Analiza namirnica 49 HROMATOGRAFSKE METODE Princip hromatografije Sve hromatografske metode se svode na raspodeljivanje smeše komponenata između dve različite fizičke faze. Pod fizičkom fazom podrazumevamo deo prostora jasno omeđen međufaznom granicom od ostalog prostora. Zamislimo da se u čaši nalaze voda i hloroform dve tečnosti koje se ne mešaju. Hloroform će, kao gušći, obrazovati sloj na dnu čaše, a iznad njega će biti sloj vode. Između dva sloja postoji jasna međufazna granica. Dve faze na isti način predstavljaju led i voda ili voda i vazduh. Ako, na primer, u čašu stavimo jednake zapremine vode i hloroforma i u nju unesemo neku supstancu, ona će se između ove dve faze raspodeliti shodno rastvorljivosti u svakoj od njih. Tu pojavu opisuje Nernstov zakon raspodele: C C voda = hloroform Ako sada pažljivo pipetom odvojimo sloj vode i unesemo ga u drugu čašu u kojoj se nalazi jednaka količina čistog hloroforma, supstanca će, sledeći Nernstov zakon, iz vodenog sloja delimično preći u njega dok se ponovo ne zadovolji odnos koncentracija. Isto tako, ako u prvu čašu na postojeći sloj hloroforma dodamo istu količinu čiste vode, supstanca će iz hloroforma delimično preći u nju, opet dok se ne zadovolji gornji odnos koncentracija. Proširimo opisani eksperiment i zamislimo da preko kadice napunjene hloroformom ravnomerno struji tok vode. Ako se na početku neka supstanca koja se inače rastvara i u vodi i u hloroformu, nalazila samo u hloroformu, lako se može razumeti da će zbog istovremene rastvorljivosti u ova dva rastvarača, ona vremenom biti potpuno odnesena vodom. Nastavimo u istom duhu i zamislimo da su se u hloroformu na početku nalazile dve supstance A i B, koje se obe rastvaraju i u vodi i u hloroformu, ali se u vodi A rastvara mnogo bolje nego B. Može se pogoditi da će pri strujanju vode iznad hloroforma u kadici, komponenta A biti iz njega mnogo pre isprana vodom nego komponenta B. Ovaj jednostavan zamišljeni eksperiment ukazuje na dva ključna aspekta hromatografskih metoda: - Svaki hromatografski sistem sadrži dve faze jednu stacionarnu (nepokretnu) i drugu mobilnu (pokretnu). - Pri proticanju mobilne faze preko stacionarne, u hromatografskom sistemu se duže zadržavaju supstance koje imaju veći afinitet prema stacionarnoj fazi. Shodno ovome, kada s mobilnom fazom u hromatografski sistem istovremeno unesemo više komponenata u obliku smeše (uzorak), one će iz njega izlaziti posle različitog vremena, u zavisnosti od svojih relativnih afiniteta prema stacionarnoj, odnosno mobilnoj fazi. To je ilustrovano sledećim šemama: K
Analiza namirnica 50 Dve faze miruju jedna iznad druge. Komponente A, B i C se različito rastvaraju u svakoj od njih. Faza I i Faza II na prvoj slici se međusobno ne mešaju. Supstance A, B i C se u različitom stepenu rastvaraju u dve faze, tako da njihovi koeficijenti raspodele između faza I i II [K i =(C i ) I /(C i ) II ] stoje u sledećem odnosu: K A >K B >K C Od tri komponente, u Fazi I je najrastvorljivija komponta A, a u Fazi II komponenta C. Komponenta B se u obe faze rastvara približno jednako. Faza I (mobilna) teče u smeru strelice preko faze II (stacionarne). Komponente A, B i C se pri tome razdvajaju. Na drugoj slici je Faza II nepomična (stacionarna), dok se Faza I (mobilna) kreće preko nje u smeru strelice. Može se zamisliti da se komponente A, B i C kreću s Fazom I (slikovito: kotrljaju) brzinom koja je proporcionalna njihovoj rastvorljivosti u toj fazi. Najbrže se kreće komponenta A, a najsporije komponenta C ona je najviše "zaglibljena" u nepomičnu Fazu II. Zbog toga komponente u smeru sleva udesno putuju različitim brzinama razdvajaju se, i na kraju stacionarne faze izlaze pojedinačno. Ovo je princip svih hromatografskih metoda razdvajanja, a razlike u tehnikama postoje zbog različitih sila kojima dve faze (stacionarna i mobilna) "privlače" komponente. Klasifikacija hromatografskih metoda Shodno agregatnom stanju primenjenih faza, sve hromatografske tehnike se mogu podeliti u četiri grupe. Tako imamo:
1. Čvrsto-gasnu hromatografiju 2. Čvrsto-tečnu hromatografiju 3. Gasno-tečnu hromatografiju 4. Tečno-tečnu hromatografiju Analiza namirnica 51 Povod za neke drugačije klasifikacije mogu biti i sami mehanizmi na osnovu kojih se komponente smeše iz uzorka raspodeljuju između dve faze u kontaktu: - Adsorpcija. Pojam podrazumeva koncentrisanje supstanci na graničnoj površini dveju faza. Najčešće je jedna faza čvrsta, pa se pod adsorpcijom uobičajeno podrazumeva koncentrisanje komponenata iz rastvora (tečne faze) ili iz smeše gasova (gasne faze) na čvrstoj površini. Stoga se čvrsto-tečna i čvrsto-gasna hromatografija nazivaju i adsorpcionom hromatografijom. Pri adsorpciji postoji konstantan odnos između koncentracije supstance u gasnoj ili tečnoj fazi i na površini adsorbenta, određen adsorpcionom izotermom. - Rastvorljivost. Raspodela komponenata uzorka između dve tečne faze se vrši prema njihovoj rastvorljivosti u tim fazama. Odnos koncentracija komponente u dve faze određen je Nernstovim zakonom raspodele. Fenomen se tiče uglavnom tečnotečne hromatografije. - Isparljivost. Raspodela komponenata izmeću tečne i gasovite faze određena je, s jedne strane, rastvorljivošću u tečnoj fazi, a s druge, njihovom isparljivošću. Isparljivost komponenata zavisi od njihovog napona pare i aktivnosti. Pojava je karakteristična za gasno-tečnu hromatografiju. - Jonska izmena. Između jona u rastvoru i jonogenih grupa na površini čvrste faze uspostavlja se jonska ravnoteža prema zakonu o dejstvu masa. Fenomen se iskorišćava kod jonoizmenjivačke hromatografije koja spada u klasu tečno-čvrstih hromatografskih metoda. - Gel-filtracija. Raspodela komponenata smeše između tečne i čvrste faze ne vrši se prema afinitetu, već prema veličini molekula komponenata. Čvrsta faza predstavlja granulisan porozan materijal čije pore imaju širinu blisku veličini molekula komponenata. Većim molekulima pore će biti manje dostupne, a manji će u njih lako ulaziti, pa će se shodno tome molekuli različitih veličina zadržavati različito vreme u sistemu. Pojava strogo ne spada u hromatografiju (nema raspodele između dve faze), već se koristi efekat različite veličine "mrtve zapremine" sistema za molekule različite veličine, zbog čega im se vremena zadržavanja razlikuju. Ipak, gel-filtracija se uvek razmatra uporedo s hromatografskim metodama jer se tehnički izvode na sličan način. Hromatografske metode mogu se realizovati na različite tehničke načine i obratno slična tehnika može se koristiti za izvođenje različitih hromatografskih metoda. Stoga se u praksi često vrši klasifikacija prema tehnikama. Najpoznatije tehnike hromatografije su: 1. Hromatografija na papiru (engl. PC - paper chromatography) Raspodela obuhvata adsorpciju komponenata iz rastvora na površini listova celuloznog papira.
Analiza namirnica 52 2. Tankoslojna hromatografija (engl. TLC - thin layer chromatography) Čvrsta faza je praškasti adsorbent, imobilizovan na ravnoj ploči od inertnog materijala. Raspodela komponenata vrši se adsorpcionim mehanizmom između rastvora i adsorbenta. 3. Hromatografija na stubu (engl. CC - column chromatography) Čvrsti, praškasti adsorbent spakovan je u vertikalnu kolonu kroz koju se propušta tečna, mobilna faza. Na isti način se izvode i jonoizmenjivačka, odnosno gelhromatografija. 4. Hromatografija na invertovanoj fazi (engl. IPC - inverted phase chromatography) Izvedba je kao kod TLC i CC, osim što je na adsorbent nanesena tečna stacionarna faza, tako da se raspodela vrši između nje i mobilne faze. Naneta tečna faza menja (invertuje) polarnost adsorbenta. 5. Tečna hromatografija (engl. LC - liquid chromatography) Pojam uključuje sve tečno-tečne i tečno-čvrste hromatografske metode, koje se izvode na koloni. Takođe i jonoizmenjivačku i gel-hromatografiju. 6. Tečna hromatografija visoke moći razlaganja (engl. HPLC - high performance liquid chromatography) ili tečna hromatografija pod visokim pritiskom (engl. HPLC - high pressure liquid chromatography). Pojam obuhvata tehnike tečne hromatografije u posebnom aparativnom izvođenju koje omogućuje izuzetnu kontrolu procesa i razdvajanje komponenata. 7. Gasna ili gasno-tečna hromatografija (engl. GC - gas chromatography ili GLC - gas-liquid chromatography) Kontaktiranje gasne i tečne ili čvrste faze ostvaruje se u specijalnim dugačkim kolonama, ispunjenim stacionarnom fazom u praškastom obliku, sa ili bez nanete tečne faze, u posebnim uređajima. 8. Kapilarna gasna hromatografija (engl. Capillary GC) Stacionarna tečna faza nije naneta na čvrsti adsorbent, već na unutarnji zid uske, veoma duge kapilare, kroz koju protiče gasna faza. Koristi se u uređajima za GLC.
Analiza namirnica 53 ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA U ovaj odeljak spadaju tehnike hromatografije na papiru, tankom sloju i stubu adsorbenta, pa ih je, zbog sličnosti mehanizma separacije, pogodno razmatrati zajedno. Istorijski posmatrano, hromatografija je kao metoda separacije i uvedena baš kao adsorpciona hromatografija. Davne 1903. g., ruski naučnik M.S. Cvet uspeo je da razdvoji smešu biljnih pigmenata na stubu adsorbenta spirajući ih rastvaračem, pri čemu su se pojedinačni pigmenti raspodeljivali duž stuba adsorbenta u obliku obojenih prstenova. Takav preparat Cvet je nazvao "hromatogramom", a metodu "hromatografijom" (pisanje bojom). Za sve adsorpcione tehnike zajedničko je postojanje čvrste stacionarne faze adsorbenta, od čijih osobina zavisi mogućnost i kvalitet razdvajanja komponenata. Adsorpcione sile Kod neutralnih atoma se centar pozitivnog i centar negativnog naelektrisanja poklapaju, pa se atom u odnosu na okolinu ponaša kao nenaelektrisana čestica. Kad se atom, međutim, unese u električno polje, pomenuti centri naelektrisanja se razdvajaju i atom se polarizuje postajući električni dipol. Pri tome, stvaranje i orijentisanje dipola slabi spoljno električno polje što je atom polarizabilniji, slabljenje je veće. Sposobnost većeg ili manjeg polarizovanja atoma (stvaranja dipola) u spoljnom električnom polju iskazuje se dielektričnom konstantnom materijala. Ulogu spoljnog električnog polja koje izaziva polarizaciju atoma često vrše susedni atomi unutar hemijskih jedinjenja. Jedan od dva učesnika u tzv. kovalentnoj vezi obično jače privlači zajednički elektronski par, tako da je sama veza polarizovana predstavlja električni dipol. U graničnom slučaju veoma jake polarizacije veze, elektronski par u potpunosti prelazi na jedan od dva atoma i kovalentna veza degradira u jonsku. Molekul može sadržati više polarizovanih i nepolarizovanih veza čiji se električni dipoli (ako postoje) vektorski sabiraju. Ako je zbir različit od nule, tada i molekul u celini poseduje stalni električni dipol. Na primer, polarizovane su veze H O i C Cl jer atomi kiseonika, odnosno hlora, koji su elektronegativniji od vodonika, odnosno ugljenika, jače privlače elektronski par. Sa slike 2 vidi se da će molekul vode zbog toga imati stalan dipol, ali molekul ugljentetrahlorida neće. Slika 2
Analiza namirnica 54 Na sličan način se razmatra polarnost i pojedinih funkcionalnih grupa od kojih su izgrađeni molekuli, što u velikoj meri može da pomogne pri razmatranju mogućnosti razdvajanja pojedinih komponenata složene smeše. Na slici 3 prikazan je redosled polarnosti nekih funkcionalnih grupa. -OCH3 < -NO2 < -N(CH3)2 < -COCH3 < -NH2 < -OH < -CONH2 < -COOH Slika 3. Polarnost funkcionalnih grupa raste s leva u desno Treba naglasiti da su redosledi polarnosti funkcionalnih grupa koji se često citiraju u literaturi samo približni jer i ostatak molekula može imati znatnog uticaja na polarnost. Tako, na primer, u homologom nizu alifatičnih alkohola ili kiselina polarnost molekula opada sa dužinom ugljovodoničnog lanca. Zbog opšte težnje sistema ka elektroneutralnosti, između polarnih molekula deluju relativno jake privlačne sile molekuli se tako orijentišu da im se električni dipoli poništavaju. Tečnosti s polarnim molekulima obično su u znatnoj meri asosovane njihovi molekuli čine veće ili manje grupacije uzajamno orijentisanih dipola, pa su tačke ključanja takvih tečnosti obično visoke. Kada se polarni molekul nađe u blizini nepolarnog, on svojim električnim dipolom može da u nepolarnom molekulu indukuje privremeni električni dipol. Zbog toga će se između njih javiti privlačne sile koje su ipak znatno slabije od sila između dva molekula sa stalnim dipolima. Slabe privlačne sile će se javiti čak i između dva bliska nepolarna molekula, usled privremenog uspostavljanja dipola. Pojava se objašnjava činjenicom da elektroni pri svom kruženju oko jezgra nisu u svakom trenutku simetrično raspoređeni, pa je ukupna nepolarnost atoma samo statistički prosek. Dakle, iako molekul nema stalan dipol, poremećaji njegovog električnog polja mogu indukovati iste takve poremećaje polja u susednom molekulu, tako da se uspostavlja slabo privlačenje između dva privremena dipola. Kada se razmatraju sile, pomoću kojih se molekuli neke supstance vezuju za površinu čvrste stacionarne faze, svi pomenuti fenomeni su zastupljeni, pa ipak, obično ne svi istovremeno. Redosled jačine ovih sila je sledeći: - Vandervalsovske sile (Londonove disperzione sile). Njima se ostvaruje upravo opisana interakcija između nepolarnih molekula adsorbata i nepolarne površine adsorbenta. Energija veze je mala, pa se veze lako raskidaju. Takva, fizička adsorpcija poželjna je u hromatografiji, jer se komponente lako razdvajaju, a koncentracione zone su dobro definisane. - Indukcione sile. Molekuli adsorbata su polarni i indukuju električne dipole u molekulima površine adsorbenta. Energija adsorpcije je viša nego u prethodnom slučaju. - Vodonične veze. Kada se u molekulima adsorbenta i adsorbata nalaze grupe koje mogu da izmenjuju proton, na primer, hidroksilne, karboksilne ili amino-grupe, tada
Analiza namirnica 55 se između njih uspostavljaju vodonični mostovi koji pojačavaju efekat ostalih sila. Znatan broj adsorbenata ima hidroksilne grupe na površini, tako da je ovakva veza često zastupljena. - Kovalentne veze. Ukoliko su molekuli i adsorbata i adsorbenta veoma polarni, što znači da su sastavljeni od atoma čija je razlika u elektronegativnosti velika, može doći do obrazovanja prave kovalentne veze na površini adsorbenta. Energija adsorpcije je visoka i odgovara energiji uspostavljanja kovalentne hemijske veze. U hromatografiji je ova pojava, osim u specifičnim slučajevima, nepoželjna, jer se supstance često adsorbuju nepovratno. U blažim slučajevima, one se mogu eluirati - sprati sa adsorbenta polarnim mobilnim fazama, pri čemu se obrazuju veoma razvučene, asimetrične koncentracione zone s dugim "repovima", nepogodne za kvantitativan rad. Adsorbenti Budući da se kod adsorpcione hromatografije raspodela komponenata uzorka vrši između mobilne faze i površine adsorbenta, ova kontaktna površina mora biti dovoljno velika da bi sistem bio efikasan. Stoga se za adsorbente koriste porozan čvrsti materijali u obliku sitnih granula ili praha, čija specifična površina obično prevazilazi 50 m 2 /g, a ponekad i 1000 m 2 /g. Ovako velika površina kontakta ostvaruje se veoma razuđenim sistemom pora unutar pojedinih čestica adsorbenta. Da bi ona bila dostupna mobilnoj fazi, prečnik čestica adsorbenta treba da je što manji i na ovo rešenje se ide u tehnici tankoslojne hromatografije. Međutim, kod hromatografije na stubu čestice ne smeju da budu previše sitne jer takav sloj pruža visok otpor proticanju mobilne faze. Tipične vrednosti veličine čestica za stubnu hromatografiju kreću se u intervalu od 50 do 200 μm. Adsorpcija komponenata smeše se ne vrši na celoj površini adsorbenta, već na pojedinim njenim mestima - aktivnim centrima, čija priroda zavisi od para adsorbent - adsorbat. Na primer, supstance sa slobodnom karboksilnom grupom vezivaće se za bazne centre. Stoga podatak o specifičnoj površini mora biti dopunjen i podatkom o aktivnosti broju aktivnih centara po jedinici površine. Tipične vrednosti aktivnosti iznose od 4 do 6 centara po 1 nm 2. U Tabeli 1 prikazano je nekoliko adsorbenata, redosledom rastuće aktivnosti. Tabela 1. Redosled aktivnosti pojedinih adsorbenata Adsorbent Saharoza Skrob Dijatomit Silicijumdioksid Magnezijumsilikat Aluminijumoksid Magnezijumoksid Aktivni ugalj Jonoizmenjivačke smole Priroda aktivnih centara neutralna neutralna neutralna kisela kisela kisela i bazna bazna neutralna i kisela kisela i bazna
Analiza namirnica 56 Aktivnost adsorbenta može se uglavnom regulisati količinom vode, koju on sadrži. Pokažimo ovo na primeru silikagela tipičnog adsorbenta. Površina silikagela koji je vazdušno osušen (amorfnog silicijumdioksida), prekrivena je fizički adsorbovanom vodom. Pri postepenom zagrevanju do 150-200 0 C deo te vode se udaljava, ostavljajući za sobom hidroksilne grupe kao kisele centre (slika 4). Slika 4 Hidroksilne grupe su polarne, a istovremeno su i donori protona, tako da se na površini prvenstveno adsorbuju polarna i bazna jedinjenja. Tokom daljeg zagrevanju silikagela u temperaturnom intervalu od 200 do 400 0 C, sve više susednih hidroksilnih grupa međusobno reaguju (slika 5) obrazujući siloksanske grupe, zbog čega površina gubi aktivnost. Slika 5 Razmišljanje ove vrste može se primeniti na većinu adsorbenata, koji imaju mogućnost ostvarivanja vodoničnih veza. Pri izboru adsorbenta za određeni sistem, neophodno je voditi računa o prirodi aktivnih centara. Naime, adsobenti s veoma jakim kiselim ili baznim centrima mogu hemijski reagovati s komponentama smeše ili ispoljiti prema njima katalitičko dejstvo, što dovodi do hidrolize, izomerizacije, kondenzacije i drugih neželjenih pratećih reakcija u sistemu. Takvo dejstvo adsorbenta se takođe može regulisati količinom prisutne vode ili i drugih supstanci koje prvenstveno blokiraju najaktivnije centre. Osobina adsorbenta koja u praksi ima najveći značaj jeste njegova selektivnost pri adsorbovanju različitih jedinjenja jer je to i osnov za hromatografsko razdvajanje. Pri tome, danas još uvek ne postoji jedinstveno teorijsko znanje na osnovu koga bi se u svakom pojedinačnom slučaju, prema hemijskoj strukturi jedinjenja mogao odabrati optimalan adsorbent, ali postoji izuzetno obiman eksperimentalni materijal koji praktično omogućava svaki izbor. Osnovno pravilo u izboru adsorbenta proizilazi iz razmatranja prirode međumolekulskih sila koje učestvuju u adsorpciji: polarne supstance će se dobro razdvajati na polarnim adsorbentima, a nepolarne na nepolarnim. Ako neku supstancu mnogo jače privlači mobilna faza nego adsorbent, ona se uopšte neće
Analiza namirnica 57 adsorbovati. U obrnutom slučaju, ona će se za adsorbent vezati hemijski. Za postizanje hromatografskog razdvajanja nije dobro ni jedno ni drugo potrebno je pronaći neku sredinu izmeću ova dva granična slučaja. Tako, na primer, za smeše polarnih jedinjenja: alkohola, estara itd., koristićemo polarni adsorbent: silikagel ili alumijumoksid, a za razdvajanje nepolarnih alifatičnih ugljovodonika, aktivni ugalj. Pri tome treba imati u vidu mogućnost nepovratne hemisorpcije jakih kiselina na baznim adsorbentima i obratno, jakih baza na kiselim adsorbentima. Stoga ćemo smešu kiselina razdvajati na kiselom adsorbentu silikagelu, a smešu baza na onom koji poseduje bazne centre, možda na aluminijumoksidu. Treba naglasiti da su polarni adsorbenti primenljivi i za razdvajanje jedinjenja s dvostrukim i trostrukim vezama, budući da se π-veza lako polarizuje. Za specifične potrebe površina adsorbenta se može modifikovati različitim dodacima. Na primer, nezasićeni ugljovodonici se mogu razdvojiti od odgovarajućih zasićenih uglovodonika eluiranjem sa silikagela, impregniranog srebro-nitratom. Srebro-nitrat gradi komplekse s dvostrukom i trostrukom vezom nezasićenih jedinjenja i na taj način povećava njihovo vreme zadržavanja u sistemu. U Tabeli 2 navedeno je nekoliko takvih modifikatora. Tabela 2. Neki načini modifikovanja adsorbenata Modifikator Jedinjenja koja se selektivno adsorbuju 0,1-0,5 n kiselina ili baza jedinjenja, osetljiva na promenu ph srebro-nitrat olefini i acetileni borna kiselina, natrijum-borat polihidroksilna jedinjenja pikrinska kiselina policiklični aromatski ugljovodonici natrijum-bisulfit aldehidi bakar-sulfat amini Osim pobrojanih osobina, komercijalni adsorbenti za primenu u adsorpcionoj hromatografiji moraju posedovati standardizovana svojstva da bi se rezultati pojedinih eksperimenata i laboratorija mogli porediti. S obzirom na više osetljivih, nedovoljno poznatih osobina adsorbenta koje u proizvodnji treba nepogrešivo reprodukovati, to nije lako izvesti, ali u današnje vreme, mnoge poznate svetske firme bave se ovim problemom, tako da analitičar uglavnom može računati na gotove, standardne adsorbente. Pregled važnijih adsorbenata Silikagel Adsorbenti opšte formule SiO 2.xH 2 O nazivaju se: silikagel, silicijumdioksid, silicijumova kiselina, kizelgur. Silikagel nastaje taloženjem iz rastvora alkalnih silikata ili hidrolizom silicijumovih jedinjenja. Dobija se u obliku gela koji sušenjem daje amorfan, porozan, delimično hidratisan materijal. Promenom uslova obrazovanja gela (na primer, promenom ph pri taloženju), dobijaju se čestice različite strukture, specifične površine od 200 do 800 m 2 /g, i prečnika pora od 10-25 nm.
Analiza namirnica 58 Zbog mogućnosti regulacije aktivnosti preko sadržaja vode i lake dostupnosti, silikagel je veoma zastupljen u hromatografskoj praksi. Polarnost, kiselost (ph površine 3-5) i prisustvo hidroksilnih grupa na površini omogućuju mu široku primenu za razdvajanje nezasićenih, aromatičnih i uopšte, polarnih jedinjenja. Zbog prisustva kiselih centara, bazne supstance se na njemu snažno adsorbuju, ponekad nepovratno. Budući da je polarnog karaktera, pokazuje slabu adsorpciju i selektivnost prema nepolarnim supstancama. S njega se one prve eluiraju. Posebnu klasu silicijumdioksidnih adsorbenata čini dijatomit ili infuzorijska zemlja mineral, nastao od fosilnih skeleta jednoćelijskih praživotinja infuzorija, dijatomea. Adsorpciona sposobnost dijatomita je niska i on se uglavnom ne koristi kao adsorbent, već kao pomoćno filtraciono sredstvo. Ponekada se koristi kao nosač stacionarne tečne faze u tečno-tečnoj ili gasno-tečnoj hromatografiji. Aluminijumoksid Ovaj adsorbent se pored silikagela najčešće koristi u adsorpcionoj hromatografiji. I on je polarne prirode, a red eluiranja supstanci s njega isti je kao kod silikagela. Aktivira se zagrevanjem do 400 0 C. Tipična specifična površina mu je 100-200 m 2 /g, a tipična veličina pora 3 nm. U odnosu na silikagel, aluminijumoksid pokazuje i važne razlike: - Jedinjenja sa nezasićenim vezama na aluminijumoksidu se adsorbuju nešto jače, pa se i bolje razdvajaju. Stoga je ovo preporučeni adsorbent za aromatične ugljovodonike. - Zbog prisustva kiselih, ali i jako baznih centara, jake kiseline se na njemu ne mogu razdvajati jer se hemisorbuju. Slabe kiseline se mogu razdvajati, naročito ako je mobilna faza bazna. Primena aktiviranog aluminijumoksida za mnoge svrhe je isključena, zbog katalitičkog podsticanja različitih neželjenih reakcija. Osim silikagela i aluminijumoksida, kao adsorbenti se koriste i: magnezijumsilikat (najpoznatiji komercijalni preparat je Florisil), kod koga se broj kiselih centara na površini lako može regulisati dodatkom vode, zatim bazni i polarni magnezijumoksid, slabi adsorbenti šećeri, skrob i celuloza, nepolarni adsorbenti aktivni ugljevi, kisele i bazne jonoizmenjivačke smole. Mobilna faza Pri razmatranju selektivnosti adsorbenata ne treba zaboraviti ni prirodu mobilne faze jer ona je drugi učesnik u međufaznoj separaciji i treba da zadovolji neke osnovne kriterijume. Ona treba da dobro rastvara sve komponente uzorka, da se sama minimalno adsorbuje na stacionarnoj fazi i ne sme da reaguje hemijski ni sa stacionarnom fazom, ni s komponentama uzorka. Pored toga, pogodno je da ima nizak viskozitet pod primenjenim uslovima kako bi uz što manji otpor prolazila kroz sloj adsorbenta, čime se vreme analize značajno skraćuje. Uslov rastvorljivosti komponenata uzorka treba razmatrati u smislu starog alhemijskog pravila "slično se u sličnom rastvara". Kako treba razumeti "sličnost"? Ako se pri mešanju dve komponente ostvaruju veze slične jačine ili čak jače međumolekulske veze od veza koje su vladale unutar svake od dve čiste
Analiza namirnica 59 komponente, one će se međusobno dobro rastvarati. Primer je sistem voda (polarna) etanol (polaran). Ako bi se, s druge strane, pri mešanju dve komponente između njihovih molekula ostvarivale slabije veze, nego u čistim komponentama, tada bi do takvog mešanja moglo doći tek uz dovođenje dodatne energije. Komponente se spontano ne mešaju, na primer: pentan (nepolaran) voda (polarna). Konačno, dva nepolarna jedinjenja: pentan i ugljentetrahlorid, lako se mešaju jer se obrazuju relativno slabe nove veze na račun raskidanja takođe relativno slabih veza. Odavde sledi jednostavno pravilo: dobro se međusobno rastvaraju smeše polarnih supstanci i smeše nepolarnih supstanci. Smeše polarnih i nepolarnih supstanci se međusobno samo ograničeno rastvaraju. U hromatografiji se često primenjuje eluiranje (spiranje) uzorka s kolone uzastopnim nizom rastvarača sve veće desorpcione moći (sve veće polarnosti), pri čemu se jedna po jedna komponenta desorbuje, redosledom rastuće jačine adsorpcije. U vezi s tim, veoma je ilustrativan tzv. eluotropni niz rastvarača (Tabela 3), niz u kome su rastvarači uređeni po opadajućoj sposobnosti desorpcije komponenata s polarnog adsorbenta. Ovo je približno i redosled kojim se smanjuje polarnost rastvarača, o čemu svedoči i gotovo identično opadanje njihove dielektrične konstante, kao i podatak o rastvorljivosti u vodi. Za nepolarne adsorbente, eluotropni niz je obrnut. Tabela 3. Elutropni niz rastvarača Rastvarač Dielektrična konstanta Rastvorljivost u vodi (g/100 g) Voda 81,0 Metanol 31,2 Etanol 25,8 n-propanol 22,8 Aceton 21,5 Dihloretan 10,4 0,7-0,9 Etilacetat 6,1 8,5 Amilacetat - slabo rastvoran Dietiletar 4,4 7,5 Dioksan - Hloroform 5,2 0,82 Metilenhlorid - 2 Benzol 2,3 0,082 Toluol 2,3 0,05 Trihloretilen 3,4 0,1 Ugljentetrahlorid 2,2 0,097 Cikloheksan 2,0 nerastvoran Petroletar 1,9 nerastvoran Pri izboru mobilne faze, njena polarnost se podešava prema polarnosti i adsorbenta i adsorbujućih supstanci. Da bi se komponente uzorka uopšte našle u mobilnoj fazi, ona mora da ih rastvara, a da bi se s njom kroz sistem i kretale, njena polarnost mora biti konkurentna polarnosti adsorbenta. Na primer, smeša organskih kiselina neće se
Analiza namirnica 60 uopšte eluirati sa silikagela nepolarnim heksanom. S druge strane, veoma polarna mobilna faza - dietiletar, eluiraće sve komponente praktično istom brzinom - neselektivno. Potrebno je, dakle, naći takvu smešu heksana i dietiletra da polarnost mobilne faze približno odgovara polarnosti silikagela. Polarnost mobilne faze se, baš kao u ovom primeru, reguliše mešanjem rastvarača različite polarnosti, pri čemu broj komponenata može biti i 4-5. Pri tome, međutim, treba paziti da ne dođe do raslojavanja unutar mobilne faze.
Analiza namirnica 61 HROMATOGRAFIJA NA STUBU (KOLONI) Tradicionalne tehnike Kolona (slika 1) predstavlja vertikalnu staklenu ili plastičnu cev koja na donjem kraju može da ima slavinu. Pri dnu je disk od poroznog stakla ili čep od staklene vune, čija je svrha da nosi sloj adsorbenta. Kolona može imati dvostruki zid kroz koji protiče voda određene konstantne temperature. Slika 1 Kolona za klasičnu stubnu hromatografiju Kolona se puni određenom količinom stacionarne faze, na nju se nanosi uzorak i tada kontrolisanim protokom dodaje mobilna faza koja se niz stub adsorbenta kreće pod dejstvom gravitacije. Efluent iz kolone se prikuplja u posebne sudove. Kolona za stubnu hromatografiju obično je prečnika 2-70 mm, a dužine 15-150 cm. Pošto mobilna faza kroz kolonu teče pod dejstvom gravitacije, razdvajanje traje dugo, što je i glavna mana ovakvog tipa hromatografije na stubu. S druge strane, skraćivanje stuba ubrzava proces, ali snižava kvalitet separacije komponente iz kolone izlaze nedovoljno razdvojene. Moderne tehnike (HPLC - hromatografija visoke moći razlaganja) Sistem HPLC u načelu se sastoji od pumpe visokog pritiska (i do 350 bara), koja obezbeđuje stabilan, visok protok mobilne faze, zatim kolone, injektora ili ventila za unos uzorka u kolonu i detektora (slika 2) sa uređajem za registrovanje rezultata.
Analiza namirnica 62 Slika 2 Šematski prikaz HPLC sistema Dodatnu opremu može činiti filter za rastvarač, stabilizator pulsacija pumpe, monitor pritiska, alarm previsokog pritiska, predkolona za zaštitu analitičke kolone od zagađenja nečistim uzorcima i kolektor frakcija. Da bi se skratilo vreme zadržavanja uzorka, odnosno njegovih komponenata u sistemu i time predupredilo difuziono širenje koncentracionih zona, ceo uređaj je izveden od uskih, kapilarnih vodova, tako da je mrtva zapremina sistema svedena na minimum. Uređaj je automatizovan, a temperatura, sastav mobilne faze, njen protok i drugi parametri strogo se kontrolišu. Efluent iz kolone se analizira kontinuirano. Često uređaju pripada sopstveni računar za programiranje procesa i obradu podataka. Aparatura za izvođenje HPLC je skupa, ali omogućuje veoma preciznu kontrolu radnih uslova. Zbog upotrebe visokog pritiska i shodno tome viših protoka mobilne faze, mogu se koristiti odnosi dužine i prečnika kolone od 100:1 do 1000:1, pri čemu je prečnik obično 2-3 mm, uz dužine od 50-100 cm. Ovde se, takođe, može koristiti adsorbent znatno manje veličine čestica: 5-15 μm, u odnosu na raspon od 50-250 μm kod klasičnih tehnika. Stoga je efikasnost razdvajanja ovakvih sistema veoma visoka. Detekcija komponenata Kod klasičnih tehnika, eluent se sakuplja u porcijama u kojima se naknadno analiziraju pojedine komponente specifičnim ili nespecifičnim metodama. Kod HPLC se koncentracija komponenata prati kontinualno u struji mobilne faze, uz korišćenje mnogih poznatih instrumentalnih, kao i nekih specifičnih metoda. 1. Detektor indeksa refrakcije Ovo je diferencijalni detektor, jer prati razliku indeksa refrakcije mobilne faze pre ulaska i posle izlaska is kolone. Spada u univerzalne detektore. Osetljivost mu je oko 10 μg komponente po ml efluenta. 2. UV-apsorpcioni detektori Ovi detektori mogu raditi pri različitim talasnim dužinama, ali se najviše koristi talasna dužina od 254 nm, koju emituje živina lampa niskog pritiska. Detektor je selektivan, tj.
Analiza namirnica 63 ograničen na detekciju onih supstanci koje apsorbuju ili fluoresciraju u ovoj oblasti spektra. Može se detektovati do 1 ng supstance. Oba opisana detektora značajna su za praćenje neobojenih supstanci. 3. Kolorimetrijski detektori Prati se apsorpcija vidljivog zračenja, bilo u originalnim, bilo u derivatiziranim komponentama uzorka. U drugom slučaju, u struju efluenta se kontinualno dozira reagens za obrazovanje boje, pri čemu se mora dopustiti da supstance tokom određenog vremena izreaguju, što produžava vreme analize i doprinosi širenju koncentracionih zona. 4. Konduktometrijski detektor Funkcioniše na principu praćenja električne provodljivosti efluenta. Primenjuje se, uglavnom, kod mobilnih faza, koje sadrže vodu. Granica detekcije je oko 10 μg. 5. Plameno-jonizacioni detektor s pokretnom žicom Kroz efluent na izlazu iz kolone stalno se provlači beskonačna žica koja se zatim suši od rastvarača i unosi u plameno-jonizacioni detektor, gde sagorevaju komponente koje su na njoj zaostale. (Plameno-jonizacioni detektor će biti detaljnije opisan kod gasne hromatografije). Osetljivost mu je 1-4 μg/ml, uz kvantitativan, linearan odgovor. 6. Detektor radioaktivnosti Metoda se primenjuje u slučajevima razdvajanja prirodnih ili veštačkih radioaktivnih supstanci. Primer klasičnog razdvajanja Prema originalnom članku: Johnston, J.J., Ghanbari, H.A., Wheeler, W.B., Kirk, J.R. 1983. Characterization of Shrimp Lipids. J. Food Sci., 48, 33. Razdvajanje lipida na klase neutralnih, gliko- i fosfolipida 20 g Silikagela 60 (70-230 meša) suspenduje se u hloroformu i izruči u staklenu kolonu (1,5 x 20 cm). Na gornji sloj pakovanog silikagela postavi se sloj od 1 cm anhidrovanog natrijumsulfata. Na kolonu se nanosi do 1 g lipida, kao rastvor u 1 ml hloroforma. Lipidi se eluiraju sukcesivno sa po 400 ml hloroforma (neutralni lipidi), acetona (glikolipidi) i metanola (fosfolipidi). Svaka od tri eluirane frakcije upari se pod sniženim pritiskom, pri 30 0 C, do zapremine od oko 10 ml, zatim prebaci u tariranu posudu i ostatak rastvarača otpari u struji suvog azota, pri 35 0 C. Konačno se frakcije osuše do konstantne mase u eksikatoru nad CaSO4.
Analiza namirnica 64 Napomena: Neutralnim lipidima bi pre odgovarao naziv "umereno polarni lipidi", za razliku od veoma polarnih gliko- i fosfolipida, koji sadrže polarne šećere i fosfatne grupe. U neutralne lipide spadaju: ugljovodonici, holesterol i holesterilestri, mono-, dii trigliceridi i slobodne masne kiseline. Razdvajanje frakcije neutralnih lipida na pojedine klase Oko 300 mg neutralnih lipida, rastvorenih u 1 ml heksana, nanosi se na kolonu (1,5 x 30 cm), pakovanu sa 25 g Florisila (100-200 meša), pre upotrebe aktiviranog pri 260 0 C, tokom 8 sati i tada hidratisanog sa 7% vode (w/w). Neutralni lipidi se frakcionišu eluiranjem rastvaračima, uzastopno rastuće polarnosti (Tabela 1), pri čemu se prikupljaju frakcije po 7 ml. Lipidni sadržaj svake frakcije određuje se gravimetrijski, po uparavanju rastvarača i sušenju. Čistoća i identitet svake frakcije proveravaju se tankoslojnom hromatografijom, uz standarde. Tabela 1 (uz Primer) Frakcija Zapremina eluenta (ml) Eluent Ugljovodonici 60 heksan Holesterilestri 80 5% etra u heksanu Trigliceridi 120 15% etra u heksanu Holesterol 100 25% etra u heksanu Digliceridi 100 50% etra u heksanu Monogliceridi 100 2% metanola u etru Slobodne masne kiseline 150 4% sirćetne kiseline u etru Razdvajanje frakcije fosfolipida na pojedine klase Kolona (2 x 40 cm) spakuje se hloroformskom suspenzijom Silikagela 60 (70-230 meša), aktiviranog i hidratisanog sa 7% vode. Kolona se prvo ispere sa 200 ml metanola, a potom sa 200 ml hloroforma. Na vrh kolone uspe se sloj od 1 cm anhidrovanog natrijumsulfata, a potom unese uzorak od oko 500 mg fosfolipida u 1 ml hloroforma. Eluiranje se vrši sa: 400 ml 15% metanola u hloroformu (v/v), pri čemu se skupljaju frakcije po 15 ml u tarirane posude, a zatim, jedno za drugim, sa 400 ml 35% metanola u hloroformu i 400 ml metanola. Ove dve frakcije od po 400 ml upare se na oko 10 ml metanola i kvantitativno prenesu u tarirane posude. Po uparavanju i sušenju, sadržaj lipida se određuje gravimetrijski. Identitet se potvrđuje tankoslojnom hromatografijom, uz standarde. Opisanom procedurom, autori su u lipidima škampa našli sledeće fosfolipide: sfingomijelin, fosfatidilserin, fosfatidilholin i fosfatidiletanolamin.
Analiza namirnica 65 HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC) Jedna od adsorpcionih hromatografskih tehnika hromatografija na listovima celuloznog papira je zahvaljujući svojoj jednostavnosti našla veoma široku primenu u istraživačkom radu, pa ipak, upotreba isključivo celuloze kao stacionarne faze neizbežno je ograničila mogućnosti ove metode. Stoga su činjeni mnogi pokušaji da se ovo prevaziđe. Sadašnji sistem hromatografije na tankom sloju postavio je Kirchner sa saradnicima 1951. godine, a metoda je postala popularna tek pošto je Stahl objavio obimnu knjigu iz ove oblasti (1962.) u kojoj je opisao komercijalni uređaj za nanošenje tankog sloja i odgovarajuće adsorbente. Najčešće se adsorbent u suspenziji na pogodan način razvlači po površini ploče od stakla ili drugog materijala i suspenzija suši dajući sloj tipične debljine 0,25 mm. Takva ploča se dalje koristi kao i list papira tehnika rada je veoma slična. Tehnika razdvajanja na tankom sloju Hromatografija na tankom sloju adsorbenta se izvodi tako što se blizu ivice ploče na koju je nanesen adsorbent specijalnom kapilarom nanese rastvor uzorka u vidu kapi ili linije koju čini više kapi, rastvarač otpari na vazduhu, a zatim taj kraj ploče vertikalno uroni svojom ivicom u mobilnu fazu. Mobilna faza se kapilarnim silama penje uz sloj adsorbenta, na svom putu nailazi na mrlje uzorka, delimično iz njih rastvara komponente i nosi ih različitim brzinama sa sobom. Kada front mobilne faze dostigne dovoljnu visinu, ploča se vadi i suši, a potom se zone pojedinih komponenata upoređuju. Izgled razvijene ploče s tankim slojem adsorbenta na koju su naneti nepoznati uzorak i poznati standard Već je naglašeno da je vreme zadržavanja karakteristika svake komponente uzorka u datom hromatografskom sistemu. Kod hromatografije na tankom sloju nije pogodno meriti vreme izlaska komponenata iz sistema jer se to pri uobičajenim uslovima rada
Analiza namirnica 66 ne događa, već se tokom određenog trajanja eksperimenta registruje relativno zaostajanje komponenata za frontom mobilne faze, pri čemu se rastojanja obično mere od linije nanošenja uzorka do centra koncentracionih zona (mrlja) komponenata. Karakteristično zaostajanje komponente naziva se R f -vrednost komponente (gornja slika): R f = put komponente put mobilne faze 100 = a b 100 Na taj način, R f -vrednost je veličina, obrnuto proporcionalna vremenu zadržavanja komponente u sistemu. Kod hromatografije na tankom sloju uslovi pojedinačnog eksperimenta teško se mogu ponoviti, tako da poređenje R f -vrednosti nije pouzdano. Stoga se u uzorak unosi unutrašnji standard (x), i sve R f -vrednosti porede s njim: R x put komponente = 100 = put standarda a c 100 Ovakav postupak kompenzuje nehomogenost tankog sloja adsorbenta, temperaturne fluktuacije i mnoge neregularnosti drugih uslova eksperimenta. Kada je reč o reproduktivnosti R f i R x -vrednosti, treba odmah reći da ove karakteristike nisu dovoljne za sigurnu identifikaciju supstanci zbog mnogih eksperimentalnih faktora koje ne možemo kontrolisati. Koncentracione zone komponenata u idealnom slučaju predstavljaju kružnu ili ovalnu mrlju koja postepeno uvećava dimenzije (difuzno širenje) tokom putovanja s mobilnom fazom. U mnogim slučajevima oblik zona je deformisan javljaju se mrlje s jednim ili dva repa, preklapanje mrlja dve komponente ili jedinstvena supstanca daje dve ili više mrlja. Uzroci ovakvih anomalija nisu u potpunosti poznati, no hromatografski sistem se može iskoristiti i u ovakvim slučajevima, ukoliko omogućuje reproduktivnu separaciju komponenata. Stacionarna faza Adsorbenti korišćeni za stacionarnu fazu odgovaraju materijalima koji se upotrebljavaju kod hromatografije na koloni, osim što su čestice znatno manjih dimenzija. Adsorbenti obično sadrže i vezivo da bi se pojačala adhezija između sloja i ploče, a kod nekih se dodaje i inertni fluorescentni indikator (na primer, cink-silikat) koji pomaže pri detekciji koncentracionih zona pod ultraljubičastom svetlošću. Takva posebna obrada adsorbenta posebno se i označava, pri čemu su oznake gotovo standardizovane. U Tabeli 1 dati su neki primeri za silikagel, možda najčešće korišćeni adsorbent u hromatografiji na tankom sloju. Prisustvo dodataka može da izmeni osobine adsorbenta ili da onemogući primenu nekih mobilnih faza, odnosno sredstava za vizuelizaciju koncentracionih zona.
Analiza namirnica 67 Tabela 1. Oznake komercijalnih silikagelova za TLC Silkagel H Silikagel G Silikagel S Silikagel F-254 Silikgel GF-254+366 Silikagel PF bez dodataka uz dodatak gipsa kao veziva uz dodatak skroba kao veziva uz dodatak fluorescentnog indikatora za područje talasne dužine od 254 nm uz dodatak gipsa kao veziva i fluorescentnog indikatora za područje 254 i 366 nm za preparativnu hromatografiju, uz dodatak fluorescentnog indikatora Tanki sloj se može modifikovati na različite načine u cilju zadovoljenja specifičnih potreba. Na primer, za sloj se može upotrebiti adsorbent sastavljen od više komponenata ili se na istoj ploči mogu obrazovati dva susedna sloja od različitih adsorbenata. Sloj se može impregnirati puferima, agensima za precipitaciju (na primer, sulfidom za razdvajanje metalnih jona), agensima za kompleksiranje (na primer, boratima za šećere), agensima za helatiziranje (za neorganske jone), srebronitratom (za nezasićena jedinjenja), hidrofobnim materijalima (za postizanje inverzije faza) itd. Priprema sloja adsorbenta Slika 1 Komercijalni uređaj za nanošenje tankog sloja Za nanošenje sloja postoji niz komercijalnih aparata, od kojih je jedan prikazan na Slici 1. On se sastoji od plastične podloge, na koju se ređaju staklene ploče (20x20 cm ili 20x10 cm), i aplikatora s podesivim razrezom, koji se puni suspenzijom adsorbenta, postavlja na kraj niza ploča, i prevlači preko njega, pri čemu iza sebe ostavlja tanak, ravnomeran sloj suspenzije. Razrez se može podešavati u intervalu od 0-2000 μm (0-2 mm). Rezervoar aplikatora može se podeliti na dva dela i u njih usuti suspenzije dva različita adsorbenta za obrazovanje dva različita susedna sloja na pločama. Suspenzija adsorbenta pravi se u određenoj količini vode, organskog rastvarača ili smeše vode i organskog rastvarača, pri čemu se treba strogo pridržavati uputstva proizvođača. Obično se primenjuje suspendovanje tokom 30-60 sekundi u električnom mikseru. Ako adsorbent sadrži vezivo, mora se odmah po suspendovanju naneti na ploče da se ne bi stegao i postao neupotrebljiv. Brzina
Analiza namirnica 68 vezivanja gipsa, čestog vezivnog materijala, može se smanjiti ako se umesto čiste vode za suspenziju upotrebi smeša vode i metanola. Prevučene ploče se ostave da se osuše na vazduhu, a zatim se aktiviraju prema uputstvu, odnosno potrebi, najčešće (SiO 2, Al 2 O 3 ) pri 100-120 0 C. Slojevi celuloze, jonoizmenjivačkih smola, poliamida samo se suše na vazduhu, a gel Sephadexa koristi se odmah po nanošenju, dok je još u nabubrelom stanju. Ako je potrebno, ploče se impregniraju tako što se prskaju ili potapaju u rastvor impregnacionog sredstva ili se jednostavno urone donjim krajem u rastvor i pusti da se on kapilarnim silama upije do vrha ploče, posle čega se suše i kondicioniraju. Na tržištu ima više proizvođača koji isporučuju gotove ploče za tankoslojnu hromatografiju, kako na staklu, tako i na fleksibilnoj aluminijumskoj foliji ili filmu. Garantovanog su sastava i uniformnosti, a fleksibilne ploče imaju prednost što se mogu seći. Tehnika tankoslojne hromatografije Nanošenje uzorka Nanosi se 0,1-1% rastvor u količini od 1-25 μl. Zone uzorka na početnoj liniji treba da su prečnika od 1-3 mm, međusobno udaljene 1-2 cm, na 1,5-2 cm od ivice ploče. Za analitički rad, uzorak se nanosi u količini od 1 μg do 1 ng. Postoje komercijalni uređaji za automatsko, reproduktivno nanošenje. Izbor sistema: mobilna faza/adsorbent U Tabeli 2 dat je prikaz nekih često korišćenih sistema za različite klase jedinjenja. Tabela 2. Neki često korišćeni sistemi za tankoslojnu hromatografiju različitih klasa jedinjenja 1. 2,4-dinitrofenilhidrazoni aldehida ili ketona a. Heksan/etilacetat (4:1 ili 3:2) - silikagel b. Benzen ili hloroform ili etar ili benzen/heksan (1:1) - aluminijumoksid c. Smeše petroletra/benzena s malo piridina - cinkkarbonat 2. Amini a. Etanol(95%)/amonijak(25%) (4:1) - silikagel b. Aceton/heptan (1:1) - aluminijumoksid c. Aceton/voda (99:1) - kizelgur G 3. Karboksilne kiseline a. Bezen/metanol/sirćetna kiselina (45:8:8) - silikagel b. Metanol ili etanol ili etar - poliamid
Analiza namirnica 69 Tabela 2. Neki često korišćeni sistemi za tankoslojnu hromatografiju različitih klasa jedinjenja (nastavak) 4. Sulfonamidi a. Hloroform/etanol/heptan (1:1:1) - silikagel G 5. Insekticidi a. Cikloheksan/heksan (1:1) ili ugljentetrahlorid/etilacetat (8:2) - silikagel G b. Heksan - aluminijumoksid c. Heptan, zasićen sirćetnom kiselinom - silikagel S d. Hloroform - silikagel G, impregniran oksalnom kiselinom 6. Lipidi a. Petroletar/dietiletar/sirćetna kiselina (90:10:1) do (70:20:4) - silikagel G b. Petroletar/dietiletar (95:5) - aluminijumoksid c. Hloroform/metanol/voda (80:25:3) - silicijumova kiselina 7. Glikolipidi a. Propanol/amonijak(12%) (4:1) - silikagel G 8. Fosfolipidi a. Hloroform/metanol/voda (60:35:8 ili 65:25:4) - silikagel 9. Aminokiseline a. Butanol/sirćetna kiselina/voda (3 ili 4:1;1) - silikagel 10. Steroidi i steroli a. Benzen ili benzen/etilacetat (9:1 ili 2:1) - silikagel G b. Sirćetna kiselina/voda (92:8 ili 90:10) - kizelgur G, impregniran undekanom 11. Vitamini a. Metanol, ugljentetrahlorid, ksilol, hloroform ili petroletar - aluminijumoksid b. Metanol, propanol ili hloroform - silikagel G c. Aceton/parafin (zasićeno vodom) (9:1) - silikagel, impregniran parafinom 12. Šećeri a. Benzen/sirćetna kiselina/metanol (1:1:3) - silikagel, impregniran bornom kiselinom Detekcija i identifikacija komponenata Hromatogram se po sušenju obrađuje reagensima za bojenje koji su poznati iz hromatografije na papiru, pri čemu je na tankom sloju silikagela moguće upotrebiti i brojne korodivne, destruktivne supstance. U nastavku je opisano nekoliko univerzalnih metoda.
Analiza namirnica 70 1. Jodna para. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi nekoliko kristala joda ili se prska rastvorom joda u ugljentetrahloridu. Većina organskih supstanci pojavljuje se u vidu žutih mrlja, pri čemu se nezasićena jedinjenja boje intenzivnije. Ukoliko se želi da se komponente očuvaju za dalju analizu ili eluiraju s ploče, izlaganje jodnoj pari treba da traje kratko, često samo desetak sekundi. Adsorbovani jod se s ploče može ukloniti strujom vazduha. Ovaj reagens, naravno, nije moguće primeniti na adsorbentima kod kojih je vezivo skrob. 2. Prskanje vodom. Ploča se prska vodom dok ne postane transparentna i posmatra u propuštenoj svetlosti. Koncentracione zone organskih jedinjenja pojavljuju se kao neprovidne ("masne") bele mrlje. Reagens je očigledno nedestruktivan. 3. ph-indikatori. Pri prskanju rastvorom indikatora, kisele, odnosno bazne komponente boje se odgovarajućom bojom. 4. Smeše sumporne kiseline. Ovo je opšti reagens za nespecifičnu lokalizaciju zona svih organskih jedinjenja. Postoji niz ovakvih smeša s vodom ili i drugim oksidacionim reagensima (hromsumporna kiselina), kojima se ploča prska i zagreva tokom određenog vremena pri određenoj temperaturi. Komponente se pojavljuju u obliku tamnih ugljenisanih mrlja, pri čemu često tokom zagrevanja određena jedinjenja menjaju boju na specifičan način koji se može iskoristiti za njihovu priližnu identifikaciju. Reagens se ne može primeniti na ploče sa skrobom. 5. Metod vruće žice. Komponente se mogu ugljenisati i tako što se iznad ploče, na kratkom odstojanju (1 mm), prevlači elektrootporna usijana žica (cekas ili nihrom). Metoda je neprimenljiva za ploče vezane skrobom. 6. UV-svetlost. Jedinjenja koja ne fluoresciraju pojavlju se kao tamne mrlje na svetloj pozadini, ako je u sloj dodat fluorescentni indikator. Obratno, na sloju bez indikatora, vidljive su svetle mrlje fluorescirajućih jedinjenja na tamnoj pozadini. Metoda je nedestruktivna. Za specifičnu, bližu identifikaciju jedinjenja, mogu se koristiti sve metode iz oblasti hromatografije na papiru. Kvantitativna analiza Za kvantitativno određivanje mrlja direktno na sloju se koriste fotodenzitometri uređaji koji na osnovu intenziteta reflektovane svetlosti izračunavaju količinu materijala u mrlji. Kod hromatografije na tankom sloju široko se koristi metoda skidanja mrlja i njihovog daljeg analiziranja drugim metodama. Područje sloja pod mrljom izgrebe se iglom i uz pomoć vakuuma usisa neposredno u minijaturnu kolonu, odakle se eluira polarnim rastvaračem. Ovde mogu nastati teškoće kod spektrofotometrijske analize jer se pri spiranju ne može izbeći prelaz najfinijih čestica adsorbenta u eluat, naročito ako se eluiranje vrši vrlo polarnim rastvaračima. Sitne čestice rasipaju svetlost i snižavaju tačnost određivanja.
Analiza namirnica 71 GASNA (GASNO-TEČNA) HROMATOGRAFIJA (GC, GLC) Kod ove metode mobilna faza je gasna, dok stacionarna faza može biti čvrsta (gasna hromatografija - GC) ili tečna, naneta na čvrst nosač, odnosno unutarnji zid kapilarne kolone (gasno-tečna hromatografija - GLC). Ovaj drugi slučaj je mnogo važniji i češći u praksi. Kod gasno-tečne hromatografije, mobilna faza je uvek neselektivna, tj. predstavlja inertnu, pokretnu atmosferu, u koju komponente uzorka prelaze isključivo zbog sopstvene isparljivosti. S druge strane, afinitet komponenata ka stacionarnoj fazi se ne ostvaruje uvek mehanizmom rastvorljivosti, već često značajnu ulogu igra i adsorpcija na površini, kako tečnog sloja, tako i na površini nosača stacionarne faze. Ovde je značajan faktor i temperatura koja izuzetno utiče na rezoluciju komponenata. Aparatura Na slici 2 je šematski prikazan sistem za gasno-tečnu hromatografiju. Slika 2 Šema sistema za gasno-tečnu hromatografiju Noseći gas (mobilna faza) mora odgovarati primenjenom detektoru, biti inertan, čist, suv i jeftin. Tipičan protok nosećeg gasa u analitičkom radu kreće se između 25 i 125 ml/min. Uzorak se u gasnu struju unosi kroz injektor, putem mikrošprica ili specijalnih ventila za uzorkovanje. Tipična količina rastvora ubrizganog uzorka u analitičkom radu iznosi od 0,1 do 50 μl, a ako su u pitanju gasoviti uzorci, onda između 0,1 i 50 ml. Injektor mora biti zagrejan do temperature dovoljne za potpuno isparavanje uzorka. Kolone su obično od stakla, nerđajućeg čelika ili bakra prave, savijene ili u obliku navoja. Ispunjene su praškastim nosačem, impregniranim stacionarnom fazom. Pakovanje adsorbenta je sabijeno između dva čepa od staklene vune na krajevima kolone. Prečnik analitičkih kolona kreće se od 2 do 6 mm, a dužina od 2 do 30 m. Ako je kolona kapilarna, dakle bez adsorbenta, tada joj se prečnik može kretati od 0,25 do 0,75 mm, a dužina od 30 do 300 m. Budući da je temperatura eksperimenta značajna karakteristika, kolone se smeštaju u poseban termostat.
Analiza namirnica 72 Detektor ima ulogu da otkrije prisustvo i odredi koncentraciju komponente u izlaznoj struji nosećeg gasa. Dobar detektor treba da ima visoku osetljivost, da daje linearan odgovor u širokom rasponu koncentracija i da njegov rad ne podleže varijacijama protoka i temperature. Detektor se termostatira barem na temperaturu kolone da u njemu ne bi došlo do kondenzovanja komponenata uzorka. Signal iz detektora se preko odgovarajućeg pojačivača šalje pisaču i beleži u funkciji vremena. Komponente koje izlaze iz kolone mogu se skupljati u hlađene kapilarne cevi ili u odgovarajuće posude. Stacionarna faza Kod gasno-tečne hromatografije čvrsta faza ima pretežno ulogu nosača tečne stacionarne faze i stoga treba da je inertna, fizički postojana i dovoljne specifične površine. Za nosače se koriste razni oblici deaktiviranog silicijumdioksida (dijatomit, kizelgur) čija se površina dodatno obrađuje da bi postala inertnija. Najefikasnije je da se površina silanizira (slika 3), pri čemu se blokiraju zaostale hidroksilne grupe. Kod kapilarnih staklenih kolona unutarnji zid se takođe podvrgava istoj obradi. Slika 3 Postupak blokiranja hidroksilnih grupa na površini silikagela Kolona ima najveću efikasnost kada je veličina čestica nosača u uskom rasponu, naprimer 60-80 meša (0,25-0,18 mm), 80-100 meša (0,18-0,15 mm), ili 100-125 meša (0,15-0,13 mm). Tečna stacionarna faza u radnim uslovima treba da ima nizak viskozitet i da pokazuje visoku selektivnost rastvaranja različitih komponenata uzorka. Ona ne sme da reaguje sa čvrstim nosačem (osim ako se na taj način imobilizuje na njemu), niti da isparava u značajnijoj meri. Zbog toga se za svaku stacionarnu fazu preporučuju donja i gornja temperaturna granica primene. Tečna stacionarna faza se nanosi na čvrsti nosač u količini od 2-20%, pri čemu manja količina omogućava brže razdvajanje, pri nižoj temperaturi, ali istovremeno smanjuje kapacitet kolone. Tečne stacionarne faze mogu se klasifikovati prema polarnosti. Najpolarnije tečnosti vezuju komponente uzorka jakim vodoničnim vezama, dok kod onih najmanje polarnih između molekula stacionarne faze i molekula komponenata deluju samo slabe vandervalsovske sile. Izbor stacionarne faze vrši se tako da njena polarnost približno odgovara polarnosti komponenata (prema navedenom alhemijskom pravilu:
Analiza namirnica 73 "slično se u sličnom rastvara"). U Tabeli 3 su navedene neke tipične stacionarne faze prema redosledu rastuće polarnosti uporedo s maksimalnim temperaturama njihove primene. Tabela 3. Neke stacionarne faze za GLC, u nizu rastuće polarnosti Stacionarna faza Maksimalna temperatura korišćenja ( 0 C) Squalan (C30H62, razgranat) 150 Apiezon-L mast (A.E.I., England) 250-300 Didecilftalat 165-170 Di-(2-etilheksil)sebacinat 150 Metilsilikonsko ulje, niskog viskoziteta (DC-200, 200 Dow Corning) Fenilsilikonsko ulje (DC-550, Dow Corning) 180-220 Metilsilikonska guma (SE-30, General Electric) 300-350 Polietilenglikol (Carbowax 1540, Union Carbide) 150 Polialkilenglikol (Ucon Oil LB-550-X, Union Carbide) 180-200 Polialkilenglikol (Ucon Oil 50-HB-2000, Union 180-200 Carbide) Polifeniletar (OS-138) 200-225 Poliestar butandiolsukcinat "BDS" 200-205 Poliestar dietilenglikolsukcinat "DEGS" 205-210 Noseći gas Noseći gas, osim što treba da je inertan, treba da ima i što veću molekulsku masu jer se na taj način smanjuje difuzioni koeficijent komponenata uzorka u njemu i shodno tome, difuziono širenje koncentracionih zona. Zbog toga se obično za noseći gas koristi azot (M=28) ili argon (M=40). Za specifične svrhe, npr. pri upotrebi termokonduktometrijskog detektora (o kome će kasnije biti reči), koriste se, s druge strane, gasovi najniže moguće molekulske mase: vodonik i helijum, upravo zato što im se koeficijent termičke provodljivosti veoma razlikuje od svih drugih supstanci, pa se prisustvo komponenata u njima može lako pratiti. Osim toga, pomenuti gasovi su niske gustine, što omogućuje primenu visokih protoka i ostvarivanje kraćeg vremena razdvajanja. Temperatura kolone Budući da se kod gasno-tečne hromatografije raspodela komponenata između nosećeg gasa i stacionarne faze vrši na osnovu razlika između njihove isparljivosti i rastvorljivosti, radna temperatura sistema ima izuzetan značaj. Povišenje temperature izaziva povećanje isparljivosti i smanjenje rastvorljivosti komponenata, zbog čega se komponente kraće zadržavaju u koloni, koncentracione zone su jasnije
Analiza namirnica 74 izražene, ali je razdvajanje komponenata lošije. S druge strane, sa sniženjem temperature raste rastvorljivost komponenata, što omogućuje njihovu potpuniju interakciju s polarnom stacionarnom fazom i vodi boljoj rezoluciji, ali i produženom vremenu analize. Više temperature po pravilu poboljšavaju razdvajanje komponenata prema isparljivosti, a niže prema polarnosti. Na osnovu prethodnog razmatranja proizlazi da za svako konkretno razdvajanje postoji neka kompromisna temperatura, s tim što treba voditi računa i o maksimalnoj temperaturi korišćenja stacionarne faze, kao i o riziku da komponente uzorka pri višim temperaturama reaguju s njom ili nezavisno od nje, pretrpe strukturne i hemijske promene. Kod gasno-tečne hromatografije učestvuje i pojava koja se ne sreće kod drugih vrsta hromatografije: razdvajanje se postiže ne samo prema afinitetu, već i prema isparljivosti. Tako će, na primer, homologi niz alifatičnih ugljovodonika (dakle jedinjenja jednake polarnosti) izlaziti iz kolone redosledom rastućih molekulskih masa, što se slaže s redosledom njihove opadajuće isparljivosti. Pri tome će se pri izotermskom radu zapaziti sukcesivno opadanje visine i širenje koncentracionih zona s vremenom zadržavanja pojedinih komponenata, što se u potpunosti može kompenzovati primenom programiranog rasta temperature kolone tokom analize. Sličan princip temperaturnog programiranja kolone može se primeniti na smešu komponenata kod kojih se (zbog njihove veoma različite polarnosti) retenciona vremena veoma razlikuju. Detektori 1. Termokonduktometrijski detektor (katarometar) Slika 4 Šema termokonduktometrijsklog detektora Ovaj detektor radi na principu električno zagrevane žice oko koje struji noseći gas. Kada su jačina struje i protok konstantni, između žice i gasa uspostavlja se termička ravnoteža: proizvedena toplota jednaka je toploti koju odvodi noseći gas i temperatura žice zadržava konstantnu vrednost koja, između ostalog, zavisi i od termičke provodljivosti gasa. Ako se zbog pristustva strane komponente promeni termička provodljivost nosećeg gasa, uspostaviće se novo ravnotežno stanje i drugačija temperatura žice.
Analiza namirnica 75 U svojoj praktičnoj realizaciji katarometar (slika 4) predstavlja masivni metalni blok s dve protočne ćelije u kojima su smeštena dva identična metalna filamenta ili dva identična termistora poluprovodnička otpornika s visokim termičkim koeficijentom električnog otpora. Ti elementi čine dve grane Wheatstoneovog mosta uređaja, pomoću koga se mogu upoređivati njihove električne otpornosti. Kroz jednu od ćelija (referentnu) noseći gas protiče pre ulaska u kolonu, a kroz drugu (radnu) po izlasku iz nje. Početna identičnost uslova u obe ćelije znači i električnu ravnotežu filamenata detektor ne daje signal. Kada se, pak, u efluentu iz kolone nađe komponenta, termička provodljivost nosećeg gasa se menja, što izaziva promenu temperature elektrootpornog elementa u radnoj ćeliji i poremećaj električne ravnoteže između filamenata, koju detektor registruje. Konduktometrijski detektor je univerzalnog tipa. Pošto je za njegovu osetljivost veoma značajno da se termička provodljivost nosećeg gasa što više razlikuje od termičke provodljivosti komponenata, noseći gas je obično vodonik ili helijum. On spada u nedestruktivne detektore, što znači da se posle izlaska iz njega komponente mogu sakupljati i dalje analizirati drugim metodama. Odgovor katarometra proporcionalan je koncentraciji komponente u nosećem gasu tako da se za dobijanje podatka o apsolutnoj masenoj količini komponente mora tačno poznavati veličina protoka nosećeg gasa. 2. Plameno-jonizacioni detektor (engl. flame ionization detector, FID) Ovaj detektor (slika 5) sastoji se u načelu od dve elektrode, između kojih gori kiseonično-vodonični plamen. Između elektroda priključenih na jednosmerni napon (150-300 V) protiče slaba električna struja zbog prisustva male količine jona u plamenu. U gorivu smešu stalno se uvodi noseći gas iz kolone. Kada u plamen s nosećim gasom dospe neko organsko jedinjenje, ono naglo sagoreva u višku kiseonika, pri čemu se stvori veliki broj jona i struja između elektroda naglo poraste. Odgovor detektora proporcionalan je broju neoksidisanih ugljenikovih atoma, što znači da se detektor može primeniti za detektovanje gotovo svih organskih jedinjenja, pri čemu je za kvantitativan rad potrebna kalibracija uz standarde. Neorganski gasovi, voda, ugljendisulfid i ugljenoksisulfid ne izazivaju odgovor detektora, tako da je ugljendisulfid pogodan rastvarač za unošenje uzorka u kolonu. Slika 5 Šema plameno-jonizacionog detektora
Analiza namirnica 76 Za razliku od katarometra, odgovor ovog detektora nije proporcionalan koncentraciji, već apsolutnoj masenoj količini komponente i stoga ne zavisi od protoka nosećeg gasa. Detektor je veoma raširen u praksi. Budući da je destruktivan, ako se želi hvatanje komponenata iza kolone, mora se primeniti cepanje toka nosećeg gasa (obično u odnosu 1:10). Manji deo ide u detektor, a veći u kolektor frakcija. 3. Alkalni plameno-jonizacioni detektor (engl. alkali flame ionization detector, AFID) FID se može podesiti da bude osetljiv gotovo isključivo za organofosforna i u nešto manjoj meri za azotna jedinjenja u submikrogramskim količinama tako što se uz sam plamen smesti mali blok kalijumhlorida, cezijumbromida ili rubidijumsulfata. Za razliku od situacije kod plameno-jonizacionog detektora (višak kiseonika), vodoničnokiseonični plamen se održava redukcionim (višak vodonika), tako da značajnu ulogu u stvaranju signala ima piroliza organskih jedinjenja. Mehanizam rada AFID još nije u potpunosti rasvetljen. Detektor je destruktivnog tipa i primenjuje se najviše za analizu organofosfornih pesticida. 4. Detektor elektronskog zahvata (engl., electron capture, EC) Slika 6 Detektor elektronskog zahvata Ovaj detektor (slika 6) sadrži izvor β-zračenja na unutarnjem zidu kućišta kroz koje se propušta noseći gas iz kolone. Zračenje jonizuje molekule komponenata, zbog čega se između pozitivne elektrode i negativno naelektrisanog kućišta detektora javlja električna struja. Izvor β-zračenja je obično titanijumska folija na kojoj je adsorbovan radioaktivni tricijum 3 H 2 ili folija radioaktivnog izotopa 63 Ni. Oba izvora su čisti β-izračivači, što pri radu omogućuje laku zaštitu od radioaktivnosti. Kao noseći gas za ovaj detektor koristi se azot ili argon sa 10% metana. Osetljivost detektora na organske molekule zavisi od njihovog efektivnog preseka za jonizaciju, pa se stoga on uglavnom koristi za detekciju halogenih jedinjenja, naročito pesticida. Ovo je detektor nedestruktivnog tipa. Neke uporedne osobine opisanih detektora, prikazane su u Tabeli 5.