Statistička obrada genetičkih podataka u forenzici

Transcript

1 Statistička obrada genetičkih podataka u forenzici

2 tumačenje DNK dokaza je problematika molekularne i populacione genetike

3 molekularna genetika DNK ekstrakcija DNK kvantifikacija PCR amplifikacija multiplih STR markera odvajanje PCR produkata STR alela genotipizacija uzorka populaciona genetika i statistika poredjenje genotipa uzorka sa ostalim uzorcima i bazom podataka ako se poklopi, poredjenje DNK profila sa bazama podataka različitih populacija računanje verovatnoće slučajnog poklapanja na osnovu baza podataka različitih populacija formiranje izveštaja o posebnom slučaju

4 Organizacija genoma (eukariota) cpdnk

5 Oko gena je identifikovano tokom Projekta Humanog Genoma- HGP (od 1990) Samo oko 2% humanog genoma čine geni koji kodiraju za proteine Promene u sekvencama DNK mogu da se dese bilo gde, ne samo u genima I najmanje variranje u sekvenci DNK može imati veliki uticaj na razvoj oboljenja, odgovor na sredinu, na terapiju lekovima, itd. Postoji i neutralno variranje, ne utiče na osobine, na adaptivnu vrednost

6 0.1% ~ 3 miliona baza ~ 10 miliona DNK varijanti koje se mogu naći u različitim kombinacijama dovoljno da se obezbedi individualna unikatnost na nivou DNK fokus forenzičke genetike je u 0,1% razlika u pojedinim regionima genoma medju jedinkama najveći deo razlika, oko 85% je meñu jedinkama unutar populacija

7 DNK polimorfizmi Uopšteno, DNK polimorfizmi koji se koriste za individualnu genotipizaciju se odnose na različite dužine i ponavljanja sekvence u DNK, uglavnom u nekodirajućim regionima RFLP (polimorfizam dužine restrikcionim fragmenata) RAPD (nasumično umnožena polimorfna DNK) AFLP (polimorfizam umnoženih fragmenata prema dužini STR - tandemski ponovci: minisateliti, mikrosateliti SNP (polimorfizmi pojedinačnih nukelotida) rasuti ponovci: SINE, LINE

8 Kratki tandemski ponovci, mikrosateliti Slika Shema 5 STR lokusa sa različitim brojem ponavljanja osnovnog motiva koji može da se sastoji od 2 do 5bp u datom primeru.

9 Mikrosateliti su pogodni za individualnu genotipizaciju visoko polimorfni mogu razlikovati i bliske vrste daju visoku verovatnoću poklapanja

10

11 Lokus D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 Genotip 15, 18 16, 16 19, 24 12, 13 29, 31 12, 13 11, 13 Učestalost 8.2% 4.4% 1.7% 9.9% 2.3% 4.3% 13% Lokus D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1PO AMEL Genotip 11, 11 10, 10 11, 11 9, 9.3 8, 8 11, 11 X Y Učestalost 1.2% 6.3% 9.5% 9.6% 3.52% 7.2% Primer DNK profila muškarca za 13 lokusa SAD databaze CODIS (Combined DNA Index System):

12 Populaciona genetika se bavi izučavanjem faktora koji utiču na alelske i genotipske učestalosti u populacijama Učestalosti alela Koliko se često jedna varijanta gena (sekvence genoma) nalazi u populaciji? Učestalosti genotipova Koliko se često homozigot ili heterozigot nalazi u populaciji? Učestalosti fenotipova Koliko se često neki fenotip nalazi u populaciji?

13 Mendelovi principi utiču na učestalosti alela i genotipova ravnoteža je posledica segregacije alela putem mejoze Količina genetičke varijabilnosti je konstantna kroz generacije populacije različite su genotipske kompozicije - iste učestalosti alela

14 HARDI-VAJNBERGOV PRINCIP pri uslovima oplodnje po principu slučajnosti, u velikoj populaciji, gde svi genotipovi imaju jednako preživljavanje, učestalosti genotipova odreñene generacije, zavise od učestalosti alela u prethodnoj generaciji

15 na osnovu principa segregacije i slobodnog kombinovanja, ako oba roditelja produkuju isti broj gameta onda će učestalosti alela biti jednake učestalostima gameta koji ih nose. učestalosti ženskih gameta učestalosti muških gameta p (A1) q(a2) p (A1) p 2( A1A1) qp(a2a1) q (A2) pq(a1a2) q 2 (A2A2) Slučajnim spajanjem gameta iz roditeljskih genotipova, dobijaju se zigoti, čija su učestalosti odreñene učestalostima gameta čijim su spajanjem nastali Tabela 5.1. Kombinacije parenja genotipova i učestalosti genotipova potomaka pod uslovima slučajnog parenja uz genotipske učestalosti p 2 A 1 A 1 + 2pq A 1 A 2 + q 2 A 2 A 2 roditelji potomci parovi učestalosti A1A1 A1A2 A2A2 A 1 A 1 x A 1 A 1 p 2 x p 2 =p 4 p A 1 A 1 x A 1 A 2 2 x p 2 x 2pq=4p 3 q 2p 3 q 2p 3 q - A 1 A 1 x A 2 A 2 2 x p 2 x q 2 =2p 2 q 2-2p 2 q 2 - A 1 A 2 x A 1 A 2 2pq x 2pq=4p 2 q 2 p 2 q 2 2p 2 q 2 p 2 q 2 A1A2 x A2A2 2 x 2pq x q 2 =4pq 3-2pq 3 2pq 3 A 2 A 2 x A 2 A 2 q 2 x q 2 =q q 4

16 Roditeljska generacija Alel A1 Učestalost p Potomačka generacija Hardi-Vajbergova RAVNOTEŽA genetička ravnoteža genofonda Genotip A1A1 A1A2 Učestalost p 2 2pq Alel A1 Učestalost p 2 +[(2pq)/2] p 2 + pq p(p+q) (p+q=1) p

17 Veze učestalosti alela i genotipova

18 Multipli aleli n alela - broj mogućih diploidnih genotipova = [n (n + 1)] / 2 - broj mogućih homozigota = n - broj mogućih heterozigota = [n (n - 1)] / 2 učestalost odgovarajućeg homozigota = P ii = p i 2 učestalost svih homozigota = p 12 + p p n 2 = Σ p i 2 multinominalna distribucija učestalost odgovarajućeg heterozigota = H ij = 2p i p j Hardi-Vajnebergova (očekivana) heterozigotnost H exp = p 1 p 2 + p 2 p 1 + p 1 p = Σ p i p j = 1- Σ p i 2 - razlika ukupne učestalosti svih genotipova (1) i učestalosti svih homozigota Σ p i 2

19 Broj alela = Broj mogućih Maksimalna heterozigotnost broj homozigota = n heterozigota (kada je p = q = r =...) 2 1 1/2 = 0, /3 = 0, /4 = 0, /5 = 0, n [n(n-1]/2 (n-1)/n Maksimalna heterozigotnost za posmatrani lokus u populaciji kada svi njegovi aleli imaju iste učestalosti (p i = 1 / n) n

20 Hardi-Vajnbergov princip omogućava da se u opisivanju genofonda u obzir uzme samo n alela na posmatranom lokusu da bi se opisao genofond neke populacije n( n +1) 2 ako ima n alela na m lokusa tada je broj mogućih genotipskih kombinacija jednak: m n( n + 2 1) m

21 Testiranje HW ravnoteže χ2 = k i= 1 ( D O) O 2 Tabela 5.4. Poreñenje očekivanih i dobijenih učestalosti genotipova lokusa MN krvnih grupa u četiri populacije ljudi. Očekivane učestalosti genotipova se računaju prema HW principu iz dobijenih učestalosti alela. Primećuje se ravnoteža unutar pojedinih populacija ali odstupanje kada je cela ljudska populacija u pitanju (Griffiths et al., 2004) χ2 DOBIJENO OČEKIVANO populacija M/M M/N N/N M/M M/N N/N Inuiti Egipćani Kinezi Australijski aboridžini 0,835 0,278 0,332 0,024 0,156 0,489 0,486 0,304 0,009 0,233 0,182 0,672 0,834 0,274 0,331 0,031 0,159 0,499 0,488 0,290 0,008 0,228 0,181 0,679 za DNK polimorfizme koji se koriste u forenzici se podrazumeva da su u Hardi-Vajnbergovoj ravnoteži Različiti testovi...hi-kvadrat, odnos verovatnoća, multilokusni egzaktni test...

22 Primer: Primena Hardi-Vajnbergovog principa u forenzici DNK profilisanje razlikuje jedinke u populaciji preko DNK polimorfizama Hardi-Vajnbergova jednačina i račun verovatnoće se koristi za statistiku DNK poklapanja profila uzoraka na primer, osumnjičenog i dobijenih sa mesta zločina

23 Primer: Primena Hardi-Vajnbergovog principa u forenzici Odreñuje se homozigotnost/heterozigotnost za svaki ponovak očekivane genotipske učestalosti p 2, 2pq, q 2 se računaju na osnovu referentnih učestalosti alela za datu populaciju (Tabela 8.1 u knjizi (Introduction to FG) Množenjem genotipskih učestalosti dobija se verovatnoća odreñene kombinacije DNK sekvence u populaciji PROFILA Ako je dobijena kombinacija alela osumnjičenog veoma retka u populaciji iz koje je osumnjičeni, a poklapa se sa nañenom DNK na mestu zločina, potvrñuje se identifikacija. Zadatak: Na slici je DNK profil osumnjičenog sa mesta zločina na osnovu 4 lokusa i učestalosti njihovih alela u etničkoj grupi kojoj osumnjičeni pripada. Izračunajte očekivanu učestalost ovakvog profila. Izvedite zaključak o (ne)slučajnosti poklapanja.

24 VEROVATNOĆA POKLAPANJA IDENTITETA (matching probability- MP) računa se preko alelskih učestalosti procenjenih za referentnu populaciju iz koje je uzorak Primer: 2 lokusa sa 2 alela, referentne populacione učestalosti: p 1 =q 1 =0.50 p 2 =0.90, q 2 =0.10 nadjeni uzorak je pokazao da su oba lokusa u heterozigotnom stanju. Koja je verovatnoća da će slučajno uzorkovana jedinka u toj populaciji imati takav genotip? MP za svaki lokus je: Lokus 1: 2p 1 q 1 =0.50 Lokus 2: 2p 2 q 2 = 0.18 MP za oba je 0.50 x 0.18= 0.09 je šansa da se nadjeni genotip pripiše pogrešnoj jedinki tj. da u toj populaciji još neko ima isti genotip Više lokusa, smanjuje se verovatnoća pogrešnog MP Dobro je znati referentne učestalosti u odredjenoj populaciji. Ako se ne zna, koriste se odgovarajuće dostupne baze. Što je veća baza to će biti pouzdanija MP

25 Korekcije alelskih učestalosti iz referentnih baza baza podataka alelskih učestalosti za lokuse koji se koriste je neophodna za upotrebu HW u forenzičkoj genetici konstruišu se za definisane populacije, na osnovu najmanje 100 nesrodnih osoba, za oko 200 alela po lokusu postoje ograničenja, naročito ako se radi o retkim alelima i malim populacijama Baldingova korekcija: učestalost profila se koriguje na osnovu dodavanja utvrdjenih alela u datom slučaju, postojećoj bazi podataka o alelima, pa se preračunaju očekivane učestalosti genotipova za svaki lokus, a time i profila (knjiga, str. 81., tabele: 8.1. i sa korekcijom, 8.2.) Granica učestalosti alela (ceiling principle) i profila retki aleli mogu da se ne nalaze u bazama. Uvodi se princip minimalne vrednosti učestalosti alela koje se mogu uzeti (oko 0,01). Ili se koristi najmanji broj nañenih alela/broj jedinki u celoj bazi Dodatne korekcije uzimaju u obzir i druge faktore koji remete ravnotežu populacije

26 Pretpostavke HW ravnoteže parenje je po principu slučajnosti prirodna selekcija ne utiče na lokus koji se razmatra STR i ostali lokusi koji se koriste u forenzici su takozvani neutralni, tj, ne utiču na adaptivnu vrednost jedinki mutacija se može zanemariti STR lokusi imaju relativno visoku stopu mutacija što ih čini veoma polimorfnim markerima ali, unutar populacije te stope su ipak dovoljno niske po generaciji pa ne utiču na promene alelskih učestalosti konstantno velika populacija - nema genetičkog drifta migracija (protok gena) zanemarljiva

27 Inbriding u populaciji Slika 6.6. Aleli u predačkoj populaciji i genotipovi u sadašnjoj; autozigotni homozigoti, alozigotni homozigoti i alozigotni heterozigoti

28 Verovatnoća da su dva alela na jednom lokusu kod odreñene jedinke indentična po poreklu koeficijent inbridinga (F) Slika 6.8. Inbriding usled male brojnosti populacije. Genotipovi su dati u generacijama t i t-1, uzorak 2N gameta uzima se slučajno iz genofonda verovatnoćom 1/2N da će u t-1 biti identični i sa verovatnoćom 1-1/2N da neće.

29 Inbriding, veličina populacije, heterozigotnost Mala veličina populacije povećava verovatnoću parenja u srodstvu Koeficijent inbridinga je obrnuto proporcionalan veličini populacije Koeficijent inbridinga stoji u relaciji sa smanjenjem heterozigotnosti Heterozigotnost populacije opada, po stopi 1/(2N) za svaku generaciju F t 1 2N 1 1 2N F = + t 1 H t F H = 1 H 1 2N t 0 = 1 H t 1 Postojanje inbridinga u populaciji: H<2pq, F > 0

30 Čovek sa šimpanzom ima zajedničkog pretka pre oko 6 miliona godina..genomi su divregirali za oko 5%, DNK sekvenca za oko 1,2% a inserciono-delecione zamene u ovim genomima su doprinele još oko 3,5% divergencije Savremeni ljudi datiraju od pre oko godina...nukleotidne zamene su donele prosečno razliku na svakih nukleotida, pa se meñusobno razlikujemo u oko 0,1% genoma

31 Slika Putanje u rodoslovu koje pokazuju verovatnoće da su odreñeni aleli (tačke na linijama) identični po poreklu.

32 U uzorku alela koji oslikavaju varijabilnost populacije svaki ima različitu istoriju; aleli mogu poticati od istog pretka u prethodnoj generaciji ili nekoj daljnoj generaciji. Tačka zajedničkog pretka je tačka slivanja, tj. koalescencija. Ako se ide dovoljno daleko u istoriju populacije, u jednom uzorku svi aleli se slivaju u jednom zajedničkom predačkom alelu. generacija alel n (sadašnjost) 5 (sadašnjost)

33 Mutacije obezbeñuju proces divergencije sekvenci i razlike se vremenom akumuliraju. Mutacije se dešavaju nezavisno kod različitih jedinki u različitim generacijama, akumuliraju vremenom u linijama i odvajaju. Što je veća razlika u sekvencama, duži je i period od kada su se linije odvojile od zajedničkog pretka.

34 Primer: odreñivanje najskorijeg zajedničkog pretka. Nakon 4 slivanja svi aleli potiču od jednog zajedničkog pretka. Očekivano vreme tokom koga nastaje n odvojenih linija mereno sa 2N je: Očekivano vreme dostiže 4N kako opada broj linija, što je očekivano vreme za fiksaciju novonastale mutacije. prošlost T2 T3 T4 sadašnjost Uzorkovani aleli T5

35 vreme Pri konstantnoj N broj koalescencija je nešto veći ka vrhovima grana jer su očekivana vremena kraća pri većem n. Sa opadanjem veličine populacije broj skorašnjih koalescentnih dogañaja raste. Kako N raste unatrag vreme koalescencije će biti sve duže u poreñenju sa populacijom konstantne brojnosti. Sa širenjem populacije malo je koalescentnih dogañaja u skorije vreme. Kako N opada unatrag, vreme koalescencije je sve kraće u poreñenju sa populacijom konstantne brojnosti.

36 Neutralnost predviña da porast Ne ili µ povećava heterozigotnost, a smanjuje homozigotnost Θ=4Neµ Porast mutacione stope povećava heterozigotnost. Markeri različite µ Porast efektivne veličine populacije povećava heterozigotnost. Markeri na X hromozomu i autozomima

37 Mutacija i drift Neutralistička teorija predviña da mutacije stvaraju nove alele, dok genetički drift menja njihovu učestalost. N jedinki, 2N alela, mutaciona stopa µ Svaka mutacija stvara novi alel. Početna učestalost alela je 1/(2N). Ukupno novih neutralnih mutacija u genofondu 2Nµ Verovatnoća fiksacije svakog novog alela je jednaka njegovoj učestalosti 1/(2N), a eliminacije 1-(1/2N). Kojom stopom se fiksiraju aleli? proizvod verovatnoće fiksacije nekog novog neutralnog alela i prosečnog broja novih neutralnih mutacija u svakoj generaciji 1/(2N)x2Nµ=µ. Vreme koje proñe izmeñu dve fiksacije je 1/µ, nezavisna je od N Vreme potrebno da se neka mutacija fiksira od trenutka kada nastane, je zavisno N i iznosi 4N generacija.

38 Novi aleli ulaze u populaciju mutacijama, sa početnom učestalošću 1/(2N). Većina alela se gubi, ali onima koji se fiksiraju treba otprilike 4N generacija. Vreme izmeñu zamene fiksiranih alela je 1/µ generacija.

39 Usko grlo i efekat osnivača Smanjuje se broj alela Smanjuje se heterozigotnost. Ali manjom brzinom nego broj alela. Populacije koje su prošle kroz skorašnje usko grlo imaju veću heterozigotnost nego što bi se očekivalo za dati broj alela. Menja se distribucija alela Za mikrosatelitsku varijabilnost u populacijama koje su prošle usko grlo, očekuje se da se smanji broj alela i opseg dužine alela. Opseg dužine alela je stabilniji parametar. usko grlo

40 Analizom genetičke varijabilnosti i prostornog rasporeda populacija možemo steći sliku populacione istorije. Iz kog regiona potiču populacije? Prema stepenu diverziteta, retkim alelskim varijantama. Kada i kako su se populacije sažimale i povećavale brojnost?

41 populaciona fragmentacija (genetički drift) i ponovno spajanje (protok gena) nekadašnja distribucija sadašnja distribucija

42 Kada se populacija fragmentiše, različiti fragmenti dobijaju početne alelske učestalosti slučajnošću Tako dolazi do različitosti, diferencijacije subpopulacija (fragmenata) čiji se stepen meri varijansom alelskih učestalosti: V = pq/2ne Što su manji fragmenti, to je veća varijansa, diferencijacija u proseku, fragmentisana populacija posmatrana ucelo, ima smanjenu heterozigotnost (usled slučajnog uzorkovanja od prvobitne populacije 1/(2Ne) ali, povećanu varijansu heterozigotnosti za lokuse unutar subpopulacija

43 Substruktuiranje populacija različiti faktori sprečavaju protok gena medju fragmentima, subpopulacijama Gubitkom heterozigotnosti unutar fragmenata, alelske učestalosti meñu fragmentima slučajno osciliraju (drift) Pri spajanju ovako razdvojenih delova, ili pri ponovnom protoku gena, dolazi do manjka heterozigotnosti na nivou nove populacije i viška homozigota - Valundov efekat.

44 Slika Dobijena i očekivana heterozigotnost na jednom lokusu sa dva alela u razdeljenoj populaciji. Kriva predstavlja očekivanu heterozigotnost ( 2 pq ), p 1 i p 2 su učestalosti alela u subpopulacijama, sa očekivanim heterozigotnostima H 1 i H 2 i prosečnom učestalošću p. H D je dobijena heterozigotnost kao prosek u obe populacije. (Izvor: Halliburton, 2004)

45 opisivanje genetičke diferencijacije razlaganjem genetičke varijabilnosti u fragmentisanoj populaciji tri F koeficijenta koji se odnose na genetičku varijabilnost: na nivou cele populacije (F IT ) izmeñu subpopulacija (F ST ) meñu jedinkama (F IS ) inbriding - rezultuje iz populacione fragmentacije, mera genetičke diferencijacije meñu fragmentima populacije: F IS koeficijent inbridinga uprosečen meñu jedinkama iz svih fragmenata F ST efekat populacione fragmentacije na inbriding F ST ima opseg od 0-1 (nema diferencijacije meñu fragmentima) - (došlo je do fiksacije različitih alela u fragmentima). sa visokom stopom protoka gena meñu fragmentima F ST je nizak

46 F-statistika koristi odnose heterozigotnosti za genetičke markere: F ST = 1 H H S T F IS = 1 H H I S F IT = 1 H H I T gde je: H I dobijena heterozigotnost uprosečena po svim fragmentima H S očekivana heterozigotnost uprosečena po fragmentima H T očekivana heterozigotnost za celu populaciju Pozitivne vrednosti koeficijenata F IS i F IT ukazuju na manjak, a negativne na višak heterozigota.

47 Valundov efekat - smanjena učestalost heterozigota u odnosu na očekivanu, pri intenzivnom protoku gena izmeñu dve ili više populacija, odnosno subpopulacija, ili dema. Parametar F ST za neku populaciju na odreñenom lokusu može se utvrditi i iz: V ( p) F ST = pq gde je, za S subpopulacija varijansa učestalosti alela: 1 V ( p) = ( pi p) S 2

48 Tabela Poreñenje opisa efekta populacionog razdvajanja na ravnotežne učestalosti genotipova genotip Hardi-Vajnberg Rajt Valund A 1 A 1 p 2 p 2 +pqf ST p 2 +V(q) A 1 A 2 2pq 2pq-2pqF ST 2pq-2V(q) A2A2 q 2 q 2 +pqfst q 2 +V(q)

49 U forenzičkoj genetici, u računanju učestalosti profila, osim korekcija za veličinu uzorka mora se uzeti u obzir struktuiranost populacija usled različitih uzroka: parenje je asortativno, unutar subpopulacija, manjih ili većih etničkih grupa pa veća je verovatnoća da aleli budu identični po poreklu (IBD) a ne da se slučajno poklapaju po strukturi (IBS). genetički drift, visoka učestalost retkih alela u nekoj grupi, diferencijacija meñu populacijama migracije,spajanje populacija (Valundov efekat) Koristi se vrednost θ (teta) koja opisuje stepen diferencijacije meñu subpopulacijama to je F ST = verovatnoća da će dva slučajno uzorkovana alela iz pojedinačnog fragmenta populacije biti identična po poreklu Za STR lokuse pokazano je da je θ vrednost niska. U korekcijama se koristi θ od 0,01 za homogenije populacije, a 0,03 za izolovanije više diferencirane Profili se tada računaju kao u primeru 8.1 i 8.2 na strani 82.

50 prosečna verovatnoća identiteta PI AV Statistička snaga molekularnih markera da identifikuju sve jedinke nakon odredjivanja njihovog multilokusnog genotipa procenjuje se na osnovu prosečne verovatnoće identiteta PI AV. Verovatnoća da će slučajno uzorkovane 2 jedinke imati isti genotip za date lokuse ako se nadju 2 uzorka može se potvrditi ili odbaciti da li pripadaju istoj jedinki

51 prosečna verovatnoće identiteta PI AV. PI AV =Σp i4 + Σ(2p i p j ) 2 p i i p j su učestalosti alela i odnosno j p i 4 je prosečna verovatnoća slučajnog uzorkovanja homozigota, a (2p i p j ) 2 heterozigota Podrazumeva se Hardi-Vajnbergova ravnoteža: da su jedinke nesrodne, slučajno uzorkovane i nema LD ili substruktuiranosti populacije odnos PI AV i broja lokusa za različite heterozigotnosti PI AV =Σp i4 + Σ(2p i p j ) 2 H e =1-Σp i 2 Da bi se dobio niski PI AV potrebno je 5-20 markera U forenzici treba više lokusa nego u konzervacionoj genetici

52 MP vs PI AV MP predstavlja aktuelnu verovatnoću uzorkovanja jedinke identične onoj koja je već uzorkovana PI AV je prosečna verovatnoća da slučajno uzorkovane 2 jedinke budu iste MP daje verovatnoću uzorkovanja pojedinačnog genotipa koji se ispituje i koji je prethodno uzorkovan PI AV izračunava prosečnu statističku snagu za set markera uzimajući u obzir i homo i heterozigote u datoj studiji

53 bear family story # godine izletnik je pojeden od strane medveda u Glacier Natl. Pk, Montana. Trebalo je naći medveda Ubistvo se desilo unutar područja radio-ogrlicom označene ženke grizlija, koja je imala i 2 dvogodišnja mečeta Uzeti su uzorci nadjene ženke i jednog mečeta, dlake i fecesa sa mesta ubistva nepoznato meče je nadjeno nakon par nedelja

54 Analiza mtdnk kontrolnog regiona (148 bp) pokazala je da svi uzorci odgovaraju vrsti medveda grizli- ženki. Za individualnu identifikaciju analizirano je 5 visoko varijabilnih mikrosatelitskih lokusa. Pojedini su se podudarali sa mečićima i ženkom. Verovatnoća je bila ubedljiva s obzirom da se u tom ekosistemu nalazi jedinki.

55 lokus uzorak G1A G10B G10C G1D G10L Dobijen PI AV za 3-5 lokusa je 1/2000-1/ ženka / / / / /155 meče / / / / /155 nepoznato meče H-14 dlaka S-37 feces S-34b feces S-3 feces 189/ / / / /155 NS 155/ / / / / / /110 NS NS 189/ / /110 NS 153/155 NS 155/155 NS 171/ /155

56 Testiranje srodstva knjiga, chpt 11. Prvi test srodstva je objavljen godine roditeljstvo, masovne nesreće, rekostrukcija nasleña i porekla... analiza roditeljstva zahteva više molekularnih markera nego identifikacija, preko 20..

57 Interpretacija dobijenog profila je složenija nego pri poreñenju profila sa mesta zločina i osumnjičenog mutacije izmeñu npr. oca i deteta mogu dovesti do lažnog isključivanja po nekom lokusu

58 Ako se ne može neko isključiti kao biološki roditelj, tada se mora odrediti vrednost koja odreñuje značajnost neisključivanja

59 Hipoteze su: H tužilaštva H 0 testirani je otac H H odbrane 1 testirani nije otac H 0/ H 1 = Indeks očinstva (Pi) Gd (genotip deteta), Gm (genotip majke), Gtm (genotip testiranog muškarca) Pi= Pr(GcƠGm,Gtm, H 0 ) / Pr(GcƠGm,Gtm, H 1 ) H 0 i H 1 zavise od mogućih genotipova ovih osoba i izvode se iz npr: aleli mogućeg oca aleli majke c d a a,c a,d b b,c b,d Ako je potenicjalni otac biološki otac verovatnoća je 0,25. Ako nije, onda majka prenosi alel verovantoćom 0,5 a šansa da je neki drugi muškarac otac zavisi od učestalosti datih alela u populaciji Pi= 0,25/0,5 p c p c je učestalost alela c u populaciji jer od toga zavisi verovatnoća da je potencijalni zaista otac

60 Kombinovani Pi se računa iz Pi za svaki lokus. Donosi se zaključak o pozitivnom očinstvu koji glasi, na primer: Rezultati DNK testiranja su takvi da je... xxxxxx... puta verovatnije da je testirani čovek biološki otac deteta nego da je to neki drugi čovek koji mu nije srodnik Knjiga, 11. poglavlje

61 Bayes teorema potrebna da se odredi verovatnoća očinstva pre dogadjaja E, postoje pred-verovatnoće uslova C i ne-c Pr (C) i Pr (ne-c). posle dogadjaja E, postoje post-verovatnoće uslova C i ne-c Pr(CƠE) i Pr(ne-CƠE) Odnos PRE i POST verovatnoće izražava kolika je verovatnoća E uz uslove C i -C: L=PrE C/PrE -C pred-verovatnoće očinstva, odredjene na osnovu subjektivnih, negenetičkih dokaza (npr. svedočenje majke Sa niskim indeksima očinstva Pi, uticaj pred-verovatnoća može biti značajan, ali sa analizama brojnih STR lokusa, Pi je visok. Knjiga, 110 str., Tabela 11.3

62 isključivanje očinstva na osnovu populacione učestalosti P E očekivana verovatnoća isključivanja roditelja ili, verovatnoća isključivanja slučajno odabranog ne-roditelja (Pr..random match probability) Pr=p i 2 + 2p i (1-p i ) 2 Pr E =Σp i2 (1-p) 2 + Σ2p i p j (1-p i -p j ) 2

63 računanje isključivanja očinstva majka potomstvo Isljučeni genotipovi oca Verovatnoća isključivanja A1A1 (p 1 2 ) A1A1 (p 1 ) A2A2 (p 2 2 ) p 1 3 p 2 2 A1A2 (p 2 ) A1A1 (p 1 2 ) p 1 4 p 2 A1A2 (2p 1 p 2 ) A1A1 (p 1 /2) A1A2 (1/2) A2A2 (p 2 /2) A2A2 (p 2 2 ) A1A2 (p 1 ) A2A2 (p 2 ) A2A2 (p 2 2 ) p 2 1 p A1A1 (p 2 1 ) p 3 1 p 2 2 A2A2 (p 2 2 ) p 1 p 4 2 A1A1 (p 12 ) p 12 p 3 2 Mogući genotipovi i verovatnoće na bialelnom kodominantnom lokusu za različite kombinacije majka-potomstvo, isključeni genotipovi oca i verovatnoće isključivanja Ukupna verovatnoća isključivanja očinstva za lokus k: Pr k = p 13 p 22 +p 14 p 2 +p 12 p 23 +p 13 p 22 +p 1 p 24 +p 12 p 23 = p 1 p 2 (1- p 1 p 2 ) Pr k =max, kada je p 1 =p 2, ako su razlike p 1 i p 2 velike, Pr k je malo, jer mnogo jedinki deli zajednički alel

64 Verovatnoća isključivanja se povećava: kada se uzme u analizu više lokusa kada se uzmu u analizu visoko varijabilni lokusi bear family story #2 majka grizli, 3 mečeta, potencijalni otac mikrosateliti, 8 lokusa otac 2 mečeta je isključen iz očinstva trećeg, ali ni jedan od 35 analiziranih medveda nije potvrdjen kao njegov otac!

65 forenzička genetika se bazira na stepenu statističke sigurnosti identifikacije pojedinačnog uzorka Dokaz se mora vrednovati uzimajući u obzir i hipotezu tužilaštva i odbrane Npr: imamo DNK profil od dva uzorka.. H tužilaštva profili su identični jer dolaze od iste jedinke H odbrane profili su slučajno identični