Hromatografija u farmaceutskoj analizi i kontroli lekova 1906... Mihail Semjonovič Cvet (1872 1919) 2
Hromatografija je metoda koja služi za razdvajanje sličnih i/ili potpuno različitih jedinjenja. Razdvajanje je zasnovano na raspodeli ispitivanih supstanci između dve faze koje se međusobno ne mešaju. Jedna faza se ne kreće stacionarna faza dok se druga faza kreće mobilna faza. U zavisnosti od tipa raspodele hromatografija se deli na: 1. Tečno-tečna hromatografija 2. Tečno-čvrsta hromatografija 3. Hromatografija zasnovanu na razmeni jona (eng. ion-exange chromatography) 4. Gel hromatografija (eng. size exclusion chromatography) 3 Tečno-tečna hromatografija ili podeona hromatografija ima tečnu stacionarnu fazu koja se različitog sastava od tečne mobilne faze i međusobno se ne mešaju. Razdvajanje molekula se zasniva na raspodeli između dve tečne faze. Čvrsto-tečna ili adsorpciona hromatografija ima čvrstu stacionarnu fazu koja se sastoji od čestica velike površine i tečnu mobilnu fazu. Razdvajanje molekula je zasnovano na različitom vezivanju za stacionarnu fazu. Hromatografija zasnovana na razmeni jona (ion-exange chromatography) stacionarna faza sadrži funkcionalne grupe kao što su SO 3- zajedno sa suprotno naelektrisanim jonima (npr. Na + ) koji su normalno prisutni u mobilnoj fazi u formi soli. Zadržavanje molekula koji ima X + vrši se na principu razmene jona: X + + -SO 3 -Na + Na + + -SO 3 -X + Gel hromatografija (size exclusion chromatography) ima kolonu pakovanu sa poroznim materijalom koji ima određenu veličinu pora. Molekule veće molekulske mase će prolaziti kroz kolonu dok će se manje zadržavati. 4
Delovi hromatografskog sistema Hromatografski parametri Aspekti primene hromatografije u farmaceutskoj analizi Razvoj hromatografskih uslova Hromatografija normalnih faza Hromatografija reverznih faza Jonoizmenjivačka hromatografija Hromatografija zasnovna na veličini molekula size-exclusion chromatography 5 Delovi hromatografskog sistema 6
7 8
1. Mora biti izrađena od materijala koji je otporan na komponente mobilne faze. 2. Sposobna da izdrži pritiske od 500 psi do 5000 psi. 3. Da obezbedi protoke od 0,5 do 5,0 ml/min. ( za farmaceutske analize najviše se koristi od 1,0 do 2,0 ml/min.). 4. Reproduktivnost prenosa mobilne faze mora biti << 1 %. 5. Pritisak koji obezbeđuje pumpa zavisi od dimenzija kolone i veličine čestica, od protoka i viskoziteta mobilne faze koja se koristi. Pre upotrebe, mobilna faza mora biti filtrirana i degazirana. 9 Sistem može imati jednu, dve (binarni sustem) ili četiri pumpe (kvaternerni sistem). Primer binarnog sistema: 10
Tipovi eluiranja Izokratsko eluiranje Gradijentno eluiranje Sastav mobilne faze se ne menja u toku analize. Sastav mobilne faze se menja u toku analize po utvrđenom programu gradijenta. 11 Izokratsko eluiranje Gradijentno eluiranje A hlorogena kiselina B rutin * nečistoća 12
Injektor predstavlja deo sistema preko koga se uzorak uvodi u kolonu. Može biti manuelni ili autosampler. Kod manuelnog volumen petlje može biti različit (10 µl, 20µl, 100 µl itd.) i njegov izbor zavisi od tipa analize koja se izvodi. Nedostatak je što se svaki uzorak mora injektovati. Kod autosamplera volumen injektovanja se može podesiti od 1 µl pa do 100 µl i više što zavisi od vrste opreme i analize koja se izvodi. Omogućava podešavanje sekvence čime se može obezbediti da se bez prisustva analitičara uradi 100 i više analiza. 13 Kolona Delovi hromatografskog sistema Kolona stacionarna faza predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika i njihov izbor zavisi od fizičko-hemijskih osobina supstanci koje se ispituju. Temperatura kolone održava se konstantnom u toku analize pomoću termostata za kolonu, što je značajno jer promena temperature utiče na distribucioni koeficijent, rastvorljivost komponenti i viskozitet mobilne faze.
Delovi hromatografskog sistema Kolone se razlikuju prema: Tipu monolitne, porozne, neporozne Geometriji čestica - površini, zapremini pora, prečniku pora, veličini i obliku čestica Hemiji površine gustina vezivanja, vrsta vezanih liganada Vrsti osnovnog materijala - silicijum-dioksid, polimer... Tipovi materijala za pakovanje Delovi hromatografskog sistema porozan materijal sa veličinom čestica od 3 µm do 10 µm uglavnom u farmaceutskoj analizi neporozan materijal nije dao očekivano poboljšanje kvaliteta pika čak za posledicu ima i širenje pika monolitno pakovanje (makropore prečnika od 4000 Å do 6000 Å i mezopore prečnika od 20 Å do 500 Å) povećana je permeabilnost i smanjene šupljina u odnosu na porozni materijal
Delovi hromatografskog sistema Silika, 5 µm Monolitni silicijum-dioksid Delovi hromatografskog sistema Osnovni materijal za pakovanje kolona je silicijum-dioksid Daje sferne, porozne čestice sa homogenom distribucijom čestica Osnovni nedostatak je nestabilnost: a) Pri ph < 2,5 hidroliza silanolnih veza b) Pri ph > 8,5 rastvaranje silike Veća gustina pakovanja i određene hemijske modifikacije omogućile su dobijanje kolona koje se mogu koristiti i u širem opsegu ph vrednosti.
Šema modifikacije kolona sa polarnim silanolnim grupama: Delovi hromatografskog sistema Kolona R C 18 C 18H 37 C 8 C 8H 17 Gde R može biti: Fenil C 3H 6 C 6H 5 C 3 C 3H 7 C 1 CH 3 Aminopropil C 3H 6 NH 2 Cijanopropil C 3H 6 CN Primeri liganada vezanih za osnovni silika materijal C1 C-18 C8 Oksifenil
Primer izgleda kolone sa C18 grupama C18 lanci su dužine ~21 Å Molekulska zapremina je ~700 Å 3 Maksimalna gustina je 2,5 lanaca/nm 2 ili 4,1 mmol/m 2 Endcapping dodatna zaštita slobodnih silanolnih grupa Dodatna zaštita vrši se sa trimetillhlorosilanom
Delovi hromatografskog sistema Stacionarne faze najčešće korišćene u farmaceutskoj analizi Stacionarna faza C18 C8 i C4 Fenil Silika gel Amino Cijanopropil Jaki izmenjivači katjona Jaki izmenjivači anjona Primena/karakteristike Najčešće korišćene kolone za framaceutsku analizu. Prve kolone su imale kao nedostatak problem pri razdvajanju baznih supstanci usled vezivanja za slobodne silanolne grupe. Eliminacija ovih loših karakteristika postignuta je tzv. "zaštitom" slobodnih silanolnih grupa alkil radikalima s malim brojem ugljenikovih atoma (najčešće metil) čime se izbegavaju neželjene interakcije ispitivanih komponenti sa stacionarnom fazom i omogućava primena u širem opsegu ph. Korisna alternativa za C18. Kraći ugljovodonični lanci mogu biti pogodniji u analizi nekih farmaceutskih supstanci. Pogodne za analizu supstanci koje imaju više aromatičnih prstenova u sebi jer sa dodatnim interakcijama između supstance i stacionarne faze omogućavaju bolje razdvajanje (npr. za propranolol i naproksen). Ranije više korišćene. Danas, za visoko lipofilne supstance (npr. za lipide) koje u reverzno-faznom sistemu formiraju micele. Kao nosač stacionarne faze ima nedostatak što se sme koristiti samo u opsegu ph od 2,0 do 8,0. Delimično polarna faza, najčešće se koristi za analizu šećera i surfaktanata. Delimično polarna faza, najčešće se koristi za analizu surfaktanata. Zasnovana na građenju jon para između analita i ostataka sulfonske kiseline koji su na površini stacionarne faze. Za analizu jako polarnih supstanci kao što su aminošećeri ili polarnih baza kao što su npr. kateholamini. Zasnovana na građenju jon para između analita i ostataka kvaternernih amonijum grupa na površini stacionarne faze. Za analizu jako polarnih supstanci sa anjonskim grupama kao što su nukleotidi ili anjonski oblici metabolita (sulfati i glukuronidi). Danas u HILIC sistemu Delovi hromatografskog sistema Primer interakcija farmaceutske supstance sa različitim tipovima kolona:
Uticaj stacionarne faze na separaciju 25 Vrste detektora Vrste detektora UV/Vis detektor PDA detektor (eng. photodiodearray detector) Elektrohemijski detektor Amperometrijski detektor Refraktometrijski detektor Fluorescentni detektor Maseni detektor, itd. 26
Vrste detektora Idealan detektor: 1. Visoko osetljiv detektor je utoliko bolji ukoliko je signal koji daje veći a koncentracija analita manja. Osetljivost detektora zavisi od prirode analita. 2. Odgovara svim analitima u smeši 3. Širok opseg linearnosti 4. Da se odgovor ne menja sa promenama u sastavu mobilne faze i temperature 5. Da je odgovor nezavisan od mobilne faze 6. Lak i jednostavan za upotrebu 7. Da odgovor proporcionalno raste sa povećanjem koncentracije analita 8. Da ga rastvori ne mogu oštetiti 9. Da daje kvalitativne informacije za detektovani pik 10. Da brzo daje odgovor 27 UV/VIS detektori Vrste detektora Najpopularniji i najviše korišćeni detektori u kontroli kvaliteta lekova. Detektuju samo supstance koje apsorbuju UV ili VIS svetlost. Farmaceutske supstance koje u sebi imaju aromatičan prsten, dvostruke veze između O, S, N ili C kao i druge hromofore apsorbuju UV ili VIS svetlost i mogu se određivati ovim detektorima. Količina svetlosti koju supstanca apsorbuje srazmerna je koncentraciji što se može prikazati Lamber-Beerovim zakonom: A apsorbancija A = abc a molarna apsorptivnost (konstantna vrednost) b dužina puta koju pređe svetlost c koncentracija analita 28
Vrste detektora Ranije su ovi detektori merili apsorbanciju samo na 254 nm dok je danas omogućeno podešavanje bilo koje talasne dužine u UV/VIS oblasti. Današnji detektori imaju osetljivost od 0,002 AUFS (eng. Absorbance Units Full Scale) i šum od 1 %. Ovako visoka osetljivost omogućava praćenje supstanci koje imaju vrlo nisku apsorptivnu moć kao i određivanje vrlo niskih koncentracija supstanci sa umerenom sposobnošću apsorbancije. Takođe, širok opseg linearnosti omogućava istovremeno određivanje tragova jedne supstance i visoke koncentracije druge supstance što je od velikog značaja u istovremenoj analizi farmaceutskih supstanci i njihovih nečistoća. 29 Vrste detektora PDA (eng. Photo diode array detector) detektor PDA detektor UV/VIS detektor 30
Vrste detektora Prednosti PDA detektora: A. U svakom trenutku se može napraviti kolekcija spektara. B. Može se vršiti pretraživanje iz odgovarajućih biblioteka podataka. C. Može se proveravati čistoća pika što je od velikog značaja u kontroli lekova. D. Može se istovremeno vršiti kvantitativna analiza na 6 talasnih dužina. E. Pogodan za analizu smeše supstanci koje imaju značajne razlike apsorpcionih maksimuma kao i pikova koji se preklapaju ako su im različite spektralne osobine. 31 Vrste detektora Elektrohemijski detektor Uglavnom se koristi kulometrijska detekcija. Tačno određeni potencijal se primenjuje između radne i referentne elektrode. Detekcija se zasniva na oksido-redukcionim procesima. Često se koristi za analizu lekova u biološkom materijalu npr. za određivanje kateholamina u plazmi i urinu, zatim oksidoredukcionog sistema kortizol/kortizon u plazmi, lekova koji imaju merkapto grupu (kaptopril), penicilamina itd. Detektor visoke osetljivosti. 32
Vrste detektora Amperometrijski detektor Nema velike razlike između amperometrijskog i elektrohemijskog detektora sem što se amperometrijski uglavnom koristi u hromatografiji jona. Visoko osetljiv za jone, korisiti se najviše za analizu sulfata i fosfata. U farmaceutskoj analizi može se koristiti za određivanje kardenolida i amonoglikozidnih antibiotika koji nemaju hromofore. Pokazuju osetljivost za količine i ispod 1 ng analita u uzorku. Takođe se koriste za analizu ostataka šećera nastalih iz glikoproteina. 33 Vrste detektora Refraktometrijski detektor Detekcija se zasniva na promeni indeksa refrakcije pri prolasku analita kroz ćeliju za uzorak u detektoru dok se u referentnoj detektorskoj ćeliji nalazi mobilna faza. Veoma je osetljiv na sastav mobilne faze i temperaturu što ga čini nerobusnim detektorom. Fluorescentni detektor Detekcija komponente koja fluorescira zasnovana je na emisiji fluorescencije koja je praćena ekscitacijom na određenoj talasnoj dužini. Robusan i selektivan detektor koji je pogodan za komponente koje fluoresciraju kao i one koje se derivatizacijom mogu prevesti u supstancu koja ima sposobnost fluorescencije. 34
Hromatografski parametri Parametri koji se koriste u tečnoj hromatografiji LC parametri Retencioni parametri Parametri razdvajanja Parametri simetrije pika Parametri efikasnosti kolone 35 Hromatografski parametri Retencioni parametri retenciono vreme (t r ), tj. vreme koje protekne od unošenja uzorka u kolonu do pojave maksimuma pika, redukovano retenciono vreme (t r ) vreme koje supstanca provede u stacionarnoj fazi, relativno retenciono vreme (r) odnos retencionog vremena posmatranog pika u odnosu na referentni, retenciona zapremina (V r ) i retencioni faktor (k) koji predstavlja meru zadržavanja komponente u koloni. 36
Izračunavanje retencionih parametara Hromatografski parametri Parametar Redukovano retenciono vreme Izraz za izračunavanje t r t 0 Relativno retenciono t 2 /t 1 Retenciona zapremina t r F v Retencioni faktor (k) (t r t 0 )/t 0 F v brzina protoka mobilne faze t 0 retenciono vreme pika mobilne faze. Određuje se injektovanjem neretencione supstance ili organskog rastvarača koji je slabiji od organskog rastvarača koji ulazi u sastav mobilne faze. 37 Hromatografski parametri Retencioni faktor (k), kao mera zadržavanja komponente u koloni, jedan je od pokazatelja kvaliteta hromatograma. Idealna vrednost je 1 k 10 Ako je k < 1 supstanca se ponaša neretenciono tj. eluira se sa pikom mobilne faze. Ako je k > 10 supstanca se predugo zadržava u koloni što za posledicu ima predugo trajanje analize. 38
k <1 K >10 1 <k <10 39 Uticaj sadržaja organskog rastvarača na na k Komponente nisu razdvojene i eluiraju se sa pikom mobilne faze Komponente nisu razdvojene i eluiraju se sa blizu pika mobilne faze (k<0,2) 90 % metanola 10 % vode 70 % metanola 30 % vode Komponente 3 i 4 nisu 4 dobro razdvojene (0,3<k<2,5) Postignuto razdvajanje komponenti. (1<k<5) 50 % metanola 50 % vode 40 % metanola 60 % vode 40
Uticaj koncentracije uzorka na k Hromatografski parametri a) Niska koncentracija uzorka povećanjem koncentracije raste visina pika ali se ne menja retenciono vreme tako da se k neće menjati (linearno izotermno zadržavanje) b) U nekim kritičnim slučajevima, povećanje koncentracije dovodi do smanjenja retencionog svremena za jednu ili više komponenti c) d) Dalje povećanje koncentracije vodi gubitku razdvajanja i dalje skraćivanju retencionog vremena Preporuka je da se kvantitativna analiza vrši pri koncentracijama gde je vrednost k konstantna čime se potvrđuje da kapacitet kolone za datu supstancu nije prekoračen. 41 Hromatografski parametri Parametri razdvajanja Separacija moć razdvajanja: Faktor selektivnosti (α) koji predstavlja meru razdvojenosti dve komponenete i smatra se da je za α >> 1 postignuto zadovoljavajuće razdvajanje ispitivanih komponenti. Izračunava se iz sledećeg izraza: α= k 2 /k 1 Faktor selektivnosti predstavlja selektivnost kolone tj njenu sposobnost da razdvoji dve komponete iz smeše. Što je α veće dve komponente su bolje razdvojene. 42
Primer uticaj rastvarača na faktor selektivnosti Promena organskog rastvarača Promena % organskog rastvarača Mobilna faza acetonitril:voda (40:60 v/v) Komponente 3 i 4 nisu dobro razdvojene Mobilna faza metanol:voda (90:10 v/v) Previše organskog rastvarača sve komponente eluirane istovremeno α=1,32 Promena % organskog rastvarača α=1,22 Mobilna faza metanol:voda (50:50 v/v) Postignuto razdvajanje ali analiza traje predugo Mobilna faza metanol:voda (60:40 v/v) Postignuto razdvajanje i optimalno trajanje 43 analize. Hromatografski parametri Faktor rezolucije (Rs) čija vrednost treba da bude veća od 1,2. Izračunava se iz sledećeg izraza: R = 2 t/(w A +W B ) t razlika u retencionim vremenima pika A i B (t A t B ) W A širina pika A na baznoj liniji W B širina pika B na baznoj liniji Prema USP
Izraz za izračunavanje Rs po propisu Ph. Eur. glasi: ( ) 1,18 t R s = R2 t w + w h1 R1 h2 gde je: t R1 i t R2 retenciono vreme između 2 susedna pika (t R2 > t R1 ), w h1 i w h2 širina pika na 50 %visine pika. Primer Hromatografski parametri Veće Rs bolje razdvajanje, manje Rs lošije razdvajanje. 46
Hromatografski parametri Parametri simetrije pika Izgled pika neki molekuli se kreću brzo kroz kolonu jer provode puno vremena u mobilnoj fazi dok se drugi u većoj meri vezuju za stacionarnu fazu i kreću sporije. Rezultat ovakvog nasumičnog kretanja je simetričan Gausov pik. Izgled pika se definiše parametrom - Asimetrija pika (As). Idealna vrednost je 1 As 1,2. 47 Hromatografski parametri As=W 0,05 /2f As = 1 pik je simetričan (tzv. Gausov pik) As > 1 pik ima tejling tj. kolona je prezasićena uzorkom As < 1 pik ima fronting tj. postoji jaka veza između stacionarne faze i ispitivane komponente 48
Hromatografski parametri Parametri efikasnosti kolone Broj teorijskih platoa (N) je mera efikasnosti kolone tj. njene sposobnosti da da pikove sa manjom širinom i obezbedi bolje razdvajanje. Izračunava se iz sledećih izraza: N=16(t R /W) 2 N=5,54 (t R /W 1/2 ) 2 t R retenciono vreme komponente W širina pika na baznoj liniji W 1/2 širina pika na polovini visine pika 49 Hromatografski parametri N ima približno iste vrednosti za različite pikove nastale pod istim hromatografskim uslovima. To znači da se sa povećanjem retencionog vremena povećava i širina pika što za posledicu ima da pik koji se eluira poslednji ima malu visinu a veoma često i nestane u baznoj liniji. Vrednost N proporcionalna je dužini kolone pa, ako su ostali faktori konstantni, duža kolona vodi ka povećanju N tj. boljem razdvajanju. 50
Hromatografski parametri Korelacija između N i dužine kolone (L) može se prikazati sledećim izrazom: N=L/H H - visina ekvivalentna teorijskom platou (Height Equivalent of a Theoretical Plate HETP) i predstavlja meru efikasnosti kolone po jedinici dužine (L). Niže vrednosti Htj. više vrednosti Nsledi veća efikasnost kolone! 51 1.H je niže za kolone pakovane sa česticama manjih dimenzija i za niže protoke mobilne faze. 2.H je niže za manje viskozne mobilne faze i za više temperature. 3.H je niže za manje molekule. Dakle, više vrednosti N i bolje razdvajanje postižu se na dužim kolonama sa manjom veličinom čestica, sa manje viskoznom mobilnom fazom koja protiče relativno sporo kroz kolonu uz više temperature pri razdvajanju.
Hromatografski parametri Korelacija između H i brzine protoka mobilne faze može se opisati sledećim izrazom (van Deemter-ov izraz): H = A + B/u + Cu A, B i C su konstante koje zavise od kolone, vrste uzorka, mobilne faze i temperature a u je brzina mobilne faze. 53 Hromatografski parametri A eddy difuzija širenje pika se javlja kao posledica toga što neke molekule putuju duže dok neke imaju kraći put i brže se eluiraju. Brže se eluira Sporije se eluira X i Y su molekule iste supstance 54
Hromatografski parametri B stepen difuzije molekula u tečnoj fazi i njegov uticaj je vrlo mali u tečnoj hromatografiji. Uticaj na širenje pika se smanjuje kako se protok povećava i postaje značajan samo kod jako niskih protoka. C je otoprnost molekula na transfer mase u stacionarnu fazu i zavisi od njegovog difuzionog koeficijenta u stacionarnoj fazi kao i od debljine filma stacionarne faze kojom je obložena silika. 55 Hromatografski parametri R = Veza između R, α, N i k: N α 1 k 4 α k 1 efikasnost selektivnost retencija Sposobnost razdvajanja i može se menjati promenom mobilne ili stacionarne faze. Efikasnost razdvajanja - karakteriše je N i može se menjati promenom dužine kolone ili viskozitetom mobilne faze. Sadrži retencioni faktor i vrednost mu se menja promenom jačine rastvarača. 56