HROMATOGRAFIJA SEPARACIONE TEHNIKE -razdvajanje jedne kompomente iz višekomponentnog sistema taloženje i ceđenje destilacija kristalizacija ekstrakcija centrifugiranje hromatografske tehnike
HROMATOGRAFIJA različita raspodela komponenti između dve faze od kojih je jedna pokretna (mobilna), a druga nepokretna (stacionarna); komponente se zadržavaju u nepokretnoj, odnosno pokretnoj fazi različito vreme i kreću se kroz sistem različitim brzinama; posle izvesnog vremena komponente se razdvajaju, pri čemu komponente koje su više vremena u nepokretnoj fazi putuju sporije i obrnuto.
Princip razdvajanja Razdvajanje komponenata smeše pomoću dve faze: nepokretne (stacionarne) i pokretne (mobilne) na osnovu različitog afiniteta komponenata prema stacionarnoj i mobilnoj fazi Nernstov zakon raspodele: koeficijent raspodele, K= c s /c m K zavisi od prirode supstance, stac. i mob. faze i temperature, a ne zavisi od koncentracije
FAZE NEPOKRETNA FAZA čvrsta ili tečna naneta na čvrst nosač POKRETNA FAZA gasovita ili tečna
HROMATOGRAFIJA - PODELA hromatografija Stacionarna faza: čvrsta tečna adsorpciona podeona Mobilna faza: gas tečna gas tečna gasna tečna gasna tečna
PRINCIP RAZDVAJANJA Adsorpcione različita, reverzibilna adsorpcija komponenti na nepokretnoj fazi Podeone delimično, selektivno rastvaranje komponenti u nepokretnoj fazi
HROMATOGRAFIJA Ruski botaničar Cvet otkrio je princip razdvajanja pigmenta iz lišća primenom adsorpcije 1903. izložio je svoje otkriće Biološkom društvu Varšavskog udruženja prirodnih nauka
Zeleni hlorofil nije samo zelen i nije samo hlorofil!
HROMATOGRAFIJA u koloni
Preparativna hromatografija u koloni U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač
Preparativna hromatografija u koloni U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač
Preparativna hromatografija u koloni U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač
Preparativna hromatografija u koloni U toku svih faza hromatografskog postupka u kolonu se konstantnim protokom uvodi rastvarač
Analitička hromatografija u koloni Preparativna hromatografija
Gasna hromatografija (Gas Chromatography - GC) Pokretna faza gas Nepokretna faza tečnost naneta na čvrst nosač Princip podeona hromatografija (najrastvorljivije komponente najsporije putuju)
Osnovni delovi GC Izvor gasa nosača sa regulatorom pritiska i protoka Injektor (sistem za unošenje uzorka) Hromatografska kolona u termostatu Detektor Sistem za registraciju signala iz detektora (računar i pisač)
Gasni hromatograf (GC)
Gasni hromatograf princip rada pritisak gasa se smanjuje pomoću regulatora pritiska gas ulazi u komoru za ubrizgavanje uzorka koja se nalazi na povišenoj temparaturi u komoru se, pomoću šprica, ubrizgava uzorak koji može biti tečan ili gasovit uzorak trenutno isparava i biva ponesen u struji gasa nosioca cela smeša ulazi u kolonu u koloni se nalazi punjenje koje predstavlja čvrst nosač na koji je naneta tečna faza u koloni dolazi do raspodele komponenti između gasne i tečne faze, prema KOEFICIJENTU RASPODELE K za svaku komponentu postoji odgovarajući koeficijent raspodele, jer je rastvorljivost različita
Pokretna faza u GC Izbor gasa zavisi od tipa detektora He H 2 N 2
Injektor -komora za ubrizgavanje uzorka
KOMORA ZA UBRIZGAVANJE UZORKA uzorak mora trenutno da ispari temperatura komore mora biti viša od temperature ključanja najneisparljivije komponente obično je temperatura komore za 50 o C viša od temperature kolone, da proces ne bi bio povratan ako uzorak ne ispari trenutno, dolazi do razvlačenja pikova količine uzorka su 1-50 µl
Kolone za GC
Kolone - pakovane (punjene) i kapilarne 1-5 m 10-150 m
KOLONA spiralno savijena kraća (staklena) ili duža (metalna) cev ako je metalna, napravljena je od nerđajućeg čelika, bakra ili aluminijuma optimalna dužina je 70cm do 2m savijene su spiralno radi uštede u prostoru efikasnost kolone raste sa njenom dužinom, ali se otpor povećava, tako da se mora naći optimalna dužina analitičke kolone su duže i uže (φ=6mm) preparativne kolone su kraće i šire (φ do 20mm)
KOLONA analitičke kolone su namenjene hemijskoj analizi kod preparativnih kolona cilj je prolaz što više uzorka kroz kolonu kako bi se dobilo potrebno jedinjenje u koloni se nalazi punjenje čvrstog nosača na koji je naneta tečna faza nosač se meša sa određenom količinom tečne faze rastvorene u pogodnom rastvaraču (pentan, aceton, CH 2 Cl 2 ) blagim zagrevanjem rastvarač otparava
Osobine čvrstog nosača velika specifična površina (1m 2 /g) hemijska inertnost dobro prijanjanje tečne faze termička stabilnost mehanička čvrstoća dobijanje u vidu ravnomernih okruglih čestica često se koristi diatomejska zemlja (87% SiO 2, Fe 2 O 3, Al 2 O 3, CaO, K 2 O, H 2 O) porozan materijal
Osobine i izbor tečne faze neisparljiva na radnoj temperaturi termički stabilna posedovanje odgovarajućeg koeficijenta raspodele K za komponente u uzorku hemijska inertnost prema analiziranoj supstanci (ako reaguje, to mora biti brzo i reverzibilno) od tečne faze zavisi uspešnost razdvajanja uzorak se mora rastvarati u tečnoj fazi («Slično se u sličnom rastvara.») izbor se vrši na osnovu polarnosti (standard skvalen C 30 H 50 ima polarnost 0)
Stacionarne faze
Stacionarnu fazu karakteriše: Polarnost Maksimalna dozvoljena temperatura
Otvorene (kapilarne) kolone nemaju čvrsti nosač, već je tečna faza naneta na zidove kolone uske staklene cevi φ = 0,25-1,00 mm dužina 30-300 m visoka moć razlaganja je posledica dužine kolone (nema otpora protoku) brze analize potrebne su male količine uzoraka vrlo su efikasne u razdvajanju
PRINCIP RAZDVAJANJA Podeona hromatografija slično se u sličnom rastvara komponente putuju kroz sistem samo kada se nalaze u pokretnoj fazi najrastvorljivija komponenta najduže putuje, jer je najduže u nepokretnoj fazi razdvojene komponente stižu do detektora, što se registruje u formi signala koji se zove PIK
Rezolucija
Hromatogram x-osa RETENCIONO VREME vreme zadržavanja Na osnovu retencionog vremena identifikujemo jedinjenja. Na osnovu površine pikova vrši se kvantitativna analiza.
Uticaj temperature na nižoj temperaturi rastvorljivost je veća i razdvajanje je efikasnije viša temperatura potrebna je da bi sve komponente iz uzorka bile u gasovitoj fazi i da vreme zadržavanja u koloni ne bi bilo previše dugo na povišenoj temperaturi slabije je rastvaranje i postoji mogućnost otparavanja tečne faze tipičan opseg: 50-300 o C
Programiranje temperature ako analizirana smeša obuhvata komponente sa velikim rasponom temperatura ključanja, tada bi prvi pikovi bili vrlo uski, poslednji vrlo široki, a vreme analize bilo bi veoma dugo zato u ovakvim slučajevima rad pri izotermskim uslovima nije pogodan tada se primenjuje programiranje temperature, tj. povećavanje u određenim vremenskim intervalima i razmaci između pikova su približno jednaki, a vreme analize je kraće
Program t
Svojstva detektora za GC Dobra osetljivost Velika stabilnost i reproduktivnost Linearan odgovor za širok opseg konc. Temperaturski opseg 20-400 0 C Brz odgovor koji ne zavisi od protoka Lak za rukovanje Nedestruktivan
Detektori za GC Na bazi termičke provodnosti (TCD) Plameno-jonizujući (FID) Merenje elektronskog zahvata (ECD) Plameno-fotometrijski (FPD) Atomski-emisioni (AED) Foto-jonizacioni (PID)
Detektor na bazi termičke provodnosti (katarometar) katarometar je jednostavan i univerzalan (primenljiv na sve supstance); nije destruktivan; manje je osetljiv od drugog tipa; odgovor detektora je proporcionalan koncentraciji.
Detektor na bazi termičke provodnosti (TCD)
Detektor na bazi termičke provodnosti (TCD)
Detektor na bazi termičke provodnosti ceo sistem je termostatiran vlakna se greju električnom strujom do iste temperature kada preko vlakna prelazi gas-nosilac, on hladi vlakno u zavisnosti od svoje termičke provodljivosti temperatura određuje otpor žice kada kroz vlakna protiče samo gas-nosilac, temperatura i otpor žice su uravnoteženi kada u struji gasa naiđe uzorak, komponenta koja se nalazi u uzorku ima različitu termičku provodljivost od gasa-nosioca tada se menja temperatura žice u tom kraku, a time i njen otpor neuravnoteženost otpora dve žice izaziva električni signal koji se registruje kao pik.
Detektor na bazi termičke provodnosti termičke provodljivosti gasa-nosioca i komponenti iz uzorka treba da budu što različitije organska jedinjenja imaju bliske vrednosti termičke provodljivosti N 2 je blizak organskim supstancama, dok su vrednosti H 2 i He znatno veće zato su H 2 i He znatno bolji nego N 2, kada je u pitanju katarometar kod N 2 je znatno smanjena osetljivost
Plameno-jonizujući detektor (FID) sagorevanje uzorka u plamenu H 2 -vazduh dobijaju se CHO + joni u plamenu joni se kreću ka katodi broj jona je proporc. broju C atoma ili molarnoj masi uzorka ne reaguje na neorganska jedinjenja ukljućujući N 2, okside azota, H 2 S, SO 2, CO, CO 2, H 2 O, a reaguje na sve organske supstance.
Plameno-jonizujući detektor (FID) gas-nosilac je vodonik plamen funkcioniše kao anoda između katode i anode postoji otpor, tj. nema toka struje kada nema jona koji bi tu struju prenosili smeša vodonika i uzorka dolazi do plamenika i H 2 gori u struji vazduha organska supstanca sagoreva u plamenu, pri čemu se formiraju joni njihovim kretanjem uspostavlja se struja koja se registruje kao signal ovaj detektor je veoma osetljiv (10-12 g/ml) skoro je univerzalan mana je što je skup i destruktivan
Izbor gasa-nosioca i brzine protoka kod TCD najbolji su H 2 i He zbog termičke provodljivosti mana vodonika eksplozivan mana helijuma skup kod FID vodonik je neophodan N 2 se može koristiti kao gas-nosilac, ali se H 2 mora dodati zbog sagorevanja protok gasa se reguliše redukcionim ventilom na 20-30 ml/min gas-nosilac mora proći kroz kolonu, a od otpora kolone zavisi pritisak koji će se primeniti protok tokom merenja mora biti konstantan i tačno definisan, posebno kada se vrši identifikacija komponenata na bazi retencionog vremena
t R Idealan detektor MASENI SPEKTROMETAR Univerzalan (registruje MS spektar) Osetljiv na 1-100 pg jedinjenja Brz (prikupljanje podataka znatno kraće od vremena eluiranja jedinjenja) Pouzdana kvalitativna analiza (MS i MS/MS) Pouzdana kvantitativna analiza (površina pika)
Rezime - razdvajanje u GC zavisi od: isparljivosti komponente (isparljivije brže) rastvorljivosti komponente (rastvorljivije sporije) polarnosti komponente i kolone (polarnije sporije) temperature kolone (veća temperatura-brže) brzine gasa (optimalna brzina) dužine kolone (duža kolona-duže putovanje)
PRIMENA GC razdvajanje kvalitativna analiza kvantitativna analiza preparativni rad prečišćavanje (kontrola čistoće)
Kvalitativna analiza osnov za identifikaciju je retenciono vreme retenciono vreme je karakteristično za određenu supstancu u određenoj koloni ako dve supstance imaju isto ili slično retenciono vreme, treba analizu proveriti sa drugim tipom kolone pouzdanija metoda za identifikaciju masena spektrometrija
Kvantitativna analiza površina ispod pika proporcionalna je koncentraciji odgovarajuće supstance najpre se formira kalibracioni dijagram Preparativni rad i prečišćavanje (Kontrola čistoće) cilj dobijanje čiste komponente za dalji rad kada se pojavi pik željene komponente, ona se na izlazu, kroz staklenu cevčicu, uvodi u suvi led i kondenzuje se