järglase erütrotsüütide vastu moodustunud antikehad emaorganismis, mis kolostrumiga järglasele manustatult tungivad viimase verre ning hakkavad lôhustama selle erütrotsüüte. Hobusel on selle pôhjuseks verejooksud, mis tekivad tiinuse ja sünnituse käigus ja mille tôttu järglase erütrotsüüdid satuvad ema vereringesse. Veregrupisüsteemid, millega kaasneb selline äge antikehareaktsioon on hobusel A ja Q, kusjuures esimene on sagedasem haiguse pôhjustaja. Ohustatud on A a - ema ja A a + isa järglane, sest heterosügoodina on ta A a antigeeni kandja. Raviks on täielik vere asendamine vastavaid antikehi mittesisaldava verega. Haigust on vôimalik ennetada varsale oma ema ternest mitte andes h jooksul (antikehad ei ole hiljem vôimelised sooleepiteeli läbima). Teades vanemate veregruppe on vôimalik mära vastavate antikehade olemasolu suhtes testida ja nende olemasolul kasutada esimesel elupäeval amme. Kontrollküsimused 10. Ptk. kohta 1. Immunogeneetika môiste. 2. Immunogeneetika uurimisobjekt. 3. Mis määrab ära veregrupi? 4. Inimese AB0 veregruppe määravate retseptorite struktuur. 5. Loetle inimese AB0 veregruppe määravad genotüübid ja nimeta igale genotüübile vastav fenotüüp. 6. Fenotüübilise avaldumise alusel on alleelid A ja B teineteise suhtes.? Millest seda järeldad? 7. Veregrupisüsteemi môiste. 8. Veretüübi môiste 9. Erütrotsüütide antigeenide pärandumise iseärasused loomadel. 10. Fenogrupi môiste veregruppide kontekstis. 11. Alleeli môiste immunogeneetikas. 12. Kuidas tähistatakse veregruppe määravaid alleele? 13. Erütrotsüütide antigeenide polümorfismi kasutamine. 14. Tüpiseerimata vere ülekandmisega seotud ohud. 15. Vastsündinu varssade hemolüütilise aneemia pôhjus. 16. Hemolüütilise aneemia ravi ja profülaktika üldpôhimôtted. 119

127 LOOMADE KARVAVÄRVUSE GENEETIKA Pigmentatsiooni biokeemia Loomade karvavärvus on tingitud põhiliselt ühe pigmendi melaniini, omadustest. Melaniini osa organismis ei piirdu naha, karvkatte ja sulestiku pigmentatsiooniga, vaid ta osaleb ka rakkude ainevahetuses ja nägemisretseptorites toimuvates protsessides ja mõnede teiste organite talitluslikes protsessides. Imetajate karva värvuse määrab pigmendigraanulite melaniinigraanulite olemasolu karvas ning nende sisaldis. Tume karvavärvus (must ja tumepruun ning nende varjundid) on tingitud eumelaniini sisaldusest pigmendigraanulites, hele karvavärvus (punakas ja kollane ning nende varjundid) aga feomelaniinist sisaldusest neis. Kui karv ei sisalda melaniinigraanuleid, siis on ta valge. Valge värvus on tingitud õhumullidest karvas. Õhumullid põhjustavad karva valge värvuse tekkimise samamoodi nagu nad põhjustavad jää valget värvust. Melaniin moodustub aminohappest türosiin, mis läbib pika rea biokeemilisi reaktsioone, mis kõik mõjutavad karva värvust. Melaniin moodustub erilist tüüpi rakkudes melanotsüütides. Nende arv ja hormonaalsed mõjutused neile tingivad samuti karvavärvuse varieerumist. Melanotsüüdis moodustub melaniin spetsiifilistes organellides melanosoomides. Kui melanosoom on täitunud melaniiniga muutunvad nad melaniinigraanuliteks ning nad eritatakse melanotsüüdist naabruses olevatesse rakkudesse (vt. joonis 11.1). Melaniinigraanul Melanosoom Premelanosoom Joonis 11.1 Melanotsüüt

128 121 Melanotsüüte on kahte liiki melanootilised (sisaldavad melanosoome) ja amelanootilised (ei sisalda melanosoome). Amelanootilised melanotsüüdid võivad teatud tingimustes muutuda melanootilisteks ja vastupidi Melanogeneesi geneetiline kontroll (värvuse geenid) Pigmendi moodustumise geneetilise kontrolli mehhanismides on tänaseni palju ebaselget. Karvavärvus kui tunnus on määratud suure arvu geenide koostoime tulemusena. Sellel geenide koostoimel on kvalitatiivne iseloom, kuna iga geen omab selgesti määratletavat iseseisvat toimet. Pigmentatsiooni kujunemist mõjutavad geenid kontrollivad järgmisi protsesse 1) melaniini sünteesi biokeemilised ahelreaktsioonid 2) melaniini koguseline sünteesimine, 3) melaniinigraanulite ehitus, arv ja paigutus 4) melanotsüütide morfoloogia, arvu ja paigutumine. Täna on üldiselt aktsepteeritud seisukoht, et pigmentatsiooni moodustumist ja jaotumist mõjutavad imetajatel peamiselt kuus autosomaalset geenilookust, millest igal ühel on palju erinevaid alleele. Nimetatud lookused on esindatud kõikide imetajaliikide puhul, kuigi kõikidel liikidel ei ole esindatud kõik eksisteerivad alleelid. Kõikidele imetajaliikidele ühised pigmentatsiooni mõjutavad geenilookused on toodud tabelis Lisaks esineb erinevatel loomaliikidel spetsiifilisi pigmentatsiooni mõjutavaid lookusi, nii autosomaalseid kui suguliitelisi. Näiteks kassil esineb autosomaalne vöödilisuse lookus (Tabby T), millel on kolm alleeli: T a abessiinia vöödilisus (Abessinian tabby) T kitsasvöödilisus (striped tabby) t b laigulisus (blotched tabby) Kassil esineb ka suguliiteline oranži värvuse lookus, mille alleel O takistab eumelaniini avaldumist ja alleel o võimaldab normaalset eumelaniini avaldumist. Emastel isenditel on seega võimalik kolm fenotüüpi: OO homosügoodid on ühtlase kollakas-oranži karvavärvusega oo homosügoodid on mustad Oo heterosügoodid aga musta-oranži kirjud Isastel isenditel on võimalik kaks fenotüüpi: O_ on ühtlase kollakas-oranži karvavärvusega o_ ühtlaselt mustad

129 122 Tabel Imetajatele ühiste pigmentatsiooni moodustumist määravate geenilookuste iseloomustus Lookus Sümbol Peamised alleelid Toime Aguuti geen (Agouti) A Dominantne kollane A y Dominantne must A Retsessiivne must ja punakaspruun a t Kontrollib eumelaniini ja feomelaniini jaotumist kehal ja üksikutes karvades, st. tumeda ja kollase pigmendi topograafilist jaotumist kehal Retsessiivne kollane a Eumelaniini värvuse geen (Brown) B Dominantne must B Retsessiivne pruun b Mõjutab eumelaniini kontsentratsiooni. Kodeerib türosinaasilaadset proteiini. Albiino (värvisegeen) C Dominantne värvus C Kodeerib ensüümi türosinaas. Kontrollib (Albino, colour) Lahjendusgeen (Dilution) Eu- ja feomelaniini suhte geen (Extension) Roosasilmsuse lahjendusgeen (Pink-eyed dilution) D E P Retsessiivne valge c Dominantne must D Retsessiivne hõbedane d Dominantne must E Retsessiivne kollane e Retsessiivne vöötsus e br Dominantne must P Retsessivne kollane p pigmentatsiooni olemasolu ja intensiivsust Kodeerib müosiini raskeid ahelaid. Lahjendab eumelaniini ja feomelaniini kutsudes esile pigmendigraanulite kuhjumist kämpudesse. Kodeerib melanotsüüte stimuleeriva hormooni retseptorit. Reguleerib eu-ja feomelaniini suhet karvkattes. Kodeerib membraani transport-proteiini. Mõjutab peamiselt eumelanosoome. Lahjendab rohkem tumedaid värvuseid kui heledaid. Paljudel imetajaliikidel esineb laigulisuse geen S (spotted), mille dominantne alleel annab ühtlase karvavärvuse ja retsessiivne alleel s põhjustab valgete laikude tekke kehal. Kirjusus esineb sarnasel kujul hiirel, küülikul, koeral, veisel, lambal jt. imetakjaliikidel. Lisaks S-geenile põhjustab valgete laikude teket kehal nn. kit-geen. Nimetatud geen reguleerib melanotsüütide migratsiooni kiirust nahas embrüonaalse arengu käigus. Kit-geen kodeerib raku kasvufaktori retseptorit. Nimetatud retseptori defitsiidi korral melanotsüütide paljunemine aeglustub ja väheneb nende liikuvus. Seetõttu ka melanotsüütide levik nahas pidurdub, ning tulemuseks on valged laigud kehal Värvuse päritavus Ülevaade erinevatel loomaliikidel ja tõugudel esinevate värvusgeenide kohta ja värvuse päritavuse kohta on toodud K. Christenseni veebiraamatus: Population genetics, kus on ka viiteid teistele veebilehtedele täpsema informatsiooni saamiseks loomaliigiti. Üldistatult olgu öeldud, et kuigi karvavärvuse päritavus vastab põhimõtteliselt mendelistlikele seaduspärasustele, tuleb tegelikkuses sellega seoses ette mitmeid komplikatsioone. Näiteks esineb geenide koosmõju (interaktsioon) karvavärvusele epistaas. Epistaasi tõttu võib mõni geen varjutada teise geeni toime täielikult. Näiteks kassidel varjutab mitteaguuti alleel selle suhtes homosügootsetel isenditel vöödilisuse alleelide toime ning selline kass on ühtlaselt must. Järglaste hulgas võib aga jällegi olla vöödilisi isendeid (heterosügootsed mitteaguuti alleeli suhtes).

130 123 Teine probleem seisneb selles, et erinevate lookuste alleelid võivad põhjustada ühte ja sama karvavärvust eri isenditel. See on tekitanud veelgi segadust nii aretajate kui teadlaste hulgas karvavärvuse päritavuse selgitamisel Mutatsioonid karvavärvuse geenides Mutatsioonidega melanoblastide moodustumist ja migratsiooni määravates geenides kaasneb enamasti pleiotroopne efekt. Näiteid selle kohta vt. Teinberg, Olgu siin nimetatud mõned: 1) valge sinisilmne kass on kurt teatavate närvirakkude alaarengu tõttu. 2) Kirjud koerad kannatavad sageli mitmete defektide all. Kirjususe alleel (merle) M on kodominantne karvavärvuse suhtes, kuid retsessiivne mitmete defektide suhtes. MM koertel on täheldatud mitmeid silmadefekte alustades kataraktist, lõpetades mikroftalmia ja silmade puudumisega, kuulmislangust ja kurtust, sigimattust. 3) Kirjud hiired on kurdid ja neil esineb närvisüsteemi häireid 4) Dominantne valge värvuse geen hobustel (Overo värvus) on homosügootsuse korral letaalse efektiga (letaalne valge varsa sündroom). Surma põhjuseks on soole ummistus, kuna jämesoole distaalses osas puuduvad närviganglionid. Kasutatud kirjandus Christensen, K., Population genetics, R. Teinberg. Põllumajandusloomade erigeneetika, Valgus, Tallinn, F. W. Nicholas. Veterinary Genetics. Clarendon Press, Oxford, 1988 F. W. Nicholas. Introduction to Veterinary Genetics., Oxford University Press, 1996 Kontrollküsimused 11. Ptk. 1) Mis ainega on seotud imetajate karvavärvus, millest see tekib ja millised on selle aine vormid organismis? 2) Milliste rakkude ja milliste rakustruktuuridega on seotud pigmentatsiooni teke. 3) Milline pigment tagab heleda karvavärvuse, milline tumeda ja millest tuleneb valge karvavärvus? 4) Pigmentatsiooni tagavate geenide koostoime olemus. 5) Pigmentatsiooni kujunemist mõjutavate geenide kontrollitavad protsessid organismis. 6) Pigmentatsiooni määravad geenid eri imetajaliikidel üldiseloomustus. 7) Pigmentatsiooni geenide kromosomaalne lokalisatsioon. Too näiteid. 8) Millised on värvuse pärandumise üldised seaduspärasused? 9) Milline geenide koostoime vorm ilmneb mutatsioonide korral karvavärvuse geenides?

131 MIKROOBIGENEETIKA ALUSED Mikroobid (bakterid ja viirused) on geneetika eelistatumaid uurimisobjekte. Selle põhjuseks on mikroobide järgmised omadused: haploidsus, lühike elutsükkel, arvukas järglaskond, kasv ja areng toimub labori tingimustes. Need omadused võimaldavad avastada väga madala sagedusega rekombinatsioone, mis võimaldab uurida harva esinevaid geneetilisi protsesse, geenide ehitust ning järjestust. Veterinaaria seisukohalt on vajalik tunda mikroobide muutlikkuse mehhanisme, kuna see mõjutab oluliselt epizootilise protsessi kulgu nagu ka nakkushaiguste ravi ja profülaktikat. Huvi pakuvad ka peremehe ja patogeeni interaktsioonid ning koevolutsioon. Lisaks on tähtis tunda mikroobide ravimresistentsuse mehhanisme, mis võimaldab: 1) astuda samme ravimresistentsete mikroobitüvede tekkimise vältimiseks, 2) teisalt aga luua tõhusaid antimikroobseid ravimeid BAKTERI GENOOMI STRUKTUUR JA FUNKTSIOONID Bakterite geneetiline materjal, tavaliselt ühe DNA molekuli näol, asub tsütoplasmas kompaktse moodustisena, mida nimetatakse nukleoidiks ehk bakteriaalseks tuumaks. Nukleoid ei ole ümbritsetud plasmamembraaniga. Enamusel bakteritest on üks nukleoid, kuid esineb ka niidikujulisi bakterivorme, kellel on kuni 8 nukleoidi. Nukleoid on kujult amorfne sõltudes bakteri välisest kujust. Nukleoidi moodustav DNA molekul kujutab endast topeltahelalist suletud ringi ja seda nimetatakse ka bakteri kromosoomiks. Kromosoomi moodustava DNA molekuli pikkus E. coli'l on 1 mm, mis ületab 1000 korda tema välised mõõtmed. Selleks, et bakterirakku ära mahtuda, on DNA biheeliks omakorda keerdunud. Lisaks moodustab topeltkeerdunud ahel aasasid (18-20). Paljudel bakteritel ei asu aga geneetiline informatsioon ainult nukleoidis. Lisaks sellele leidub neis eraldi asetsevaid, väiksemaid DNA molekule, mis moodustavad struktuure, mida nimetatakse plasmiidideks. Plasmiid on kaksikspiraalne DNA rõngasmolekul, mille molekulmass varieerub küllaltki

132 125 suurtes piirides. Plasmiidid asuvad vabalt tsütoplasmas või on liitunud kromosoomiga. BAKTERI GENOOMI all mõistetakse geneetilist informatsiooni kandvate elementide kogumit bakterirakus. Bakteri genoom koosneb sageli kahest alaosast: kromosoomist ja plasmiidi(de)st. Vastupidiselt eukarüootidele, kelle mittekasvavad rakud on enamuses diploidsed, on mittekasvavad bakterirakud (prokarüoodid) haploidsed. Kasvufaasis sisaldab bakterirakk alati teatud osa kromosoomist dubleerituna, kuna enne pooldumist peab valmis olema uus koopia kromosoomist. Bakteri genoomis leiduv geneetiline informatsioon realiseerub proteiinide sünteesil ja väljendub bakteri fenotüübis. Bakteri fenotüüp on bakteri sisemiste ja väliste tunnuste kogum, mis kujuneb genotüübi realiseerumisel konkreetsetes keskkonna tingimustes. Genotüüp pärandub põlvkonnast põlvkonda ja on väga püsiv. Fenotüüpi mõjustavad oluliselt bakteri kasvutingimused. Ühe bakteriraku järglased moodustavad tüve e. klooni. Seega on ühe tüve bakterid praktiliselt identse genotüübiga PROTEIINIDE SÜNTEESI GENEETILINE REGULATSIOON Enamus proteiine, mis bakterites sünteesitakse, on ensüümid, mistõttu kõneldes proteiinisünteesist samastatakse see tavaliselt ensüümisünteesiga. Ensüümid on kas konstitutiivsed, mida sünteesitakse pidevalt ja mida leidub bakterirakkudes alati suhteliselt kõrges kontsentratsioonis või adaptiivsed e. indutseeritavad, mida sünteesitakse vaid teatud tingimustes e. teisisõnu: induktorite manulusel. Põhilised proteiinide sünteesi regulatsiooni mehhanismid on järgmised : 1) induktsiooni-repressiooni mehhanism; 2) kataboliidi poolt vahendatud repressioon; 3) sünteesi nõrgestamine. Kõik nimetatud mehhanismid talitlevad geneetilise informatsiooni transkriptsiooni tasandil DNA-lt mrna-le. Kõigi nende ülesandeks on geeni väljalülitamine olukorras, kus antud ensüümi ei ole tarvis. 1) Induktsiooni ja repressiooni mehhanismi on haaratud mitu aheldunud geeni bakteri kromosoomis. Nimetatud geenid kodeerivad mitut ensüümi, mis koostoimes vastutavad teatud energiaallika kasutamise eest. Nimetatud aheldunud geenide kogum moodustab funktsionaalselt

133 126 tervikliku ühiku, mida nimetatakse operoniks. Operoni kõrval asuvad geenid, mis reguleerivad tema talitlust. Nendeks on promootor- (P), regulaator- (I) ja operaatorgeen (O). Paremini tuntud operoniks on E. coli laktoosi operon, mis reguleerib algstaadiumis (P), regulaator- (I) ja operaatorgeen (O). Paremini tuntud operoniks on E. coli laktoosi operon, mis reguleerib algstaadiumis laktoosi katabolismi. See koosneb kolmest aheldunud geenist: 1) Z- kodeerib ensüümi ß-galaktosidaasi, mis lõhustab galaktosiidi sisaldavad disahhariidid monosahhariidideks; 2) Y- kodeerib ensüümi galaktosiidpermeaasi, mis asub plasmamembraanis ja võimaldab galaktosiidi transporti bakterirakku; 3) A- kodeerib galaktosiid atsetülaasi, mille osa laktoosi katabolismis ei ole selge. Joonisel on kujutatud operoni ja regulaatorgeenide asetust kromosoomis. P I O Z Y A P promootor I- regulaator O- operaator ZYA- operon Joonis Operoni skeem Operoni struktuursetes geenides kodeeritud ensüümide sünteesimiseks seondub ensüüm RNA-polümeraas promootoriga. Esmalt transkribeeritakse regulaatorgeenis (I) talletunud informatsioon, mille tulemusena sünteesitakse repressor proteiin, mis seondub laktoosi puudumisel vabalt operaatorgeeniga (O), mis takistab edasist transkriptsiooni ning operonis kodeeritud ensüümid jäävad sünteesimata. Kui keskkond (sööde) sisaldab laktoosi, siis see talitleb operoni induktorina seeläbi, et muudab repressori inaktiivseks, mistõttu transkriptsioon võib operonil jätkuda ning sünteesitakse ß- galaktosidaas, permeaas ja A-valk. 2) Kataboliidi poolt vahendatud repressioon Tingimustes, kus keskkond sisaldab nii glükoosi kui galaktoosi, eelistab E. coli energiaallikana glükoosi. Seejuures vaatamata laktoosi olemasolule keskkonnas laktoosi operon sisse ei lülitu. Seega glükoos talitleb repressorina laktoosi operoni suhtes ja seda seeläbi, et takistab RNA-polümeraasi seondumist promootoriga.

134 127 3) Sünteesi nõrgestamine Vaatame seda trüptofaani sünteesi kodeeriva operoni talitluse näitel. Trüptofaani operon koosneb viiest struktuursest geenist, mis kodeerivad viit ensüümi, mis on vajalikud vaheproduktidest trüptofaani saamiseks. Nendega külgneb regulaator-geenide rühm, kuhu kuuluvad promootor, operaator ja nn. juht-geen. Juht-geenis on fragment, mida nimetatakse nõrgestajaks. Nõrgestaja kodeeritavat peptiidi nimetatakse juht-peptiidiks. Juht-peptiid sisaldab ohtralt trüptofaani ja seda sünteesitakse tingimustes, kus trüptofaani sisaldus rakus on kõrge. Vastupidi, kui trüptofaani sisaldus on rakus madal, siis juht-peptiidi ei sünteesita. nimetatakse nõrgestajaks. Nõrgestaja kodeeritavat peptiidi nimetatakse juht-peptiidiks. Juhtpeptiid sisaldab ohtralt trüptofaani ja seda sünteesitakse tingimustes, kus trüptofaani sisaldus rakus on kõrge. Vastupidi, kui trüptofaani sisaldus on rakus madal, siis juht-peptiidi ei sünteesita. Juhtpeptiidi ülesandeks on blokeerida struktuursete geenide transkriptsioon. Seega trüptofaani rikkas keskkonnas on trüptofaani süntees rakus pidurdatud, trüptofaani vaeses keskkonnas juht-peptiidi ei sünteesita ja trüptofaani süntees võib käivituda. Kokkuvõtvalt võib öelda, et kaks esimest regulatsiooni mehhanismi toimivad kataboolsete e. energiat vabastavate protsesside puhul, seevastu viimane anaboolsete e. energiat tarbivate protsesside puhul. Kui kataboolsete protsesside puhul blokeerib teatud ensüümi sünteesi protsessi algprodukt, siis anaboolsete protsesside puhul lõpp-produkt.

135 GENEETILISE VARIATSIOONI ALLIKAD BAKTERITEL Mikroobide puhul on otstarbekas rääkida kahte tüüpi järskudest e. ootamatutest ja päritavatest muutustest genoomis. Need on: (1) mutatsioonid, mille puhul muutus toimub rakuvälise geneetilise informatsiooni osaluseta ja (2) rekombinatsioonid, mille puhul muutuse põhjuseks on rakuväline geneetiline informatsioon, mis liitub genoomiga Mutatsioonid Looduslikes bakterpopulatsioonides on mutatsiooniline muutlikkus eelkõige seotud spontaansete mutatsioonidega. Spontaansed mutatsioonid on sellised, mis on tekkinud nähtava välise põhjuseta. Nad tekivad peamiselt DNA replikatsioonil tekkivate vigade tulemusena. Spontaansete mutatsioonide sagedus on väga väike, kuna DNA-replikatsiooni täpsus on üldiselt väga suur. Spontaansete mutatsioonide esinemissagedus kõigub erinevates geenides 1: : 10 9 raku kohta. Bakteritel on kõige sagedasemad geenmutatsioonid e. punktmutatsioonid, mis muudavad ühe geeni talitlust. Harvadel juhtutel esineb ka kromosoommutatsioone- deletsioone, inversioone, duplikatsioone ja translokatsioone. Mutatsioonide sagedust suurendavaid aineid kutsutakse mutageenideks. Keemiliste mutageenide hulka kuuluvad anorgaanilised ja orgaanilised happed, leelised, ammooniumsoolad, ülihapendid, formaldehüüd, fenoolid, karbamiid, akridiinid, jood, ipriidi analoogid jm. Füüsikaliste mutageenide hulka kuuluvad kiirgused. Mutageenide toimel võib mutatsioonide sagedus tõusta mitmeid kordi. Veterinaaria seisukohalt pakuvad kõige rohkem huvi (1) mutatsioonid, mis mõjustavad bakterite resistentsust antibiootikumidele, (2) morfoloogilised mutatsioonid, mis mõjutavad virulentsust ja antigeenseid omadusi. (1) Antibiootikumide resistentsed mutandid Lisades näiteks streptomütsiinitundliku bakteri söötmesse streptomütsiini, ei hävi mitte kõik bakterid. Vaatamata spontaansete mutatsioonide väiksele sagedusele leidub bakterpopulatsioonis siiski mõni isend, kellel streptomütsiiniresistentsust kindlustav mutatsioon on tekkinud. Antibiootikumiresistentsus võib mutantidel olla erinev: ühed taluvad väikeseid, teised keskmisi, kolmandad kõrgeid doose, neljandad on langenud antibiootikumist sõltuvusse ja ilma enam ei kasvagi.

136 129 Resistentsus antibiootikumide suhtes tõuseb astmeliselt. Kõrgetele annustele vastupidava mutandi saamiseks tuleb teha ümberkülve järjest suurenevate antibiootikumi-kontsentratsiooniga söötmetele. Iga mutatsioon suurendab resistentsust geomeetrilises progressioonis (kahe, nelja, kaheksa jne toimeühiku võrra). Selleks, et ravi käigus vältida resistentsete tüvede selekteerumist, tuleb ravi alustada suurte doosidega. (2) Morfoloogilised mutatsioonid Morfoloogilised mutatsioonid on seotud eoste moodustumise, viburite ja rakuseina ehitusega. Samad tunnused on seotud ka bakterite virulentsusega. Mutatsioonid põhjustavad varieeruvust viburite, narmaste ja kapsli valgulises koostises, mille tagajärjeks on erinevate seroloogiliste variantide tekkimine. Mutatsioonide tagajärjel võivad ka viburid, narmad ja kapsel hoopistükkis kaduda. Kliinilises mikrobioloogias sageli ettetulev nähtus on siledate kolooniate (S-vormi) muutumine karedateks (R-vorm). Selle põhjuseks on bakteri kapsli kadumine, kuna kapslita mutandid on söötmetel kasvades elujõulisemad. Samal ajal on kapsliga S-vormi bakterid virulentsemad, kuna nad on raskemini fagotsüteeritavad. Kui R-vormi bakterid viia tagasi looma sisse, on peagi võimalik isoleerida S-vormi, kuna elusloomas on nemad eluvõimelisemad ja vastavad mutandid selekteeruvad välja. Kunstlikes kasvutingimustes kaotavad näiteks kolibakterid oma narmad, mistõttu muutuvad avirulentseks. Kuna viburi- ja kapslivalgud on bakteri antigeensed determinandid, siis vaktsiinide tootmisel on probleemiks, kuidas kasvatada baktereid kunstlikes tingimustes nii, et nende antigeensed omadused säiluksid Rekombinatsioonid Rekombinatsiooni protsessi bakteritel võib jaotada 4 etappi: 1) uue geneetilise informatsiooni sisestamine bakterirakku, 2) selle liitumine bakteri kromosoomiga (mitte alati), 3) liitunud DNA replikatsioon ning 4) geeni fenotüübiline avaldumine.

137 130 Uus geneetiline materjal võidakse sisestada bakterisse kolmel erineval moel: 1) transformatsiooni, 2) transduktsiooni ja 3) konjugatsiooni teel. (1) Transformatsioon Transformatsioon on ühe bakteri lõhustumisel vabanenud DNA lihtne ülekanne teise bakterisse, mille puhul retsipientbakterirakk haarab endasse ümbritsevas keskkonnas leiduvaid DNA fragmente. Transformatsioon esineb Diplococcus, Hemophilus, Bacillus, Actinomyces jt. mikroobiperekondade liikidel. Transformatsiooni eelduseks on: 1) vaba DNA olemasolu doonor tüvelt 2) kompetentsed retsipientrakud, kes on võimelised DNA-d siduma, transportima selle oma tsütoplasmasse ning integreerima kromosoomi. Vaba DNA pärineb lüüsunud bakteritest, kelle DNA laguneb fragmentideks. Kompetentne retsipient on võimeline siduma neist vaid väheseid. Rakkude kompetentsus transformatsiooniks on lühiajaline ning on piiritletud eksponentsiaalse kasvufaasiga, millal bakterirakk produtseerib nn. kompetentsusfaktorit, mis võimaldab DNA-ahelate seondumist raku pinnale. DNA seostub kindlatesse liitumiskohtadesse ning transporditakse raku sisse täna tundmata mehhanismi abil. DNA liitumine bakteri kromosoomiga on analoogne krossing-over'ile, kus liidetava DNAfragmendiga analoogne fragment lõigatakse kromosoomist välja ning asendatakse uudis-dna-ga.

138 KONJUGATSIOON Konjugatsioon kujutab endast bakteritevahelist ristumist, mille eelduseks on bakterirakkude vaheline füüsiline kontakt ja mille tulemuseks on geneetilise informatsiooni ülekandumine doonorrakult retsipiendile. Ülekanduv geneetiline materjal on kas plasmiid vôi kromosoomi osa, mis on palsmiidiga seondunud. Plasmiidid on autonoomsed kromosoomivälised geneetilised elemendid. Plasmiididel leiduv geneetiline informatsioon vôib fenotüübiliselt avalduda, kuid tunnused, mida plasmiidis olevad geenid kodeerivad ei ole hädavajalikud bakteri elutegevuseks, vaid on seotud teatud spetsiifiliste bakteri omadustega. Näiteks vôime talitleda doonorina, antibiootikumide jm. kemikaalide resistentsus, naftaliini ja teiste orgaaniliste ainete lôhustamise võime. Plasmiide on leitud kôigil tänapäeval tuntud bakteritel. Plasmiid kujutab endast kaksikspiraalset DNA rôngasmolekuli, mille suurus varieerub suures ulatuses. Plasmiidide replikatsioon toimub analoogselt kromosoomi replikatsiooniga, kuid viimasest sôltumatult. Tavaliselt sisaldab rakk ühe plasmiidi mitu koopiat. Doonorrakkudeks on konjugatsioonil bakterid, kes omavad sugufaktorit (F-faktor) sisaldavat plasmiidi. Gram-negatiivsetel bakteritel kodeerib F-faktor nn. sugujätke sünteesi rakumembraanil. Sugujätke abil avastab doonorrakk retsipientraku ja kinnitub sellele, misjärel saab vôimalikuks püsiva kontakti moodustumine rakkude vahel, mis vôimaldab omakorda geneetilise informatsiooni ülekandmist. Ka ülekantavaks plasmiidiks on F-faktoriga plasmiid. Plasmiidil leiduva geneetilise informatsiooni ülekandeks doonorraku plasmiidi kaksikahela üks ahel katkeb ja eraldub plasmiidist ning lineaarsel kujul liigub retsipiendi rakku. Samal ajal toimub plasmiidi DNA replikatsioon, nii et môlemad ahelad omandavad sôsarahelad. Seejärel moodustab retsipientrakku liikunud DNA ahel taas ringi, millega plasmiidi ülekanne on

139 132 lôppenud. Seega konjugatsiooni tulemusena saab retsipient F-faktoriga plasmiidi omandades sellega ühtlasi doonori vôimed. Kuna lisaks F-faktorile sisaldab plasmiid rohkesti ka muud geneetilist

140 133 informatsiooni, siis omandab retsipient ka muid fenotüübilisi tunnuseid. Kromosomaalse DNA ülekanne plasmiididele toimub transposoonide vahendusel. Transposoonid- ümberpaiknemisvôimelised geneetilised elemendid (transposable genetic elements- TGE) avastati 1970-ndate keskel. Transposoonid on rändavad DNA elemendid, mis migreeruvad nii kromosoomi piires kui nende vahel. Bakterites liiguvad nad kromosoomi piires ja plasmiidide vahel vôi kahe nimetatu vahel. Nad vôivad liituda ka faagi DNA-ga ja vabastada end sellest. Struktuuriliselt sisaldavad transposoonid insertsiooni segmente. Transposoonid on vôimelised kandma fenotüübiliselt avalduvaid geene. Kôige sagedamini kannavad nad antibiootikumide-resistentsuse geene. Transposoonid vôivad konjugatsioonil ka iseseisvalt ülekanduda ühest bakterirakust teise. Konjugatsiooni veterinaarne tähtsus Konjugatsiooni teel kanduvad edasi antibiootikumide resistentsust pôhjustavad geenid. Selle efektiivsus on väga suur, mis tähendab, et resistentsus (R) faktor vôib levida bakterpopulatsioonis vôrdselt bakteri paljunemise kiirusega. Selle pôhjuseks on asjaolu, et R- faktoriga plasmiid omab ka F-faktorit, mistôttu koos antibiootikumi resistentsusega levib ka konjugatsiooni algatamise vôime. Konjugatsiooniga levivad ka bakterite virulentsuse faktoreid kodeerivad geenid. E. coli puhul on leitud, et tema epiteeliga liitumiseks vajalik kesta proteiin- K kodeeritakse plasmiidis asuva geeni poolt. Samuti kaks toksiini (hemolüsiin ja enterotoksiin). Sama on täheldatud ka Staph. aureuse puhul, kus plasmiidis asuvad geenid produtseerivad mitmeid patogeensuse faktoreid (koagulaas, enterotoksiin, hemolüsiin, fibrinolüsiin).

141 TRANSDUKTSIOON Faagide geneetika (1) Bakteriofaagid e. faagid e. bakterite viirused on nagu kôik viirused obligatoorsed rakuparasiidid, mis tähendab, et nad kasutavad oma elutegevuseks ja paljunemiseks peavad teiste organismide rakkude ainevahetusmehhanisme. Faagide ehitus on väga varieeruv. Leidub nii DNA-d kui RNA-d sisaldavaid faage, kusjuures nukleiinhappe ahel vôib olla nii ühe- kui kahekordne. Faagid on ümbritsetud proteiinkapsliga, mille kuju on eri liikidel erinev. DNA-d sisaldavad faagid vôib jaotada suurteks ja väikesteks. Suured DNA-faagid sisaldavad topeltahelaga DNA-d. Nende välises struktuuris vôib eristada kahte osa: päist ja saba. Mônedel sabaga faagidel on see varustatud peente jätketega- filamentidega. Päis sisaldab DNA-d, saba abil kinnitub faag rakule. Päis Kael Saba Filamendid Väikesed DNA-faagid on ilma sabata ja sisaldavad üheahelalist DNA-d. RNA-d sisaldavad faagid on väikesed ja RNA molekul neis on üksikahel. Toime poolest bakterirakule jaotatakse faage virulentseteks e. lüütilisteks ning mõõdukateks faagideks. (2) Lüütilise faagi paljunemine Lüütiline faag pôhjustab rakku tungimisel alati selle lôhustumise e. lüüsi. Lüütilise faagi paljunemisel on täheldatavad 6 pôhilist etappi, mis on ühisomased väga paljudele viirustele, kuid milles on faagide puhul môningased erinevused: 1) seondumine rakupinnale; 2) rakukesta läbimine: faagide puhul sisestatakse vaid nukleiinhappe molekul (eukarüootide viiruste puhul sisestatakse kogu viiruspartikkel); 3) raku proteiinide sünteesi blokeerimine viiruse DNA vôi RNA poolt ning DNA lôhustamine; 4) paljunemine: peremeesraku sünteesimehhanismide rakendamine viiruse proteiinide produtseerimiseks; 5) liitumine: viiruspartiklite moodustumine sünteesitud kapsli proteiinidest ja replikeerunud nukleiinhapetest;

142 135 6) uute viiruspartiklite vabanemine rakust: faagide puhul kaasneb alati bakteriraku lüüs (kôrgemate organismide viirused ei lüüsi alati rakku). Kirjeldatud reproduktsioonitsüklit nimetatakse faagide puhul lüütiliseks tsükliks, kuna selle tulemuseks on alati bakteri lüüsumine. Joonis Lüütilise faagi paljunemine (3) Môôdukad faagid ja lüsogenees Môôdukate faagide paljunemine erineb mitmeti lüütilisest tsüklist: 1) pärast nukleiinhappe molekuli sisestamist bakterirakku integreerub see bakteri kromosoomiga. Bakteri kromosoomiga integreerunud faagi genoomi nimetatakse profaagiks. Profaag paljuneb koos bakteri paljunemisega kandudes edasi bakteri tütarrakkudesse. Bakterit, mis kannab profaagi oma kromosoomis ja kus see ühtlasi paljuneb, nimetatakse lüsogeenseks bakteriks. Kogu eelkirjeldatud protsessi aga lüsogeneesiks. 2) môôdukate faagide need geenid, mis kontrollivad viiruspartikli osiste sünteesi, on blokeeritud spetsiaalse repressori abil. Viiruse proteiinide süntees käivitub nimetatud repressori inaktiveerumise korral. Pärast viiruspartiklite moodustumist rakk lüüsub, partiklid vabanevad ja levivad järgmistele bakterirakkudele. Profaagi on vôimalik aktiveerida môjutades baktereid mutageenidega (näit. UV-kiirgus), mis kahjustavad DNA-d ja käivitavad taastamismehhanismid. Selle tulemusena häiritakse repressioonimehhanismi ning praktiliselt kôikides profaagi kandvates bakterites algab faagide paljunemine. Sellist bakterkultuuri môjutamist nimetatakse faaginduktsiooniks. Normaalsetes tingimustes toimub profaagi aktiveerumine ka spontaanselt, kuigi küllaltki väikese sagedusega, ca 1:1000 lüsogeensest bakterist. Môôdukad faagid on väga sagedased bakterpopulatsioonides ja enamus isoleeritud faagidest ongi môôdukad. Seega vôib kônelda teatud sümbioosist bakterite ja faagide vahel.

143 Joonia Mõõduka faagi paljunemine 136

144 Transduktsioon Transduktsioon on geenide ülekanne ühest bakterirakust teise bakteriofaagi abil. Transduktsiooni ülesanne on praktiliselt sama, mis transformatsioonil. Erinev on vaid geneetilise informatsiooni ülekande mehhanism. Transduktsiooni puhul seotakse bakteri geenid faagiga viiruse replikatsioonil tekkivate vigade tôttu. Nimelt viiruspartiklite liitumise käigus haaratakse viiruse kapslisse kas ainult bakteri kromosoomi fragment vôi nii faagi kui bakteri DNA-d korraga. Tekkinud hälbinud faagi nimetatakse transduktsiooni partikliks. Transduktsiooni-partiklid on selles môttes defektsed, et nad ei pôhjusta kunagi selle raku lüüsumist, millesse nad oma DNA sisestavad. Pärast doonorrakust pärineva DNA sisestamist retsipientrakku toimub esimese integratsioon viimase kromosoomiga sarnaselt transformatsiooniprotsessile. Eristatakse kahte tüüpi transduktsiooni: 1) Üldine ehk mittespetsiifiline transduktsioon. Sel puhul võib üle kanduda retsipientbakteri ükskõik missugune geen. Mittespetsiifiline transduktsioon vôib toimuda nii môôdukate kui lüütiliste faagide vahendusel. Transduktsiooni-partikli moodustumine pôhineb sellel, et peremeesraku DNA lôhustamisel moodustub DNA-fragmente, mis on faagi genoomi môôtmetega, mistôttu neid vôidakse haarata faagi kapslisse faagi-partikli moodustumisel. Samuti vôib juhuslikult sattuda faagi kapslisse bakteri DNA väiksemaid fragmente. Mittespetsiifilise transduktsiooni sagedus on madal, kuna kirjeldatud viisil transduktsioonipartikli moodustumise tôenäosus on väike. 2) Spetsialiseeritud (spetsiifiline) transduktsioon. Sel puhul kandub üle vaid väike arv bakteri geene ja need geenid on alati ühed ja samad. Spetsiifiline transduktsioon toimub vaid môôdukate faagide vahendusel, kes integreeruvad bakteri kromosoomi alati ühes ja samas kohas. Transduktsiooni-partikkel moodustub järgmiselt: Mõõduka faagi paljunemise protsessis eraldub profaag bakteri kromosoomist. Enamasti "lôigatakse" profaag bakteri kromosoomist välja môningase ebatäpsusega, mis tähendab, et kaasa haaratakse ka pisut bakteri DNA-d. Seega faagi DNA-paljunemisega paljuneb ka bakteri DNA-fragment ning kôik moodustuvad partiklid sisaldavad ka bakteri geene. Faagi edasikandumisel kanduvad edasi ka bakteri geenid.

145 138 Kuna ebatäpsused profaagi replikatsioonil on suhteliselt sagedased, on ka spetsiifiline transduktsioon suhteliselt sage nähtus. Transduktsiooni veterinaarmeditsiiniline tähtsus Transduktsiooni teel kanduvad edasi geenid, mis kontrollivad bakterite virulentsust, mistôttu mittevirulentsed tüved vôivad muutuda virulentseteks. Seda on täheldatud näiteks Clostridium botulinumi ja Staphylococcus aureuse puhul. Antibiootikumide resistentsuse geenide ülekanne transduktsiooni teel on harvaesinev.

146 139