XI. GENOOMIKA. Genoomika

Transcript

1 XI. ENMIK Mõiste genoom (ingl. genome e. ENes and chromosmes) võttis geneetikas kasutusele juba a. Hamburgi ülikooli botaanikaprofessor Hans Winkler tähistamaks organismi kromosoomide täielikku kogumit koos neis sisalduvate geenidega. änapäeval kasutatakse seda mõistet tähistamaks organismi üht terviklikku kromosoomikomplekti, samuti organismi geneetilise informatsiooni terviklikku koopiat. Seevastu mõiste genoomika (ingl. genomics) on suhteliselt uus, mille võttis esmakordselt a. kasutusele US geneetik homas H. Roderick tähistamaks geneetika aladistsipliini, mis tegeleb kogu genoomi kaardistamise ja sekveneerimise ning funktsionaalse analüüsiga. Sellealased esimesed tööd, et sekveneerida inimese mitokondriaalne DN ja bakteriofaag λ DN, tehti inglise biokeemiku Frederick Sangeri (snd. 1918) (kahekordne Nobeli keemiapreemia laureaat) grupi poolt siiski juba varem ( ). arenedes tekkis vajadus eristada erinevaid genoomika tegevusvaldkondi: 1) struktuurne genoomika (ingl. structural genomics) e. genoomi struktuuri uurimine; 2) funktsionaalne genoomika (ingl. functional genomics) e. genoomi funktsiooni uurimine; 3) võrdlev genoomika (ingl. comparative genomics) e. genoomi evolutsiooni uurimine. erinevad tegevusvaldkonnad lähtuvad genoomi DN-järjestuse uurimisest, põhinedes DN-järjestuse määramisel e. sekveneerimisel (ingl. sequencing). Struktuurne genoomika tegeleb kogu genoomi tasemel määratavate kõikide valkude kolmemõõtmelise struktuuri kirjeldamisega, ka siis, kui valgu funktsioon pole teada. Seda teadusharu võib nimetada ka struktuurseks bioinformaatikaks (ingl. structural bioinformatics). Konkreetse organismi kõikide valkude kogumit nimetatakse aga proteoomiks (ingl. proteome). Mõistega proteoomika (ingl. proteomics) tähistatakse seejuures organismi valkude struktuuri ja funktsioonide uurimist ning selle võttis a. esmakordselt kasutusele ustraalia geneetik Marc R. Wilkins. Funktsionaalsele genoomikale lisandub geeni esmaavaldumise uurimine, milleks on eelkõige mrn transkriptide uurimine. Mõistetega transkriptoom (ingl. transcriptome) ja transkriptoomika (ingl. transcriptomics) tähistame genoomilt transkribeeritud RN-de kogukomplekti ning selle uurimist. Kõiksuguseid genoomitasemelisi genoomi struktuuri ja funktsiooni uurimisi 319

2 nimetatakse sageli lihtsalt oomikateadusteks (ingl. omics). Lisaks ülalnimetatutele on siin veel kitsamaid distsipliine, nagu fenoomika (ingl. phenomics) fenotüüpide uurimiseks, interaktoomika (ingl. interactomics) interaktsioonide uurimiseks, metaboloomika (ingl. metabolomics) metabolismi uurimiseks jne. arengus eristatakse viit pöördelist metodoloogilist arenguetappi e. paradigmade muutumist. Huvitaval kombel toimusid muutused inimmõttes kümneaastase tsüklina (jn. 11.1): a. kromosoomide geneetika (kromosomoloogia); a. somaatiliste rakkude geneetika; a. molekulaargeneetika; a. transgeenne tehnoloogia; aastate alguses esimene bakterigenoomi järjestuse määramine (Pat Browni poolt), esimene mrn mikrokiibi publitseerimine ning a. esimese eukarüootse genoomi (S. cercvisiae) sekveneerimine. Sellele järgnes a. mulla nematoodi (. elegans) genoomi täielik sekveneerimine. Paralleelselt ja väga kiiresti arenes andmeanalüüs (ingl. database searching or research in silico ), mistõttu sai võimalikuks täpsete füüsiliste molekulaarmudelite täiustamine bioloogiliste struktuuride in silico (arvutisimulatsioon) uurimisega. Paradigmade muutus on viinud genoomika uuele tasandile: 1) struktuursetest uuringutest funktsionaalseteks; 2) geenikaardipõhistelt uuringutelt geenide järjestuspõhistele uuringutele; 3) haiguste etioloogia (põhjuslikkusest) uuringutest patogeneesi uuringutele (mehhanismini); 4) haiguste diagnoosist haigussoodumuse selgitamisele ja personaalmeditsiini (ingl. personal medicine) tekkeni astad Kromosomoloogia Somaatiliste rakkude geneetika Molekulaargeneetika ransgeenne tehnoloogia Miks? Joonis peamised arenguetapid. 1. Struktuurilt funktsioonile 2. eenidelt järjestustele 3. Etioloogialt patogeneesile 4. Haiguselt soodumusele ndmeanalüüs Kuidas? Epigeneetika 320

3 enoomide sekveneerimine genereerib meeletu hulga informatsiooni, mis tuleb töödelda. Sellest tekkis geneetika ja informaatika süntees, uurimisala, mida nimetatakse bioinformaatikaks (ingl. bioinformatics). omilise informatsiooni integratsioon põhjustas aga juba uuetasandilise lähenemisviisi bioloogiliste küsimuste lahendamisele, mida nimetatakse süsteemibioloogiaks (ingl. system biology) (jn. 11.2). 21. sajandi suur väljakutse loodusteadustes ongi funktsioneeriva raku matemaatilise mudeli väljatöötamine. ENMIK ranskriptoom Proteoom Interaktoom Fenoom Lokalisoom ( oomiks kaardistamise lähenemisviisid) Süsteemibioloogia ndmete integratsioon Sünteetiline bioloogia Modelleerimine Süstemaatiline bioloogia Joonis omiks -informatsiooni integratsioon süsteemibioloogiaks. Meeldejätmiseks on geneetika aladistsipliin, mis tegeleb genoomi kaardistamise, sekveneerimise ja võrdleva analüüsiga. eneetika ja informaatika kokkupuutepunktis on tekkinud bioinformaatika, mis võimaldab suuremahulist geneetiliste andmete analüüsi. Bioinformaatika võimaldab seostada kõiki oomikateaduseid bioloogia uueks distsipliiniks, süsteemibioloogiaks. 321

4 1. DN PEENSRUKUUR DN peenstruktuur geneetilise informatsiooni tähenduses on nukleiinhappe aluspaaride järjestus. Enne a. polnud veel teada ühegi kromosoomi ega genoomi DN primaarjärjestust a. lõpul avaldati esimene kromosoomijärjestus, milleks oli faagi ΦX174 kromosoom pikkusega 5386 nukleotiidi. Nüüd, ca 35 aastat hiljem (veebruar 2011), on teada juba 2585 viiruse ja viroidi, 735 plasmiidi, 201 kloroplasti ja 2362 mitokondri, 1318 bakteri ja 94 arhe (ingl. archaea) ning 41 eukarüoodi genoomne primaarjärjestus. Juba sekveneeritud genoomide õiget järjestamist ootab üle 370 ning 630 eukarüootse organismi genoomid on sekveneerimisel a. seisuga oli andmebaasides kättesaadav kahe inimese (raig Venter ja James Watson) genoomijärjestus. Samuti oli teada ja publitseeritud üle 60% neandertallase genoomist. Vastavad sekveneeritud genoomid on aga vaid nukleiinhapete primaarjärjestused, kus pole teada kaugeltki veel kõik geenid ja nende geenide poolt määratud tunnused. Käivitatud on inimese nn genoomi projekt, eesmärgiks sekveneerida üle maailma täielikult vähemat 2500 genoomi Sekveneerimine areng sõltub paljuski DN sünteesi, lagundamise ja paljundamise meetodite täiustumisest. jalooliselt olid DN sekveneerimise meetodid põhimõtteliselt kahte tüüpi: 1) nukleotiidispetsiifi liste katkete tekitamine DN-ahelas; 2) DN nukleotiiditäpsusega süntees. Mõlema metoodika puhul viiakse läbi neli erinevat biokeemilist reaktsiooni, kus reaktsiooni lõpetamisel osaleb üks neljast DN nukleotiidist (,, või ). Mõlemad meetodid põhinevad DN-fragmentide populatsiooni saamisel, kus fragmendi üks ots on ühine. DN sünteesil on ühiseks otsaks fragmendi -ots, lähtudes järjestatavast praimerist, ja muutuvaks 3 -ots, kus asub DN-polümeraasi poolt teostataval sünteesil vajalik vaba 3 -H. DN-fragmendid eraldatakse ahela pikkussõltuval polüakrüülamiidgeelelektroforeesil (P) (ingl. polyacrylamide gel electrophoresis) Maxami ja ilberti meetod Üheks esimeseks pöördeliseks momendiks DN primaarstruktuuri määramisel oli nukleiinhappe järjestusi äratundvate ja spetsiifi lisi katkeid põhjustavate DN-fragmentide saamine. Maxami ja ilberti meetodi nimetus tuleneb avastajate llan Maxami ja Walter ilberti nimest. See meetod publitseeriti a., s.t. kaks aastat pärast F. Sangeri ja. R. oulsoni teedrajava DN-ahela terminatsiooni meetodi avastamist. Maxami ja ilberti meetod seisneb kemikaalidega DN-ahela nukleotiidispetsiifi liste üksikkatkestamiste osalises läbiviimises kindlatüübiliste nukleotiidide juures, DN -otsa radioaktiivses märgistamises ning järgnevas 3 -otsaliselt eripikkuseliste DNsegmentide parve analüüsis P-geelelektroforeesil, pärast southern-ülekannet fragmentide visualiseerimises membraanfiltrite autoradiograafial. DN-ahel katkestatakse keemiliste ainetega neljas erisuguses reaktsioonisegus nukleotiidispetsiifi liselt, +,, + aluspaaride järel. DN lagundamisreaktsioonid viiakse läbi osaliselt, 322

5 nii et lagundamine ei toimu kõigis võimalikes punktides, vaid statistiliselt juhuslikult mingis üksikus lagundamispunktis. See võimaldab lõppkokkuvõttes saada parve DNfragmente, kus -otsa radioaktiivse märgistusega fragmendid erinevad pikkuse poolest üksteisest vaid ühe nukleotiidi võrra Sangeri meetod Sangeri meetodi töötasid välja Frederick Sanger ja lan R. oulson a. ning see põhineb in vitro DN-sünteesil radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide ja spetsiifi liste DN-ahela terminaatornukleotiidide juuresolekul. Ka siin on erinevaid reaktsioonisegusid 4, kus lisaks sünteesiks vajalikele trinukleotiididele (ka radioaktiivselt märgistatutele) on igas reaktsioonisegus madalas kontsentratsioonis ka üks terminaatornukleotiid, mis lõpetab DN-fragmendi sünteesi kas -, -, - või -terminaatoriga. hela terminaatoritena kasutatakse enamasti 2,3 -didesoksüribonuk leosiidtrifosfaate e. ddnp-sid (ingl. dideoxyribonucleoside triphosphates, ddnp) (jn. 11.3), kus puudub 3,-fosfodiestersideme moodustamiseks ja DN polümeraasi tööks hädavajalik nukleotiidi 3 -H-grupp (selle asemel on H-grupp). Neli reaktsioonisegu sisaldavad kas 2,3 -didesoksütümidiintrifosfaati (ddp), 2,3 -didesoksütsütidiintrifosfaati (ddp), 2,3 -didesoksüadenosiintrifosfaati (ddp) või 2,3 -didesoksüguanosiintrifosfaati (ddp) (jn. 11.3). DN-ahela süntees termineerub vaid juhul, kui sünteesitavasse ahelasse lülitatakse didesoksünukleotiid. N-alus N-alus P P P 5' H 2 4' H H 3' H 1' H 2' H P P P 5' H 2 4' H H 3' H 1' H 2' H 3 -H-rühm, mis on vajalik ahela pikenemiseks 3 -H puudumine termineerib ahela 2 -desoksüribonukleosiidtrifosfaat 2,3 -didesoksüribonukleosiidtrifosfaat Joonis Normaalse desoksüribonukleosiidtrifosfaadi (dnp) ja DN-ahela sünteesi termineeriva didesoksüribonukleosiidtrifosfaadi (ddnp) molekulide võrdlus. Kuivõrd reaktsioonisegudes on dxp : ddxp (kus X on üks neljast N-alusest) suhe 100 : 1, põhjustab see ahela terminatsiooni tõenäosuse kindlas DN punktis pärast vastavat nukleotiidi, suhtes 1/100. See fakt võimaldabki saada mõnesajanukleotiidilises DN-lõigus suure parve erineva pikkusega DN-fragmente, sest DN sünteesi terminatsioon võib toimuda võrdtõenäosuslikult igas võimalikus punktis. Järgnevalt eraldatakse uuestisünteesitud DN-ahel matriitsahelast denaturatsioonil ja 323

6 Reaktsioon 4 (-rajale) Produktid Reaktsioon 3 (-rajale) Produktid ddp 5` ~* dd 5` ~* dd ~* dd ~* dd ~* dd ~* dd Reaktsioon 2 (-rajale) Produktid ddp Reaktsioon 1 (-rajale) Produktid ddp ~* dd ~* dd ddp ~* dd ~* dd Denaturatsioon dd dd dd dd utoradiogramm sekveneerimisgeelist DN polümeraas + 32 P-dP + dp + dp + dp + dp Komplementaarse matriitsahela järjestus Matriitsahel Praimerahel 3 - ~H Sünteesitud ahela järjestus Joonis DN sekveneerimine Sangeri didesoksüribonukleotiidide ahela terminatsiooni meetodil. dd - didesoksüribonukleotiidid; * 32 P-dP. 324

7 üksikahelalised DN-fragmendid P-elektroforeesil. Fragmendi koht geelis detekteeritakse autoradiograafiameetodiga. Kui kasutada foreesil paralleelselt nelja rada, igaühel üks reaktsioonisegu neljast, siis saadakse DN-fragmentide jäljendid foreesigeelil redelina (jn. 11.4). Uuemal ajal kasutatakse spetsiifi list aparatuuri, mis detekteerib radioaktiivset fosforit fosfokuvaja (ingl. phosphoimager) või fl uorestseeruvat värvainet fluorokuvaja (ingl. fl uoroimager). Redeli astmeid (nukleotiidifragmente) alt ülespoole lugedes saame, lähtudes sünteesil kasutatud praimerist, reaalse DN nukleotiidse järjestuse konkreetses DN-ahela lõigus. änapäeval kasutatakse DN sekveneerimiseks juba automaatseid sekvenaatoreid, mis kasutavad veidi modifi tseeritult Sangeri sekveneerimismeetodit. Põhilised automatiseeritud sekveneerimise eripärad on järgmised. 1. DN-fragmendi märgistamiseks kasutatakse radioaktiivse märgistuse asemel fl uorestsentsmärgist. 2. Eri reaktsioonidest saadavad fragmendid jaotatakse P-elektroforeesil erinevates geelides või kapillaartorudes. 3. Fragmentide avastamiseks kasutatakse fototundlikke elemente. ndmed edastatakse otse arvutisse. Fluorestseeruva märgisena kasutatakse iga didesoksünukleotiidi puhul erinevat fl uorestsentsmärgist, mis võimaldab arvutis eristada igat üksikut nukleotiidi neljast (jn. 11.5). inuüksi ühe 96 kapillaariga sekvenaatoriga (paralleelselt toimuvad proovid), saab päevaga määrata üle nukleotiidi pikkuselise järjestuse. Kuid kõik see on juba ajalugu. Viimase viie aasta jooksul on leiutatud mitmeid täiesti uusi sekveneerimismeetodeid/ -tehnoloogiaid. BI Solid (ingl. sequencing by oligonucleotide ligation and detection) on uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogia, mis põhineb järjestusespetsiifi lisel oligonukleotiidide ligeerimisel ligaasiga. ehnoloogiad arenevad lühemate järjestuste massmääramise suunas. astal 2005 tuli kasutusele 454 pürosekveneerimise (ingl. pyrosequencing) meetod, millega juba a. sai lugeda mitu miljonit bp pikkust DN-fragmenti. Solexa-süsteem võeti kasutusele a. ning a. sai sel meetodil määrata juba sadu miljoneid bp pikkuseid fragmente a. toodi turule SLiD-süsteem a. sai selle meetodiga määrata ühe masinaga päevas juba miljardeid 50 bp pikkusi DNfragmente. Sekveneerimisjõudlus on tõusnud aluseni ühe masina kohta päevas. Firma Life echnologies poolt väljatöötatud SLiD-süsteem on kommertsiaalselt saadav alates a. See meetod on sarnane teiste uue põlvkonna tehnoloogiatega ja kasutatav koos mikrokiipide (ingl. microchips) tehnoloogiaga nii transkriptoomikas kui ka epigenoomikas (ingl. epigenomics). Meeldejätmiseks DN-molekuli nukleotiidse järjestuse määramisega e. sekveneerimisega sedastatakse geenide ja kromosoomide peenstruktuuri füüsiline kaart. DN sekveneerimine toimub automatiseeritult. Sekveneerimisel kasutatakse valdavalt Sangeri didesoksünukleotiidide kui terminaatornukleotiidide meetodit. 325

8 B 3 utoradiograafia Fluorestsents Praimer ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Kapillaartoru Märgistatud praimer Praimer Matriits Märgistatud dnp Praimer Matriits Märgistatud ddnp Praimer Matriits Järjestatud DN võrdlus radioaktiivsel ja fluorestsentsmärgistuse meetodil Laser Fluorestsentsdetektor 3 rvuti DN fluorestsents- ja radioaktiivse märgistuse meetodid Fluorestseeruvad DN-fragmendid utomaatsekveneerimine Joonis Standardse plaatgeeli autoradiograafi a ja DN automaatsekveneerimiste võrdlus.. Sama DN-järjestuse saamine plaatgeeli autoradiograafi al ja fl uorestsentsmärkega automaatsekveneerimisel. B. DN fl uorestsents- või radioaktiivse märgistuse viisid: 1) märgistatud praimer; 2) märgistatud dnp; 3) märgistatud ddnp.. utomaatsekveneerimine. ndmete automaatsalvestus toimub skaneeriva laseri, fl uorestsentsdetektori ja arvuti abil. 326

9 1.2. DN amplifi katsioon DN peenstruktuuri määramisel on metoodiliselt vajalik üliväikeste DN koguste paljundamine. In vivo (rakus) on mehhanism, millega DN koopiaarv (ingl. DN copy number) tõuseb e. toimub DN amplifi katsioon (ingl. DN amplifi cation). See on tuntud nähtus plasmiidide ja viiruste replikatsioonil. In vitro (katseklaasis) saab DN-d paljundada polümeraasi ahelreaktsiooni e. PR- (ingl. polymerase chain reaction, PR) meetodil. Meetodi avastasid Kjell Kleppe ( ) ja H.. Khorana juba a. ja selle arendas laialt rakendatavaks meetodiks Kary Mullis (snd. 1944), kellele anti a. Nobeli preemia PR Polümeraas-ahelreaktsioonil e. PR-reaktsioonil kasutatakse praimeritena tuntud järjestuste alusel sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DN erinevatele piirkondadele ning millede vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DN-lõike (jn. 11.6). Praimerid on alati paarikaupa, s.t. seonduvad erinevate DN-ahelatega. Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn. pikad DN-lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite. eises tsüklis (ja edasistes tsüklites) seondub teine vastaspraimer juba sünteesitud DN-ahelale ning selle ahela teine ots on esimese praimeri seondumissait. Järelikult toimub edasine DN-fragmentide süntees praimerite seondumissaitide vahel ning selle tulemusel moodustuvadki sama pikkusega DN-fragmendid. PR koosneb kolmest etapist, mida kõiki korratakse tsükliliselt palju kordi. 1. Sekveneeritav DN denatureeritakse kuumutamisel o 30 sekundit. 2. Denatureeritud DN hübridiseeritakse praimeri üleküllusel, o 30 sekundit, sõltuvalt praimeri nukleotiidsest järjestusest. 3. DN polümeraas muudab praimeritevahelised üksikahelalised lõigud kaksikahelalisteks, tavaliselt o juures 90 sekundit. Praimeri 3 -H-ots on sünteesi algussaidiks ja matriitsina kasutatakse vanem-dnahelat. Esimese tsükli järel korratakse protseduuri, tavaliselt vähemalt 20 korda. Selliselt kasvab DN-fragmentide arv eksponentsiaalselt: ühes replikatsioonitsüklis tekib 2 kaksikheeliksit, kahes tsüklis 4, kolmes 8, neljas 16, kümnes tsüklis 1024 jne. PR-meetod võimaldab oluliselt lihtsustada DN- järjestuste analüüsi, sest uuritava algmaterjalina on võimalik kasutada üliväikest DN hulka. lgul kasutati PR-reaktsioonil E. coli DN polümeraas I-te. Kuid see polümeraas on temperatuuritundlik ja seepärast on vaja igas replikatsioonitsüklis lisada uus kogus polümeraasi. änapäeval kasutatakse termofi ilist hermus aquaticus isoleeritud temperatuuriresistentset aq-polümeraasi (ingl.. aquaticus polymerase). Selle polümeraasiga viiakse läbi korduvad PR-tsüklid. Kahjuks, erinevalt enamusest DN polümeraasidest, pole aq-polümeraasil 3 -korrektsioonilist aktiivsust (ingl. 3 proofreading activity), mistõttu tema töötamisel tekib tavalisest palju rohkem vigu. Edasi amplifi tseeritakse ka järgnevates replikatsioonitsüklites neid vigu. Nimetatud 3 --korrektsioonivõime on olemas aga teistel tänapäeval kasutusse võetud temperatuuriresistentsetel polümeraasidel. Nendeks on polümeraasid Pfu (Pyrococcus furiosus) ja li (hermococcus litoralis). aq-polümeraasi teiseks puuduseks on see, et üle mõne tuhande nukleotiidiliste DNlõikude sünteesil tõuseb märgatavalt tehtavate vigade arv ja langeb sünteesi efektiivsus. 327

10 sükkel Denaturatsioon sekundit 3 1 molekul 3 Praimerid sekundit 3 3 H Praimerid 3 H 3 DN süntees aq-polümeraas + NP-d sekundit molekuli 3 3 sükkel 2 Denaturatsioon sekundit + praimerid sekundit DN süntees aq-polümeraas + NP-d sekundit PRfragmendid molekuli Joonis PR-meetod DN paljundamiseks (amplifi katsiooniks). sükkel 1: mõlema ahela oligonukleotiidsed praimerid sünteesitakse in vitro eelnevalt teadaolevate nukleotiidsete järjestuste alusel. sükkel 2: PR DN-fragmendid sünteesitakse praimerite vahele jääva DN ulatuses. 328

11 Väga pikkade DN-lõikude (kuni 35 kb) amplifi katsiooniks kasutatakse temperatuuriresistentset fl-polümeraasi (isoleeritud hermus fl avus e tüvest). Üle 35 kb pikkuseid DN-lõike ei saa PR-meetodil amplifi tseerida. PR-meetodi rakendusi käsitletakse lähemalt rakendusgeneetika osas Kvantitatiivne PR Kvantitatiivset reaalaja PR-i e. qpr-i (ingl. quantitative real time polymerase chain reaction or qpr) e. kineetilist PR-i viiakse läbi analoogselt tavalise PR-ga. Erinevus seisneb selles, et sünteesitud DN hulk kvantiteeritakse, suhestades seda kontrollgeenidelt sünteesitud DN koopiate või geeni transkriptide (kui cdn) hulgale. Kvantiteerimiseks kasutatakse kahte meetodit (jn. 11.7), kus: 1) kasutatakse f luorestseeruvaid värvaineid e. fluorofoore, mis interkaleeruvad kaksikahelalise dsdn-ga (SYBR-reen-proovid), emiteerides DN-st vabanemisel valgust; 2) täpsemate tulemuste saamiseks kasutatakse DN-proovide modifitseerimist kahe fl uorofooriga (värviga), kus: a. DN-proovis (aqman i proovid) ja hübridiseerunud proovis ei esine fl uorestseerumist, sest kustutav fluorofoor (ingl. quencher fluorofore) surub koostoimes reporter-fl uorofoori avaldumise maha. PR-i käigus polümeraasi - 3 aktiivsus degradeerib proovi ja tulemusel vabaneb mõõdetav fl uorestsents; b. molekulaarse majaka (ingl. molecular beacon) proovid hakkavad helenduma vaid siis, kui proov hübriidub (vaba, hübriidumata proov ei helendu). Praimerite seondumine Praimerid aq-polümeraas cdn + Praimeri mõlemas otsas erinevad fluorofoorid, millede fluorestsents aga ei avaldu Mitteavalduvad fluorofoorid Seondunud praimerite fluorestsents ei avaldu PR-produkt + Praimeri lagunemine valduvad fluorofoorid aq-polümeraas lõhub praimerid ja mõlemat tüüpi fluorestsents avaldub Joonis Kvantitatiivne reaalajas toimuv PR e. qpr. Fluorofoorid on seondunud praimeriga ning nende fl uorestsents ei avaldu. Praimeri DN-ga seondumine ei vabasta fl uorestsentsi. aq-polümeraas lagundab praimerid ja vabanevad fl uorestseeeruvad molekulid, mille taset (fl uorestsentsi) mõõdetakse. Fluorestsentsi eraldumine on proportsionaalne (kvantitatiivne) uuesti initsieeritud PR-reaktsioonide arvuga. eeni avaldumisel eraldatakse tema mrn, sellelt sünteesitakse cdn ning kvantitatiivsel PR-l määratakse PR- reaktsioonide initsiatsiooniga cdn hulk (geeni ekspressiivsuse tase). 329

12 Sageli kombineeritakse qpr-i pöördtranskriptsiooniga, mis võimaldab uuritavas rakus või koes kvantiteerida mrn hulka. Kvantitatiivset pöördtranskriptsioonilist PR-i (ingl. quantitative real-time reverse-transcription PR or R-PR) tähistatakse R-PR. õsi, sama lühend on praktikas kasutusel ka reaalaja PR-i tähisena. Meeldejätmiseks Polümeraasi ahelreaktsiooni e. PR-i kasutatakse DN amplifi tseerimiseks in vitro tingimustes. Kvantitatiivse PR-meetodiga saab proovis reaalajas fl uorofooridega kvantiteerida geenide, geeni transkriptide ning sünteesitud DN-fragmentide arvu. 2. KRMSMIDE PEENSRUKUUR 2.1. Kromosoomide geneetiliste, tsütoloogiliste ja füüsiliste kaartide võrdlus eneetilised kaardid (ingl. genetic maps) koostatakse lähtuvalt rekombinatsioonisagedustest (krossingoveri e. ristsiirde sagedus). Kokkuleppeliselt võetakse ühikuks 1 sentimorgan e. 1 cm (ingl. centimorgan), mis vastab geenidevahelisele kaugusele ühes põlvkonnas, mille piires on rekombinatsiooni sagedus 0,01 e. 1%. eenide molekulaarne kaugus üksteisest ei pruugi kaugeltki kokku langeda nende geneetilise kaugusega, kuna mitte kõik genoomi DN piirkonnad pole rekombinatsiooniliselt võrdväärsed. Võrreldes geneetilisi kaarte tsütogeneetiliste kaartidega (ingl. cytogenetic maps), on näha, et geenide järjestus on sama, kuid geenidevahelised suhtelised kaugused mõneti erinevad (jn. 11.8). Inimese genoomi eukromatiinses alas vastab 1 cm-le ligikaudu 1 miljon aluspaari. Füüsilisel kaardil (ingl. physical maps), milleks on tavaliselt restriktsioonikaardid (ingl. restriction maps), on kauguste mõõtmise mõõdupuuks aluspaarid (ap e. bp) (ingl. base pairs, bp), kilobaasid (kb) (ingl. kilobases, kb), megabaasid (Mb) (ingl. megabases, Mb) või gigabaasid (b) (ingl. gigabases, b). Füüsilisel kaardil eristuvad iseloomulikud unikaalsed nukleotiidijärjestused, mida nimetatakse järjestusspetsiifilisteks saitideks e. SS-deks (ingl. sequence-tagged sites, SSs). Neid lühikesi unikaalseid järjestusi nimetatakse ankurjärjestusteks (ingl. anchor markers), sest nende kaudu ankurdatakse füüsilised kaardid geneetiliste kaartidega ja vice versa. Seega on ankurmarkerid kaardistatud nii geneetilistel kui ka füüsilistel kaartidel (jn. 11.8). eiseks ankurmarkerite tüübiks on avaldunud järjestuste märgised e. ES-id (ingl. expressedsequence tags, ESs). Need on mrn-st pärinevad lühikesed cdn koopiad, mida saab kasutada avalduvate geenide lokalisatsiooni määramiseks. Kromosoomide füüsilisi kaarte saab korreleerida geneetiliste ja tsütoloogiliste kaartidega, kasutades järgmisi meetodeid: 1. PR, et amplifi tseerida lühikesi, tavaliselt bp pikkuseid, unikaalseid DN järjestusi. 2. Southern-ülekandega hübriidimine (ingl. southern blot hybridization), et suhestada uuritavat DN-järjestust kattuvates kloonides füüsilistel kaartidel. 330

13 3. In situ hübriidimine, näiteks in situ fluorestsentshübriidimine e. FISH (ingl. fluorescent in situ hybridization) geeni positsioneerimiseks tsütoloogilistel kaartidel. cm mb 0 kb EcoRI 0 een X SstI HindIII Restriktsiooni kaart RFLP 1 RFLP 2 een Y kb Y kloon 1 2 EcoRI Kontiigi kaart een Z kb 0 SS 1 RFLP SS 2 SS-i kaart SS 3 eneetiline kaart sütoloogiline kaart Füüsiline kaart 1000 Joonis Vastavus kromosoomi geneetiliste, tsütoloogiliste ja füüsiliste kaartide vahel ning restriktsiooni-, kontiigi- ja SS-kaardid. cm krossingoveri sagedus sentimorganites; mb miljon aluspaari; kb tuhat aluspaari; SS järjestusespetsiifi line sait; kontiigid katt uvate DN-lõikudega kloonid. Meeldejätmiseks eenide ja muude molekulaarsete markerite kromosoomset lokalisatsiooni saab kaardistada, lähtudes geneetilise rekombinatsiooni sagedustest, ning saadud tulemusi positsioneerida ja korreleerida tsütoloogiliste tunnuste ning geenide füüsiliste kauguste alusel. Kromosoomide geneetilised kaardid põhinevad geenidevahelistel ristsiirde sagedustel. sütogeneetilised kaardid põhinevad kromosoomides mikroskoopiliselt eristuvate tunnuste (vöötide) lokalisatsiooni määramisel. Kromosoomide füüsilised kaardid põhinevad tunnustevahelise kauguse määramisel aluspaaride, kilobaaside või megabaaside arvu alusel. Kromosoomide peenstruktuuri geneetilistel kaartidel on integreeritud geneetiliste, tsütoloogiliste ja füüsiliste kaartide andmed. 331

14 2.2. Positsiooniline kloonimine eenide identifi tseerimiseks ja isoleerimiseks tuleb määrata nende asukoht genoomis, täpsemalt kromosoomides. eeni asukoha kindlaksmääramisel kromosoomis lähtutakse tänapäeval molekulaarsetest markeritest (ingl. molecular markers), milleks on tavaliselt spetsiifi line DN- järjestus. Molekulaarse markeri ülesleidmisele eelneb aga rida katsed. avaliselt kaardistatakse geen teatud kromosoomi piirkonda ristamiskatsete ja geneetilise analüüsi alusel või lähtuvalt inimese sugupuu analüüsist (jn.11.9). Seejärel seostatakse uuritava geeni asukoht kindla molekulaarse markeriga füüsilisel kaardil. Selle leidmiseks on vaja üldjuhul isoleerida mutant, sest just muutust saab seostada huvipakkuva geeniga (geeni poolt määratava tunnuse muutusega). Edasi on vaja nii metsiktüüpi isendist kui ka mutandist isoleerida DN-segment, mis sisaldab huvipakkuva geeniga seostuvat molekulaarset markerit, ning need sekveneerida. Vastavat meetodit geenide asukoha määramiseks nimetatakse positsiooniliseks kloonimiseks (ingl. positional cloning). Positsioonilisel kloonimisel saab isoleerida geeni, mille asukoht on teada, kuid mille funktsioon vajab selgitamist Restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfi sm (RFLP) Mutatsiooni tulemusel võib restriktsioonisait muutuda restriktaasile mitteäratuntavaks või, vastupidi, mutatsiooniliselt võivad tekkida ka uued restriktsioonisaidid (jn ). Seetõttu annab DN täielik restriktsioon spetsiifi lise pikkusega DN-fragmendid, mis on iseloomulikud konkreetsele isendile. Populatsioonides nimetatakse vastavat polümorfi smi restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfismiks e. RFLP-iks (ingl. restriction fragment-lenght polymorphisms e. RFLPs). RLFP-sid saab kaardistada nagu iga teist geneetilist markerit ja nad segregeeruvad ristamiste tulemusel. Seepärast on RFLP-d ülimalt kasulikud markerid geenide peenstruktuursete kaartide koostamisel, kasutades selleks positsioonilist kloonimist. Erinevate geograafi liste isolaatide ja inbriidsete liinide uurimisel saadakse eripärased RFLP- mustrid, mida nimetatakse vastavaks DN-ökotüübiks (ingl. DN ecotypes). avaliselt saab RFLP-sid agaroosgeelelektroforeesil otseselt eristada. sa RFLP tüüpe on visualiseeritavad aga vaid spetsiifi liste cdn või genoomsete kloonide abil, töödeldes DN fragmente geelides radioaktiivsete proovidega southern-ülekande hübriidimisel (jn ). Selline olukord on juhtudel, kus mutatsioonide tulemusel on mõningad restriktsioonisaidid DN-st kadunud. R FLP-meetod osutus väga viljakaks inimese kromosoomikaardistamisel. Juba a. koostati 2000 RFLP põhjal inimese 24. kromosoomi (22 + X- ja Y-kromosoom) kaardid. Veelgi produktiivsemaks osutus aga inimese geenide kaardistamisel RFLPde kasutamine, kus uuriti tandeemsete kordusjärjestuste lühikesi järjestusmarkereid. andemkoopiate arv on igal üksikjuhul äärmiselt varieeruv ja seega on populatsioon väga polümorfne. Vastavaid saite nimetatakse varieeruva arvuga tandemkordusteks, e. VNR-ideks (ingl. variable number tandem repeats or VNRs). VNR-polümorfi sm pole seotud restriktsioonisaitide arvuga, vaid restriktsioonisaite sisaldavate tandeemsete kordusjärjestuste arvuga. Inimese polümorfsete tandemkorduste üheks tähtsaks klassiks on mikrosatelliidid (ingl. microsatellites). Vastavad kordusjärjestused on vaid 2 5 bp pikkused. Üheks selliseks mikrosatelliidi tandeemseks kordusjärjestuseks on dinukleotiid 332

15 2 Ristamine Kromosoomi vöödid Suurte insertidega Y- ja Bvektorite kloonid Kandidaatgeenid Metsiktüüpi alleel Mutantne alleel Mutantse fenotüübiga organism 1 I x Rekombinantse fenotüübiga järglane Sugupuu analüüs 1 2 eadaoleva RFLP-ga organism Uuritav geen Met Val Leu Ser ln ys Pro Met Val Leu Ser chre erminaator II 3 eneetiline kaardistamine Füüsiline kaardistamine ranskripti kaardistamine eeni sekveneerimine III IV ransforrmant Metsiktüüpi fenotüübiga organism Retsipient Mutantse fenotüübiga organism Uuritav metsiktüüpi geen Vektor Metsiktüüpi fenotüübi taastumine ransformatsioon eeni kloonimine Joonis eeni positsioonilise kloonimise etapid. Inimesel toimub geeni väljaselgitamine perekonna sugupuu analüüsil (1) ning metsiktüüpi ja mutantse geeni järgneval sekveneerimisel (3). eistel organismidel kaardistatakse geenid eksperimentaalsetes ristamistes (2), kusjuures kandidaatgeenid selgitatakse välja kloonitud metsiktüüpi alleeli võimega taastada mutantse organismi metsiktüüpi (4)

16 een eelelektroforees Fragmendid DN een ökotüüp I EcoRI EcoRI EcoRI DN een a ökotüüp II EcoRI restriktsioonifragmendid EcoRI-saidi kaotamine EcoRI /-paari muutumine /-paariks EcoRI Fragment RFLP-test een a Joonis Erinevate liikide DN ökotüüpide sedastamine ja RFLP polümorfismi mutatsiooniline päritolu. Restriktaas EcoRI saidis toimunud mutatsiooni (/ asendumine /-ga) tulemusel on geen a ökotüüp II RFLP-testil kaetud ühe DN-fragmendiga. een ökotüüp I DN annab sama geeni osas aga kaks EcoRI restriktsioonifragmenti. Mutatsioon võis tekkida ökotüüp II eellase divergentsil ökotüübist I. RFLP polümorfism on sedastatav autoradiograafiliselt (DN isoleeritakse, restrikteeritakse, fragmendid eraldatakse agaroosgeelelektroforeesil, kantakse üle nailonfi ltrile, hübriiditakse southern-ülekandel geen radioaktiivse prooviga ja eksponeeritakse X-kiirgusetundlikule fi lmile). RFLP restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfi sm. 334

17 /, kus ühes ahelas on ja teises, komplementaarses ahelas. Kanada uurijad kaardistasid a. inimese genoomi 1335 punktis (saidis) 5264 / mikrosatelliiti, mis teeb kõrvutiolevate markerite vaheliseks keskmiseks kauguseks 1,6 cm e. 1,6 Mb. RFLP-d kasutati rohkem kui 1600 inimese geeni (ES-id ja kloonitud geenid) lokaliseerimisel inimese genoomi füüsilisel kaardil. Lisaks kaardistati rohkem kui SS-i s üksiklookuses. Inimese DN kordusjärjestusi käsitleme põhjalikumalt eraldi osas (ptk. XXII) Kontiigid lles RFLP-kaartide koostamine tegi võimalikuks kromosoomide detailsete geneetiliste kaartide koostamise. See meetod võimaldab geenide positsioonilist kloonimist. Üleminekul geneetiliselt kaardilt (geenide ja tunnuste järjestus) füüsilisele kaardile (DN nukleotiidne järjestus) tuleb saada piisava suurusega kloonitud DN genoomne DN-raamatukogu e. genoteek, kus kloonitud DN-lõigud mitte ainult ei kataks teineteist, vaid ka kattuks üksteisega. eoreetiliselt on see lihtne, praktikas aga sageli küllalt komplitseeritud ülesanne. Vastavaid osaliselt kattuvate DN-lõikudega kloone nimetatakse kontiigideks (ingl. contigs). Pikemaid kontiige on eriti vaja juhul, kui vastav DN sisaldab kordusjärjestusi. DN-järjestuste määramisel on tulemuste usaldatavuse saavutamiseks oluline omada piisavas hulgas ja korduses kontiige. Kontiige analüüsitakse arvutiprogram mide abil. Kokku pandud kontiigikaardi DN-järjestuste tõesuse kinnitamiseks võrreldakse neid restriktsioonisaitide analüüsil saadud fragmentidega (jn ). Kontiig Kloon 1 Kloon 2 Kloon 3 Kloon 4 Kloon 5 Kloon 6 Kloon 7 Kloon 8 Kloon 9 Restriktsioonisaidid Kloon 10 Kloon 11 Kloon 12 Joonis Kattuvate genoomsete kloonide põhjal koostatud kontiigikaart. Suured DN-fragmendid ( kb) on kloonitud vektoritesse Y, B või P. Koostatakse iga klooni inserdi restriktsioonikaart. rvutiga ühendatakse katt uvad fragmendid. Kui kogu genoomi füüsiline kaart on koos, siis on iga kromosoom vastavaks kontiigiks. 335

18 Kromosoomil jalutamine undmatu lokalisatsiooniga huvipakkuva geeni kaardistamiseks on vaja leida eelnevate geneetiliste uurimistulemuste põhjal genoomne marker, mis võiks asuda uuritava tundmatu geeni lähedal. avaliselt identifi tseeritakse uuritava geeni lähedal RFLP-marker. Sellest RFLP-markerist liigutakse edasi huvipakkuva geenini. Seda protsessi nimetatakse kromosoomil jalutamiseks (ingl. chromosome walking). Kromosoomil jalutamise põhimõte seisneb selles, et RFLP-markerist määratakse uuritava geeni suunas edasi DN nukleotiidne järjestus ja uuestimääratud järjestuste restriktsioonifragmendi alusel liigutakse omakorda edasi uuritava geeni poole. Selleks tehakse RFLP-markeriga klooni baasil radioaktiivne hübridatsiooniproov, millega hübriiditakse DN-raamatukogu kloone, et saada kätte kõikvõimalikke RFLP-järjestusega DN-fragmente. Hübriiditavatele kloonidele koostatakse restriktsioonikaart ning valmistatakse järgmine radioaktiivne hübridatsiooniproov restriktsioonifragmendist, mille järjestus asub algsest proovi järjestusest kõige kaugemal. Protseduuri korratakse seni, kuni jõutakse välja huvipakkuva geenini (jn ). Seda, kas huvipakkuva geeni järjestus on lõpuks kätte saadud, on võimalik kontrollida. Näiteks metsiktüüpi alleeli sisseviimisel mutanti taastub metsiktüüpi fenotüüp. Samuti saab näidata mutantsete ja metsiktüüpi alleelide nukleotiidsete järjestuste sarnasust ning mutandi võimetust kodeerida funktsioneerivat geeniprodukti. RFLP-kloon lgne kloon Uuritav geen E H B B H Restriktsioonikaart 32 P Subkloon Jalutamine B H H E Hübriidimine (genoteek) Klooni restriktsioonikaart 32 P Subkloon Jalutamine H E B B H Hübriidimine (genoteek) Klooni restriktsioonikaart 32 P Subkloon Jalutamine Hübriidimine (genoteek) B E H H Klooni restriktsioonikaart Uuritava geeni kloonimine E H Subkloon Joonis Uuritava geeni positsiooniline kloonimine kromosoomil jalutamise meetodil. Kromosoomil jalutamist alustatakse molekulaarsest markerist (nt. RFLP-fragment), mis on uuritavale geenile lähim. Uuritavale geenile lähenetakse geeniraamatukogust (genoteegist) hübriiditavate kloonide uuritavale geenile lähimate restriktsioonifragmentidega. 336

19 Kromosoomil jalutamise meetod on aga liiga vaevaline, kui restriktsioonifragmendi ja uuritava geeni vahel on liiga pikk vahemaa. Samuti raskendavad edu saavutamist disperssed kordusjärjestused, mis on kromosoomil jalutamisel suurteks teetakistusteks Kromosoomil hüppamine Kui huvipakkuva geeni ja molekulaarse markeri vahel olev ala on liiga pikk, siis kasutatakse kromosoomil hüppamise (ingl. chromosome jumping) meetodit. Iga hüppega liigutakse edasi ca 100 kb võrra. Stardipositsioon on siin sama kui kromosoomil jalutamise metoodika puhul: DN, milles asub RFLP-marker ning mis on saadud hübridatsiooni tulemusel. Uuritava organismi DN-le tehakse aga siin osaline restriktsioon, mille tulemusel saadakse suured DN-fragmendid, kus fragmendi ühes otsas on algse prooviga hübriiduv DN (suur fragment peab seda järjestust hübridatsiooni tulemusel sisaldama) ning teises otsas unikaalne DN-järjestus (jn ). Fragmendi otste ligeerimisel moodustub rõngasjas liitjärjestus. Järgmise hübridatsiooniproovi valmistamisel lähtutakse liitjärjestusest, märgistades radioaktiivselt fragmendi unikaalsed otsmised järjestused. Edasiliikumise ulatust saab sisuliselt võrrelda restriktsioonifragmendi pikkusega. Protsessi korratakse, kuni jõutakse huvipakkuva geenini. EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI enoomne DN tste ühendamine rõngasjaks DN-ks lgse proovi äratundmissait saline restriktsioon restriktaasiga EcoRI enoomse DN EcoRI-fragment DN unikaaljärjestus Esimese hüppe DN proov Katke Ühendamine Katke Katke Katke Vajalik arv korduseid eise hüppe DN proov B Esimene hüpe eine hüpe Joonis Kromosoomil hüppamise meetod.. salise restriktsiooniga saadakse suured fragmendid, mille otste ühendamisel moodustatakse rõngasjad DN-molekulid. lgse proovi äratundmissaidi kõrvalt leitakse unikaalne DN-järjestus, mis lõigatakse teiste spetsiifi liste restriktaasidega välja ja kasutatakse proovina teisel hüppel. B. Igal hüppel kaotatakse saitide vahel olev DN ja liigutakse hüpetega mööda DN-d edasi. 337

20 Meeldejätmiseks Restriktsioonifragmentide alusel koostatakse restriktsioonikaardid. Restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfi smi (RFLP) alusel iseloomustatakse erinevaid populatsioone ja populatsioonide isendeid DN-ökotüüpidena. DN tandemkordustest tekkiv polümorfi sm (VNR) tuleneb eri isenditel tandeemsete kordusjärjestuste pikkusest, mitte restriktsioonisaitide erinevusest. Mikrosatelliidid on tandeemsed 2 5 nukleotiidipaari pikkused kordusjärjestused, mis paiknevad kõrgkorduvas satelliit-dn-s. Kattuvate DN-fragmentide e. kontiigide genoomsete kloonide alusel saab koostada kontiigikaardi. Kui molekulaarse markerina kasutatav RFLP-fragment asub uuritava geeni läheduses, on kromosoomil jalutamise ja kromosoomil hüppamise meetoditega võimalik uuritav geen kaardistada. 3. ENMIDE NUKLEIIDIJÄRJESUSE MÄÄRMINE enoomi järjestuse määramine on DN nukleotiidijärjestuse määramine e. sekveneerimine (ingl. sequencing). Kui Mendel uuris üldse seitset geeni, siis tänapäeva teadlane saab uurida organismi kõiki geene (ehkki sageli enamike funktsioone veel ei teata). Meenutame, et DN (õigemini nukleiinhapped tuumas) avastas Šveitsi arst Johannes Friedrich Miesher a.. very näitas a., et DN on geneetilise info kandja pneumokokis ning J. D. Watson ja F. rick avastasid a. DN kaksikhelikaalse struktuuri. RN sekveneerimine sai alguse a., kui US biokeemik Robert W. Holley ( ) sekveneeris pärmi tr N la. Juba F. rick oletas trn-taolise adaptormolekuli olemasolu, sest muul moel ei osatud seletada RN-poolset info ülekannet valgu struktuuri moodustamiseks. DN sekveneerimise ajastu algas aga hiljem, nimelt a. faag λ kleepuvate otste sekveneerimisega Ray Wu poolt a. töötas F. Sanger välja didesoksünukleotiidide sünteesi terminatsioonimeetodi ja W. ilbert DN järjestamise keemilise lagundamise meetodi. Esimeseks täielikult sekveneeritud genoomiks oli F. Sangeri grupi koostatud faagi ΦX174 genoom (5386 nukleotiidi üksikahelalises DN-s; 10 geeni, milledest osa kattuvad). Bakteriofaagide genoomis on aga tavaliselt kaheahelaline DN (vahel ka üheahelaline DN või RN), genoomi suurus on piirides 1,6 150 kb, see sisaldab ca 200 geeni, kusjuures lugemisraamid geenidel sageli kattuvad. Juba a. koostas Walter oad Los lamoses esimese geenipanga (ingl. enbank) prototüübi ning a. võttis Jo Messing kasutusele M13 kloonimisvektorid (ingl. cloning vectors). Kõik järgnev toimus väga kiiresti a. arendas Leroy Hood välja poolautomaatse sekvenaatori, mis võimaldas sekveneerida aastas juba bp ning a. sai Perkin Elmer, Inc. valmis 96-kapillaarilise sekvenaatori, mis võimaldas aastas sekveneerida juba bp. Seetõtt u sekveneeriti kiiresti enamik geneetilistes uuringutes kasutatavate organismide genoome: John raig Venter (snd. 1946) 1995 esimene bakteri genoom, 1996 pärmi genoom, 1998 varbussi genoom, 2000 äädikakärbse ja müürlooga genoomid, 2001 inimese genoom, 2002 riisi ja hiire genoomid, 2003 roti genoom jne. 338

21 2009. a. lõpetati lehma ja hobuse genoomi kaardistamine, samuti selliste eksootiliste ja ohustatud loomade nagu jääkaru, kuningpingviini ja iibeti antiiloobi genoomide järjestuse kindlakstegemine. Nüüdseks on täisgenoomid avaldatud üle 100 eukarüoodi ja 1000 prokarüoodi kohta Inimese genoom Nukleiinhapete sekveneerimise, geenide kloonimise meetodite ning rekombinantse DN tehnoloogia areng tõstatas ndatel aastatel ambitsiooni määrata pisut enama kui 3 x 10 9 nukleotiidipaari suurune inimese täielik haploidne genoom a. jõutigi inimgenoomiprojektini (ingl. Human enome Project). Projekt seadis ülesandeks saavutada a. järgmised tulemused: 1) kaardistada kõik inimese geenid; 2) konstrueerida inimese genoomi füüsikaline kaart; 3) sekveneerida inimese kõik 24 kromosoomi. Kohe sai ka selgeks, et selline projekt peab olema ülemaailmne, milleks loodi Inimgenoomi rganisatsioon e. HU (ingl. Human enome rganisation, HU). Selle ambitsioonika projekti esimeseks direktoriks sai James Watson enoomi kaardistamine Inimese genoomi geneetilise kaardistamise lahutusvõime on tavameetodeid kasutades küllalt väike, piirides 1 10 mb. Ka in situ fl uorestsentshübridatsiooni (FISH) lahutusvõime on alates 80 kb-st. Palju suurem lahutusvõime (kuni 50 kb) saavutati kiirguslikul hübriidsel kaardistamisel e. RH-l (ingl. radiation hybrid mapping, RH). Standardne somaatiliste rakkude hübridatsioon põhineb koekultuuris inimese somaatiliste rakkude ühinemisel (ingl. somatic cell fusion) näriliste rakkudega ning järgneval hübriidrakkude analüüsil. Selleks korreleeritakse hübriidrakkudes avalduvaid tunnuseid hübriidis säilinud inimese kromosoomide fragmentide või kromosoomidega. Kiirguslikul hübriidsel kaardistamisel kiiritatakse näiteks inimese rakke enne ühinemist suurte X-kiirguse doosidega, mille tulemusena kromosoomid fragmenteeruvad. Pärast kiiritatud inimeserakkude ühinemist in vitro Hiina hamstri rakkudega polüetüleenglükooli e. PE (ingl. polyethylene glycol, PE) kui ühinemise soodustaja juuresolekul, saadakse hübriidrakud (ingl. hybrid cells), kelle omadusi testitakse selektiivsöötmetel (jn ). Paljud inimese kromosoomide fragmendid integreeruvad hamstri kromosoomidega ja käituvad edaspidi kui hamstri kromosoomi normaalsed osad. Selliste integreerunud fragmentide kindlakstegemiseks hübriiditakse hübriidrakkude kromosoome PR-l paljundatud inimese DN geeniprooviga. Kromosoomikaartide koostamisel lähtutakse eeldusest, et X-kiirgusega indutseeritavate katkete esinemise sagedus kahe markeri vahel on proportsionaalne nende kaugusega teineteisest. Näiteks on inimese esimese kromosoomi tsütoloogilisel kaardil 6 ankurmarkerit. Sama kromosoomi kohta on koostatud ES-markerite ja RFLP-markerite geneetilise kaardi kõrval ka kõikehõlmav RH geneetiline kaart, mis on võrreldes eelmistega oluliselt täpsem. 339

22 X-kiirguse kõrge doos een een B Kromosoomid Inimese rakk Rakkude ühinemine (+ polüetüleenglükool) Hiina hamstri rakk een een B een een B een een een B Hübriidne kloon 1 Hübriidne kloon 2 Hübriidne kloon 3 een B puudub Hübriidne kloon 4 Joonis Inimese genoomi geenide kõrge lahutusvõimega kaardistamine kiiritatud somaatiliste hübriidrakkude meetodil. Eeldatakse, et kiiritamisel toimuv kromosoomi katkemise sagedus geenide ja B vahel on proportsionaalne nendevahelise kaugusega. Hübriidsetes kloonides 1, 2 ja 4 on geenid ja B koos, hübriidses kloonis 3 aga geen B puudub enoomi sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimisel tekkis konkurents a. lõi J.. Venter erafi rma elera enomics ja lubas inimese genoomi sekveneerida viie aastaga, s.o. aastaks Riiklik genoomiprojekt, mida juhtis Francis ollins (snd. 1950), inimgenoomi projekti direktor, oli sunnitud tähtajad ümber vaatama. US Valge Maja sekkumisel jõuti lõpuks niikaugele, et tulemusi hakati avaldama koordineeritult. Inimgenoomi esimene versioon avaldati aastal 2001 ja eukromatiinne osa 99% ulatuses aastal Järjestuste analüüs pakkus rea üllatusi. 1. Valke kodeerivate geenide eeldatav arv on oodatust kordi väiksem, vaid e. üks valku määrav geen 145 kb DN kohta. 2. eeni keskmine pikkus on bp ja ta sisaldab keskmiselt 9 eksonit, kusjuures eksonid moodustavad vaid 1,1% ja intronid 24% kogu genoomi DN-st % DN-st on geenidevaheline DN ning 44% sellest moodustub transponeeruvatest elementidest. Inimgenoomi kodeerivatest järjestustest pole molekulaarne funktsioon siiani täpselt teada 41,7% DN kohta (jn ). Ülejäänud DN-st määrab ensüüme 10,2%, muid struktuurgeenide geeniprodukte 17,2% ja nukleiinhapete regulatoorseid geenifunktsioone täitvaid geeniprodukte 13,5%. Lisaks vastutab suur osa (12,2%) teadaolevast DN-st signaali ülekannet määravate geeniproduktide mrn eest ning 5,3% geenide funktsioonist ei teata üldse midagi. 340

23 % või % või % 41 LINE SINE N SI REULRID INRNID Retroposoonid Duplikatsioonid Heterokromatiin % ,5 92 KRDUSJÄRJESUSED UNIKLSED JÄRJESUSED 1,5% Ülejäänud geenid 17,2% Ensüümid 10,2% Funktsioon teadmata 5,3% Signaali ülekanne 12,2% Seondumine nukleiinhappega 13,5% Molekulaarne funktsioon teadmata 41,7% Joonis Inimese genoomi esialgne annotatsioon. N fossiilsed DN transposoonid; SI lihtsad kordusjärjestused; struktuursed geenid; LINE pikad insertsioonilised järjestused; SINE lühikesed insertsioonilised järjestused. 341

24 Histoonid DNaasi suhtes ülitundlik sait H 3 H 3 Histooni atsetüülimine DN metüülimine DN replikatsiooni reguleerivad järjestused DN DNaasiga lõikamine Reportergeeni proov Mikrokiipidel hübriidimine rvutisimulatsioon R-PR een DN Kaugemalseisvad regulatoorsed elemendid (enhanserid, repressorid/vaigistajad, insulaatorid) is-regulatoorsed elemendid (promootorid, transkriptsioonifaktorite seondumissaidid) mrn transkript Joonis Projekti ENDE mitt egeensete funktsionaalsete elementide sedastamise strateegia inimese genoomis. Uuritavad regulatoorsed elemendid on promootorid, enhanserid, vaigistajad, repressori seondumissaidid, transkriptsioonifaktorite seondumissaidid, keemilise modifi tseerimise (atsetüülimine, metüülimine) saidid. Kromosoomides on regulatoorsed elemendid seotud kromatiini struktuuriga: DNaasidele ülitundlikud saidid (transkriptsiooniliselt aktiivne kromatiin), histoonidega seondumise, nukleosoomide moodustumise ja DN replikatsiooni piirkonnad. Kasutatakse järgmisi meetodeid: reportergeeni proovid, mikrokiipidel hübriidimine, pöördtranskriptsiooniline R-PR (kvantitatiivne reaalaja PR), DNaasiga töötlemine, arvutisimulatsioon. 342

25 Siiski, kogu inimgenoomist vaid 1,1% kodeerib valke. Paratamatult tekib küsimus, millist funktsiooni täidab ülejäänud genoom. Selleks loodi uus konsortsium ENDE (ingl. ENyclopedia f DN Elements), eesmärgiks identifi tseerida inimgenoomi mittefunktsionaalseid elemente. Need elemendid on järgmised (jn ): 1) Kaugeleulatuva mõjuga geneetilised elemendid (ehnanserid, repressorid/vaigistajad, insulaatorid); 2) cis-regulatoorsed elemendid (promootorid, transkriptsioonifaktoreid seondavad saidid); 3) üldregulatsioonisaidid (nukleiinhapete metüülimis- ja histoonide atsetüülimissaidid, kromatiini struktuuri kontrollivad faktorid, DNaasi ülitundlikud saidid jms.). ENDE i lähenemisviis eeldab mitmesuguste meetodite kasutamist. Nendeks on töötlus DNaasiga, reportergeenide proovide kasutamine, hübriidimine mikrokiipidel ja bioinformaatiline ettearvamine ning pöördtranskriptsiooniline PR (R -PR) ranskriptooomika Pärmseentel kodeerib ligi 70% genoomist valke. Üks geen on iga ca 2 kb DN-järjestuse kohta. Kuivõrd inimesel ja kõrgematel eukarüootidel on geenid lõhestatud intronitega, siis funktsionaalseid geene saame uurida eelkõige protsessitud mrn transkripti põhjal sünteesitud cdn või ES-ide järgi. Erineva asetusega ja päritoluga sama funktsiooniga geenide transkripte saab eristada piirkonnaga, mis jääb 3 -mittetransleeritavasse alasse, s.t. 3 -translatsiooni terminatsioonikoodoni ja transkripti 3 -terminuse vahele. eenide transkripte saab DN-mikrokiipide (ingl. DN microchips) kasutamisel uurida DN-mikrokiiptehnikaga (ingl. DN microarray) multipleks- e. laikhübriidimistehnoloogia meetodil (ingl. dot blot hybridization array) (jn ). eenispetsiifi lised proovid seotakse (RN või cdn) membraanidele või muudele kandjatele kindlas järjekorras. Nüüdisajal saab geenikiibile kanda üle oligonukleotiidse proovi. Seda võimaldab näiteks silaanitud klaas, mille pindala on vaid mõni ruutsentimeeter. Proovide ülekannet tehakse erinevatel viisidel: 1) oligonukleotiidide mikrosüntees in situ (kiibil); 2) seondatud oligonukleotiidide ülekanne (kandjal) kiibile; 3) DN-fragmentide või cdn ülekanne kiibile. Kiipe testitakse hübriidimisel radioaktiivse või f luorestsentsmärkega märgistatud R N- ehk cdn-proovidega, mis on saadud näiteks mingit kindlat tüüpi rakkude induktsioonijärgsest koekultuurist. Hübriidimine näitab vastavale transktriptile homoloogse transkripti või cdn esinemist, seega vastava geeni aktiivsust. Fluorestsentsi või radioaktiivsust mõõdetakse spetsiifi lise laseraparatuuriga ning töödeldakse kohe sobiva arvutitarkvaraga. Iga uurija ei pea koostama uusi mikrokiipe, sest neid on võimalik ka osta, eriti diagnostilisel eesmärgil. n mikrokiipe, millel on näiteks pärmseente 6000 geeni, äädikakärbse geeni, müürlooga geeni ja inimese geeni proovid. 343

26 eenispetsiifilised hübridatsiooniproovid B utoradiogrammi arvutianalüüs Mikrokiip Madal Ekspressioon Kõrge Joonis eeniekspressiooni mikrokiipide täpplaikude laikhübridatsioonanalüüs.. eenispetsiifi lised hübridatsiooniproovid seondatakse silaanitud klaasile või nailonfiltrile vaakumfiltratsioonil ja hübriiditakse radioaktiivselt või fl uorestseeruvalt märgistatud RN või cdn-ga. B. Hübriidunud RN või cdn visualiseeritakse autoradiograafi a, kvantitatiivsel densitomeetria või fl uorestsentsmarkerite meetodil. eeniekspressiooni tase on nähtav erinevate värvuslaikudena Proteoomika ranskriptoomika ei anna informatsiooni geeni transkriptide translatsiooni kohta. Fluorestseeruvate antikehade kasutamine western-ülekandel või in situ fluorestsentshübriidimisel (FISH) on kohane üksikgeenide uurimiseks. Meduusil (equorea victoria) on looduslik roheliselt fluorestseeruv e. rohefluorestsentsivalk e. FP (ingl. green fluorescent protein, FP). Selle valgu kasutamine tõi revolutsiooni geeniekspressiooni uurimisse valkude tasandil. õepoolest, ühendgeene e. kimäärseid geene on mugav konstrueerida, kui koos uuritava geeni poolt määratava valgujärjestustega on neis FP sünteesi määrav DN-järjestus (jn ). Moodustuv hübriidne valk on sel juhul rakus UV-valguses helenduv ja kvantitatiivselt mõõdetav. Kuivõrd FPvalk on väga väike, siis on selle järjestuse kasutamine mugav ega mõjuta oluliselt uuritava valgu omadusi. FP-valgu kromatofoor moodustab translatsioonijärgselt tsüklisatsioonil ja oksüdatsioonil seriin/türosiin/glütsiin-tripleti. Erinevalt teistest bioluminestseeruvatest valkudest ei nõua FP-valgu avaldumine ei kofaktorite olemasolu ega lisasubstraate. Seepärast saab seda valku kasutada ka valkude uurimisel elusrakus in situ tingimustes. Mutatsiooniliselt on õnnestunud FP-valgu geenides esile kutsuda muutuseid, mis on suurendanud fl uorestsentsi intensiivsust 35 korda. Võib arvata, et enam pole kaugel aeg, kui funktsionaalse genoomika tarvis konstrueeritakse valkkiibid (ingl. protein microarray). 344

27 VRIN 1 Promootor Uuritava geeni kodeeriv järjestus FP kodeeriv järjestus ranskriptsiooni terminatsiooni ja polüadenülatsioonisignaalid een VRIN 2 Promootor FP kodeeriv järjestus Uuritava geeni kodeeriv järjestus ranskriptsiooni terminatsiooni ja polüadenülatsioonisignaalid een Joonis Valkude ekspressiooni uurimine FP-liitvalguga kohapeal (in situ). Meduusist pärit roheliselt fl uorestseeruv valk FP. FP-valgu järjestuse saab sisse viia uuritava geeni ett e (variant 1) või järele (variant 2) ilma geeni poolt kodeeritava valgu funktsiooni muutmata. Hübriidvalk on fl uorestsentsi tõtt u jälgitav elusates rakkudes, kudedes ja organismis. Meeldejätmiseks rganismidel, kellel on määratud täielik nukleotiidne järjestus, on võimalik uurida kõigi geenide ajalist ja ruumilist avaldumist. eenispetsiifi liste hübridatsiooniproovidega geenikiibid võimaldavad uurida samaaegselt tuhandete geenide transkriptsiooni. Elusrakkudes on võimalik uurida valkude lokalisatsiooni kimäärsete geenide abil, mis sisaldavad kodeerivat piirkonda nii meduusi rohefl uorestsentsivalgu (FP) kui ka uuritava geeni kodeeriva järjestuste jaoks Võrdlev genoomika Erinevate organismide genoomide nukleotiidse järjestuste ja genoomi poolt kodeeritud valkude aminohappelise järjestuse võrdlemist nimetatakse võrdlevaks genoomikaks (ingl. comparative genomics). See on tänapäeval kõige otsesem meetod analüüsimaks erinevate organismide evolutsiooni, koostada evolutsioonipuid jmt. Erinevate organismide genoomi suurus valke kodeerivate geenide arvu näitel on väga erinev. Kui mükoplasmal on ca 517 geeni, siis bakteril E. coli on 4288, pagaripärmil 6340, äädikakärbsel , varbussil ja inimesel ca geeni. Samas on mõnede taimede geenide hulk inimese omast isegi mitu korda suurem: näiteks müürloogal 345

28 27 000, riisil ja maisil geeni (jn ). eiseks oluliseks näitajaks on geenide tihedus, s.o. mitme nukleotiidi kohta tuleb üks geen. Kuivõrd faagidel ja viirustel geenid sageli kattuvad, siis siin on 1 geen tavaliselt vaid 500 nukleotiidi(paari) kohta. Prokarüootidel ei ole üldiselt geenides introneid. Nende geenide keskmine pikkus on 1000 bp. Seentel ja ainuraksetel on tavaliselt 1 geen bp kohta, mesilasel 6600 bp kohta, inimesel aga vaid 1 geen bp kohta (jn ) eenide arv eenide arv Mükoplasma E. coli Pärm Äädikakärbes Varbuss Inimene Müürlook Riis Mais Joonis eenide arv eri organismidel eenitihedus (bp/geen) eenitihedus Mükoplasma Varbuss Müürlook E. coli Pärm Äädikakärbes Kana Koer Inimene Joonis Erinevate organismide geenitihedus (bp/geen). 346

29 inuraksed Selgrootud Putukad Kalad Kahepaiksed Linnud Reptiilid Imetajad enoomi suurused Mitteõistaimed Sõnajalad Õistaimed Samblad Vetikad Seened Bakterid rhed Log 10 -väärtus (Mb) Joonis en o o m i s u u r u s e d erinevatel organismirühmadel. Log10 -väärtus väljendab o r g a n i s m i D N hulka (Mb). Mitteõistaimed = paljasseemnetaimed; õistaimed = katteseemnetaimed. Eri liikide ja süstemaatiliste gruppide esindajate genoomide DN kogus varieerub aga veelgi rohkem. enoomi suurust mõõdetakse tavaliselt DN koguhulgaga genoomi ühes koopias ja väljendatakse kas pikogrammides (pg = grammi), daltonites või nukleotiidipaaride arvuna (Mb e. Mbp on miljon aluspaari). Seejuures 1 pg = 978 Mb. Diploidsetel organismidel väljendatakse genoomi suurust -väärtusega (ingl. -value). Huvitaval kombel pole eelkõige eukarüootsete organismide komplekssus otseselt proportsionaalne nende genoomide suurusega. Näiteks üherakulistel ainuraksetel võib olla palju rohkem DN-d kui inimesel (jn ). Samas varieerub genoomi suurus selgroogsetel ca 3300 korda, taimedel 1000 korda, ainuraksetel aga korda. Nii tulebki välja, et üherakulise amööbi moeba dubia genoom on 200 korda suurem kui inimese oma. Seda nähtust nimetatakse -väärtuse mõistatuseks e. -väärtuse paradoksiks (ingl. -value enigma or -value paradox). Paljus on DN ebanormaalselt suur kogus seotud genoomis esineva nn. rämps-dn-ga (ingl. junk DN), s.o. DN-ga, mille täpset funktsiooni me ei tea. Inimese genoomis on sellist DN-d 95%. Rämps-DN päritolu on ilmselt mitmene. sa sellest on pseudogeenid (ingl. pseudogenes) e. kunagi funktsioneerunud ürgsed geenid, millel tänapäeval enam teadaolevat funktsiooni ei ole. eiseks võtavad 8% inimese genoomist enda alla inimese endogeensed retroviirused e. retroposoonid (ingl. retroposons). Lisaks sellele, et genoomis esinevad geenikordused, on paljud kordusgeenid genoomis sarnased. Vastavaid geene nimetatakse homoloogseteks geenideks (ingl. homologous genes). Need geenid on evolutsioneerunud ühest eellasgeenist. Kui nad esinevad sama liigi siseselt, siis nimetatakse neid paraloogseteks geenideks (ingl. paralogous genes), kui aga erinevatel liikidel, siis ortoloogseteks geenideks (ingl. orthologous genes). Üldaktsepteeritavalt on kõigist geenidest vähem kui 1% iseloomulikud vaid prokarüootidele ja ca 20% vaid eukarüootidele Paljud geenid leiduvad nii eukarüootidel kui prokarüootidel ja on homoloogsed inimese geenivalimiga (jn ). Eu- ja prokarüootidele ühiseid geene on 347

30 samuti ca 20%. Inimese ja teiste eukarüootide iseloomulikke e. ühiseid geene arvatakse olevat tervelt 55% kõigist geenidest. Inimese genoomi suurus on ca 3,2 b. inult selgroogsed 22% Prokarüoodid >1% Eukarüoodid ja prokarüoodid 20% Selgroogsed ja selgrootud 24% Homoloogia loomadega puudub 1% Loomad võrreldes teiste eukarüootidega 32% Joonis eadaolevate ja oletatavate inimese valkude homoloogia teiste liikide homoloogsete valkudega. rvutiuuring on esitatud olemasolevate andmebaaside alusel Bioinformaatika Informaatika on teadus, mis tegeleb andmete kogumise, kasutamise, säilitamise, klassi fitseerimise ja analüüsiga. Kui kõike seda tehakse bioloogiliste süsteemidega, siis nimetatakse vastavat distsipliini bioinformaatikaks (ingl. bioinformatics). Bioinfor - maatika mõiste võttis esmakordselt kasutusele Paulien Hogeweg a. Võimsaks tööriistaks on siin sellekohaste arvuti programmide koostamine ja kasutamine. Niisuguste arvutiintensiivsete meetoditega, nagu andmete kaevandamine (ingl. data mining), masin-õppivad algoritmid jt., väljenduseks on järjestuste reastamine, geenide ja nende regulatiivsete piirkondade avastamine, genoomide kokkupanek, valkude järjestuse määramine ja valkude struktuuri oletamine, bioloogilise mitmekesisuse määramine, evolutsiooni modelleerimine jne. lgoritme primaarsete bioloogiliste järjestuste (nukleotiid- ja aminohappelised) info võrdlemiseks bioinformaatikas nimetatakse BLS-iks (ingl. basic local alignment search tool). Vahel nimetatakse vastavat lähenemisviisi ka arvutibioloogiaks (ingl. computer biology), et rõhutada mitmesugust tüüpi informatsiooni kättesaadavuse suurendamist, ümbertöötlust ning matemaatilise aparaadi laiendamist (uued algoritmid, uued statistilised meetodid jne.). 348

31 Prokarüootsed genoomid Prokarüoodid on kõige arvukam organismide rühm Maal (~6 x rakku, ~5 x g, ~4 x x 10 6 liiki). Prokarüootide genoomidel on rida omadusi, mis eristab neid eukarüootide genoomist. 1. enoomid on valdavalt tsirkulaarsed (rõngasjad). Samas on üksikuid lineaarseid ja telomeere sisaldavaid genoome (Borrelia burgdorferi). 2. enoomid sisaldavad sageli ekstrakromosoomseid geneetilisi elemente. 3. Suur enamus bakteritest on haploidse genoomiga. Üksikud on di- ja tetraploidsed (Deinococcus radiodurans), esineb isegi 10 koopiaga polüploid (Methanococcus jannaschi). 4. enoomi suurus on tavaliselt piirides 1 5 Mb. enoomi suurus sõltub geeniduplikatsioonide (arhebakterid) ning korduselementide olemasolust ja arvust genoomis % prokarüoodi genoomist kodeerib valke. Parasiitsetel liikidel on see näitaja oluliselt väiksem, näiteks Mycobacterium leprae l vaid 49,5%, ehkki pole selge, kas see on seotud otseselt parasiitsusega. Samas on oluline nimetada, et sellel organismil on lisaks tervelt 27% genoomist pseudogeenne. 6. -paaride hulk varieerub laias ulatuses: 25 67%. 7. Prokarüootide koodonite kasutussagedus erineb eukarüootide omast. Haemophilus infl uenzae oli esimene rakuline organism, mille genoom a. sekveneeriti ( bp). Väikseim genoom on bakteritest Mycoplasma genitalium il ( bp), mis oma eeldatava 480 geeniga on ilmselt lähedal miinimumile (arvatakse, et väikseim geenide arv võib olla ), mis on vajalik bakteriraku eksisteerimiseks. J. raig Venteri instituudis Marylandis konstrueeriti täielikult sünteetiline bakterigenoom. M. genitalium`i väga aeglase kasvu ja parasiitse elutsükli tõttu otsustati sünteesida kiirelt kasvava sugulasliigi M. mycoides e genoom. See sünteesiti geenikassetidena, mis ühendati kokku bp suuruseks rõngasjaks DN-molekuliks. Sünteetiline genoom transplanteeriti sugulasliiki M capicolum, kus esmalt saadi kahe genoomiga hübriidid. Kuivõrd sünteetiline genoom oli märgistatud E. coli lacz-geeniga (annab X-gal i juuresolekul siniseid kolooniaid) ja tetratsükliiniresistentsust määrava geeniga, siis selektsiooni tulemusel saadi vaid sünteetilise genoomiga (ühetuumalised) rakud, kus genoom oli täielikult funktsionaalne. bligaatsetel sümbiontidel, kes kasutavad peremeesraku abi, on organismi genoom veelgi väiksem. Näiteks Nanoarchaeum equitans i genoom on suurusega bp, sisaldades 563 geeni. Bakteritest on mükoplasma (Mycoplasma tuberculosum) vast inimese surma põhjustajana (kopsupõletik) esikohal ning tema genoomi suurus on bp (4 187 geeni), mis on lähedane Escherichia coli tüve K12 genoomi omale ( bp ja geeni). Vabalt elavate bakterite genoomid on aga veelgi suuremad. Näiteks on mullabakteri Bradyrchizobium japonicum (põhjustab taimedel juuremügarike teket) genoom bp suurune (8317 oletatavat geeni). Bakterite spetsialiseerumisel polegi nagu piire. n teada, et Sulfolobulus e liigid kasvavad temperatuuril 85 0 tugevalt happelises mullas (ph = 1). eobacter aga kasvab kuumaveeallikates temperatuuril (sama temperatuur kui 0,5 atmosfääri juures autoklaavimisel!). Samasse bakteriliiki kuuluvate bakterite genoomid võivad erineda isegi ühe miljoni aluspaari (bp) ulatuses. Ehkki sageli on patogeensete mikroorganismide genoomid väiksemad kui vabaltelavatel mikroorganismidel, varieerub ka nende suurus väga ulatuslikult (jn ). 349

32 Patogeensed ainuraksed 60,4 ryponosoma cruzi rüpanosomiaas 35,0 rypanosoma brucei 33,6 Leishmania major 23,0 Plasmodium falciparum Patogeensed bakterid 4,8 Bacillus anthracis 4,5 Salmonella typhi 4,4 Mycobacterium tuberculosis 4,38 Yersinia pestis 3,88 Bordetella pertussis 2,8 Mycobacterium leprae 2,5 Vibrio cholerae 1,67 1,1 1,1 1,0 Helicobacter pylori Rickettsia provazekii reponema pallidum afrika unitõbi Leegionärihaigus Malaaria ntraks Salmonelloos uberkuloos Katk Läkaköha Pidalitõbi Koolera Maohaavandid üüfus Süüfilis hlamydia pneumoniae Hingamiselundite ja südame-veresoonkonna haigused 0,95 Borrelia burgdorferi Borrelioos Bakterid (Mb) ja ainuraksed (x 10 Mb) Joonis Patogeensete mikroorganismide genoomide suurused. Bakterite ja ainuraksete genoomide suurus = Mb. Ehkki soolekepikese Escherichia coli genoomi primaarstruktuur avaldati juba a., on selles genoomis ikkagi veel ligi kolmandik tundmatu. letatakse, nagu juba ülalpool märkisime, 4288 valku tootva geeni olemasolu. eenidevaheline keskmine kaugus on 118 bp ning korduselemendid haaravad enda alla vaid ca 0,7% genoomist. Seevastu 68% E. coli genoomis paiknevatest IS-elementidest assotsieeruvad horisontaalse geeniülekande DN-ga. Seni sekveneeritud genoomidest on E. coli genoomil suurim sarnasus Haemophilus infl uenzae geenikomplektiga. Seevastu pärmseenega (Saccharomyces cerevisiae) on sarnasus 20% ning arhebakteritega 30%. Nüüdseks sekveneeritud genoomidest on Rickett sia prowazekii genoom kõige sarnasem hoopis mitokondrite genoomiga. R. prowazekii on rakusisene parasiit, mis tekitab tüüfust. ma nime sai ta tüüfusetekitajat uurinud teadlaste (kes lõpuks ka ise nakatusid ja tüüfusesse surid), US mikrobioloogi Howard. Rickettsi ( ) ja šehhi parasitoloogi Stanislaus J. M. von Prowazeki ( ) järgi. Mitokondrite genoomidest on R. prowazekii genoom ( bp, 834 geeni) omakorda kõige sarnasem alglooma Reclinomonas americana mitokondri genoomiga ( bp, 67 geeni). Mitokondrite genoomi puhul on tegemist reduktiivse evolutsiooniga (ingl. reductive evolution). See on toimunud samuti kui teistel rakusisestel parasiitidel, kus parasiidid kaotavad järk-järgult geneetilist informatsiooni, sest kaotatud geenide funktsiooni kompenseerivad peremeesraku tuumas olevad geenid. Näiteks pole R. prowazekii genoomis enam aminohapete ja nukleotiidide sünteesiks vajalikke geene. R. prowazekii geenide kaotamisele viitab ka fakt, et tema genoomis on tervelt 24% valke mittekodeerivat DN-d. 350

33 Peremeesvalk DN-ga seondumise geeni domeen Intein Endonukleaas Ürgne inteinigeen Endonukleaasigeen 1 2 Valgulise introniga (inteiniga) geen Valgulise introniga (inteiniga) geen Eellasvalk utokatalüütiline splaissing eeni DN-ga seondumise domeen eeni DN-ga seondumise domeen DN-ga seondumise geeni domeen Eellasvalk Endonukleaas Endonukleaasigeen Intein Peremeesvalk Joonis Valguliste intronite e. inteinide moodustumine. Inteinid on iseseisvalt DN-fragmendilt sünteesitud valgud, mis transleeritakse koos peremeesgeeni valguga. Peremeesvalgu geen on joonisel esitatud DN-ga seondumise geeni domeenina inteini erinevates osades (1 ja 2). Moodustunud eellasvalgus toimub inteini koosseisus oleva endonukleaasi toimel valgu autokatalüütiline splaissing, moodustuvad peremeesvalk ja intein. rhede (ingl. archaea) genoomide sekveneerimine on näidanud lisaks arhede unikaalsete geenide esinemisele, et nad on sisuliselt siiski hübriidsed organismid, sest osa nende geene sarnanevad bakteritega, osa eukarüootidega. Samas on arhed evolutsiooniliselt selgelt lähemal eukarüootidele kui prokarüootsetele bakteritele. Esimene arhe Methanococcus jannaschii sekveneeriti a. ema genoomis sisalduvast 1738 geenist 27% on unikaalsed. Nimetatud organism on tõeliselt omapärane. a elutseb Vaikse ookeani sügavikes (kuni 2600 m sügavusel), kus temperatuur on ja rõhk 200 atmosfääri, ta kasutab elutegevuseks 2, N ja H ning produtseerib metaani, sest hapnik on temale letaalne. a kannatab vee soolsust 1,0 5,0%, tal on 1 kromosoom ja 2 plasmiidi (ilmselt primitiivsed viirused). Selles organismis on kirjeldatud ka 18 valgulist intronit e. inteini (ingl. inteins). Need väikesed elemendid transleeritakse koos peremeesvalguga ning lõigatakse järgnevalt valgust välja autokatalüütilise splaissingureaktsiooniga. avaliselt esineb inteiniga koos endonukleaasi määrav DN-järjestus. Moodustuvad kaks valku: peremeesvalk ja intein (jn ). Inteinid on kõigil kolmel eluvormil (arhead, bakterid ja eukarüoodid), seda vähemalt 50-l erineva funktsiooniga valgu tüübil Eukarüootsed genoomid Eukarüootsete genoomide iseloomulikud omadused on alljärgnevad. 1. eneetiline info paikneb valdavalt tuumas (nukleaarselt). 2. Lisaks esineb kloroplastide ja mitokondrite genoom. Erandiks on organismide rühm rchaeozoa, kelle organellides puudub DN. 351

34 2,5 Log 10 (x+1) protsent genoomi transponeeruvatest elementidest 2 1,5 1 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Log 10 (x+1) genoomi suurusest (Mb) Joonis eenide hulga ja transponeer u v a t e e l e m e n t i d e suhe eukarüootsetes genoomides. 3. Vähemalt mõnes elutsükli osas esineb diploidne faas. 4. DN hulk haploidses genoomis e. -väärtus on liigispetsiifi line (piirides 0,5 132 pg). 5. Väiksemates genoomides on rohkem aktiivseid transposoone (jn ). 6. enoomide komplekssust väljendatakse DN reassotsiatsiooni kiiruse järgi ( o t 1/2 ). 7. -paaride hulga varieeruvus on väga suur. 8. Püsisoojaste loomade genoom on segmenteerunud blokkideks (300 kb) e. isohoorideks (ingl. isohores). Isohooride koostist väljendatakse + hulga alusel ning neid jaotatakse kergeteks (L ingl. light) ja rasketeks (H ingl. heavy) isohoorideks. 9. Nukleaarses genoomis ilmnevad mõned kõrvalekalded universaalsest geneetilisest koodist (jn ). Eukarüootsete organismide genoomid on oma koostiselt suhteliselt unikaalsed, mistõttu ülevaate saamiseks on mõistlik käsitleda alljärgnevalt üksiknäiteid seoses geneetiliste mudelorganismidega Pärmseente genoom Esimeseks sekveneeritud eukarüoodiks oli a. järjestatud pärmseen, pagaripärm (Saccharomyces cerevisiae). ema genoomi iseloomulikud omadused on järgmised. 1. Suurus 14 Mb, genoomis on 16 kromosoomi ning lisaks plasmiidid ja dsrnviirused. 2. Umbes 6340 geeni, milledest valke kodeerivaid 5773 (neist 25% seni iseloomustamata). 3. 7% genoomist kodeerib mittetransleeritavat RN-d. 4. eenide keskmine kaugus üksteisest on ca 2 kb. 5. Kromosoomides esinevad funktsionaalsed elemendid (RS, EL, EN). 352

35 Koodon Erinevus universaalsest koodist akson U Leu Ser andida U Ile eadmata Micrococcus U Stopp ln Ripsloomad ja rohevetikad U Stopp ln Ripsloomad ja rohevetikad U Stopp rp Mükoplasma U Stopp ys Ripsjad eukarüoodid U Stopp Selenotsüsteiin Bakterid, eukarüoodid rg eadmata Spiroplasma rg eadmata Spiroplasma Joonis uuma genoomis esinevad kõrvalekalded universaalsest koodist. Esitatud ei ole kõiki erinevusi a. sekveneeriti käärituspärmi (Schizosaccharomyces pombe) genoom. See genoom on märksa sarnasem kõrgemate eukarüootide omadega kui S. cerevisiae genoom. S. pombe genoomi suurus on 13,8 Mb, sisaldab aga vaid 4940 valku kodeerivat geeni (vaid 57% genoomist), seevastu intronite arv on suur (S. cerevisiae 5%, S. pombe 43%) ja transposoonide arv väike (S. cerevisiae l arvukalt, S. pombe l vaid mõned) inuraksete genoom inuraksetest sekveneeriti esimesena a. eukarüootne parasiit Plasmodium falciparum (malaariatekitaja). Selle organismi genoomi suuruseks on 23 Mb, sisaldades 14 kromosoomi ja ca 5300 geeni. eenid (ca 2,4 kb) on pikemas DN-lõigus kui pärmidel. enoomist moodustavad intronid 54%, kuid retroposoonid puuduvad Varbussi genoom rengubioloogia ülitähtsa mudelorganismi, hulkrakse mullanematoodi, aenorhabditis elegans (varbuss) genoom sekveneeriti a. Selle organismi genoom on ca 100 Mb suurune, sisaldades geeni, milledest vaid 1000 kodeerivad RN-d geeni kohta on eksperimentaalsed tõestused, ülejäänud on määratud in silico. enoomi kodeeriv osa on 27%, intronite osa 26%. Kolmandik (32%) kodeerivast osast on sarnane inimese geenidega ja, vastupidi, 70% inimgeenidest on sarnased. elegans i omadega. eeni keskmiseks pikkuseks genoomis on 5 kb geeni kohta, kusjuures suur osa geenidest on koondunud operonidesse (nagu prokarüootidel). 353