Replikacija DNK Replikacija DNK I. Opšte karakteristike replikacije: A. Semikonzervativni proces B. Replikacioni početak C. Bidirekcioni D. Semidiskontinuirani II. Identifikacija proteina i enzima replikacije III. Pregled mehanizma replikacije A. Inicijacija B. Dodavanje začetnika (prajmera) C. Elongacija D. Prufriding i terminacija 5 3 3 5 Idetične bazne sekvence Artur Kornberg Supstance neophodne za sintezu DNK 1) substrat- dezoksiribonukleozid trifodfati (dntp: datp, dctp, dgtp, i dttp) 2) DNK polimeraze 3) DNK lanac koji služi kao matrica (šablon) 3 5 3 5 Kako se DNK umožava? Kasnih1950-tih, predložena su tri moguća modela replikacije DNK Konzervativni model Oba roditeljska lanca ostaju zajedno posle replikacije Semikonzervative model Dvolančani molekul DNK sadrzi jedan stari i jedan novosintetisani lanac Disperzivni model Svaki novonastali lanac sadrži izmešane fragmente starog i novog 1
Enzimi i drugi proteini u replikaciji Polimeraze (5-3 ) Ligaza Nukleaze ( egzonukleaze i endonukleaze) Helikaze Topoizomeraze SSB proteini Proteini u replikaciji DNK Protein Tip ćelije Aktivnost/funkcija DNK polimeraza I Prokarioti Sinteza DNK; 3-5 egzonuklezna aktivnost(proofreading); 5-3 egzonukleazna aktivnost u uklanjanju prajmera; uloga u ekcizionoj reparaciji DNK polimeraza III Prokarioti Sinteza DNK; 3-5 egzonukleazna aktivnost(proofreading); DNK polimeraza α Eukarioti Sinteza jedarne DNK; formira kompleks sa primazom i počinje sintezu na 3 kraju prajmera na oba lanca; funkcija i u popravci DNK DNK polimeraza γ Eukarioti Sinteza mitdnk DNK polimeraza δ Eukarioti Sinteza jedarne DNK; sinteza vodećeg lanca; 3-5 egzonukleazna aktivnost(proofreading); DNK reparacija DNK polimeraza ε Eukarioti Sinteza jedarne DNK; Reparacija DNK DNK polimeraza β Eukarioti Reparacija DNK Proteini u replikaciji DNK Protein Tip ćelije Aktivnost/funkcija Primaza Oba Sinteza RNK prajmara Helikaza Oba Rasplitanje lanaca DNK kidanjem H veza SSB proteini Oba Stabilizacija ssdnk DNK topoizomeraze (tip I i tip II) Oba Tip I preseca jedan lanac i uklanja superspirilizaciju; tip II preseca oba lanaca i umeće negativne super zavoje u DNK DNK žiraza Prokarioti DNK topoizomeraza tipa II kod E. coli Prvi korak: otvaranje DNK heliksa Sinteza DNK počinje na replikacionom početku (ori-origin of replication) Bakterijski hromozom ima jedan ori Eukaritski hromozom ima više ori DNK ligaza Oba Formira fosfodiestarsku vezu između fragmenata DNK Inicijatorni proteini Oba Vezuje se za replikacioni početak i inicira odmotavanje DNK heliksa Telomeraza Eukarioti Kompleksi RNK i proteina; replikuju telomere hromozoma Biderekcioni proces Inicijacija replikacije Replikacioni početak kod E. coli se zove oric origin of Chromosomal replication Prvac kretanja replikacione viljuške oric karakteriše Bogat region AT parovima DNK A box Tromi lanac Vodeći lanac 2
Inicijacija replikacije- oric DNK replikacija se pokreće vezivanjem DNK A proteina za DNK A box DNK A sekvenca se savija oko DNK A proteina, a istovremeno dolazi do razdvajanja lanaca u regionu bogatom AT parovima DNK sekvenca oric SSB SSB Koriste energiju iz ATP-a za razdvajanje DNK heliksa Replikacija: 2 korak Nastanak novog DNK lanaca Dodavanje novih komplementarnih baza DNK polimeraza III SSB SSB DNA Polymerase III Nešto nedostaje Energija! Šta? Odakle energija za sintezu DNK lanaca? Energija za replikaciju ATP? Da li postoji način da se iz njega dobije energija? Naravno! Došli smo sa našom Sopstvenom energijom energija energija ATP GTP TTP CTP Modifikacija nukleotida Nukleotid za sintezu! ADP AMP GMP TMP CMP ATP GTP TTP CTP 3
Tromi i vodeći lanac Ograničenje DNA polimerase III Može samo da ugrađuje nukleotide na 3 kraj postojećeg lanaca Pravac replikacione viljuške Tromi lanac Okazaki fragmeti Spajanje pomoću ligaza enzim zavarivač ligaza DNK polimeraza III Okazaki Vodeći lanac Tromi lanac Vodeći lanac Kontinuirana sinteza RNK prajmer primase Početak DNK sinteze: RNK prajmer(začetnik) Smer replikacione viljuške Startna sekvenca za koju se veže DNA polimeraza III DNK polimeraza III primaza RNK Zamena RNK prajmera sa DNK DNK polimeraza I DNA polimeraza I Sve DNK polimeraze mogu ugrađivati nukleotide samo na kraj postojećeg lanaca DNK! Erozija hromozoma DNA polimeraza I Kolege, imamo PROBLEM! ligase growing replication fork Smer replikacione viljuške DNA polimeraza III RNA RNK Ali DNK polimeraza I može samo ugrađivati nukleotide na kraj postojećeg DNK lanca Na kraju gube se nukleotidi pri svakoj replikaciji Hromozomi postaju kraci posle svake replikacije ograničeni broj ćelijksih deoba? Telomere Ponovljive, nekodirajuće sekvence na krajevima hromozoma= zaštitna kapa Ograničenje ~50 deoba ćelija Model replikacije Smer replikacione viljuške telomeraza Telomeraza Enzim koji produžuju telomere može da dodaje DNK nukleotide na kraj i Različiti nivo aktivnosti u različitim tipovima ćelija Visoki nivo u matičnim i kancerskim ćelijama-- Zašto? TTAAGGG TTAAGGG 4
Preciznost replikacije Učestalost grešaka 10 9-10 10 ugrađenih nukleotida Mehanizmi odgovorni za preciznost replikacije: A. izbor odgovarajuće baze B. Korektivna (eng. proofreading) aktivnost DNK polimeraze MUTACIJE Izvor genetičke varijabilnosti i jedan od osnovnih faktora evolucije. Somatske i germinativne mutacije, Somatske mutacije se mogu ispoljiti u fenotipu osobe u kojoj se desila mutacija ali se ne prenose na potomstvo jer nisu zahvaćeni gameti. (npr. somatskih mutacija je boja očiju). Mutacije koje se dese u gametima se prenose na potomstvo. Direktna mutacija: promena divljeg gena u oblik koji dovodi do novog fenotipa. Reverzibilna mutacija: povratna direktna mutacija. Letalne (inkompatibilne sa životom) i subletalne mutacije (samo u određenim uslovima će se promena izraziti u fenotipu) npr.g6fd, u određenim uslovima teška anemija u odsustvo nekih agensa potpuno normalna krvna slika. Mutacije mogu biti recesivne ili dominantne U zavisnosti broja (količine) oštećenih baznih parova razlikuju se mikrolezije i makrolezije SUPSTITUCIJE Misens-mutacija :Supstitucija baznog para dovodi do supstitucije aminokiseline u polipeptidnom lancu primer HbS Valin umesto glutaminske kiseline. Nonsens-mutacija:Supstitucija baznog para dovodi pri transkripciji do besmislenog kodona na irnk (UAG, UGA, UAA) prevremeni prekid translacije. Razlikuju se dve vrste supstitucije: Tranzicija: Purin zamenjen Purinom Pirimidin zamenjen Pirimidinom (4 kombinacije) Transverzija: Purin zamenjen Pirimidinom Pirimidin zamenjen Purinom (8 kombinacije) Tautomerizacija je takođe jedna vrsta supstitucije koja dovodi do direktne mutacije, faktori koji prouzrokuju ove promene još nisu utvrđene adenin i citozin se iz aminoforme pretvaraju u iminoformu. Guanin i timin se iz keto-oblika pretvaraju u enolni oblik. DELECIJA (gubitak baznog para) INSERCIJA (povećanje broja baznih para) obe forme dovode do izmene genetske šifre od mesta događaja do kraja genskog lokusa. HEMIJSKI MUTAGENI (mogu da deluju na tri načina) 1) reaguju sa DNK i transformišu baze npr. azotasta kiselina koja transformiše baze iz aminoforme u keto-oblik: Adenin Hipoksantin (komplementaran citozinu) pri sledećoj replikaciji doćiće do izmene A-T G-C. Etil-metan-sulfonat transformiśe Guanin etil-guanin što će pri replikaciji dovesti do izmene G-C A-T. 2) deluju pri replikaciji (analoge baze), inkorporiraju se u DNK umesto jedne normalne baze npr. 5-brom-uracil umesto Timina, 5-brom-uracil se lako pretvara u enolni oblik koji se sparuje sa Guaninom A-T G-C. 2-aminopurin anlog Adeninu. 3) Akridinske boje (proflavin, akridin-oranž) umeću se između dve susedne baze i pri crossing over-u prouzrokuju duplikaciju ili deleciju nukleotida. FIZIČKI MUTAGENI Jonizujuće zraćeneje tj. svako zraćenje koje u toku interakcije sa šmaterijom može da izvri jonizaciju atoma i molekula. Postoji elektromagnetno zraćenje (X-zraci i γ-zraci) i korpuskularno zračenje (elektroni, protoni, α-zraci,...). Zraci pri ulasku i duž njihovog puta izbacuju elektrone iz atoma i molekula i izazivaju njihovu jonizaciju, jonizovani atomi i molekuli se razlažu na jone i radikale koji su extremno reaktivni i oni prouzrokuju oštećenja na makromolekulima. kombinacije sa bazama DNK greške u sparivanju pri replikaciji raskidaju veze između šećera i fosfata što dovodi do prekida na DNK. UV (nejonizujuće zraćenje) mala prodorna moć, oštećenja uglavnom na epidermisu, nemaju znaćaj za potomstvo jer se ne dešavaju u germinativnim ćelijama. dimerizacija timina - sprečava replikaciju ili dovodi do pogrešnog sparivanja. kod citozina usled slabljenja veze između 4. i 5. C-atoma omogućava vezivanje molekula vode što čini citozin nesposoban da formira vodonikove veze sa guaninom razdvajanje lanca DNK. BIOLOŠKI MUTAGENI Virusi RNK virusi- retrovirusi Fragilna mesta na hromozomima 1,5,13,16 i 17 Transpozoni L1 transpozon kada se premesti sa hromozoma 22 na X hromozom može uzrokovati hemofiliju 5
REPARACIJA DNK Spontana oštećenja DNK: 1. Deaminacija 2. Depurinacija REPARACIJA DNK Idukovanja oštećenja 1. UV zračenje 2. Alkilacija 3. Reakcija sa kancerogenima UV Ciklobutanski prsten A-T Hipoksantin - C Susedni timini u DNK Dimer timina Alkilacija G C O 6 -metilguanin T Posledice hemijskih modifikacija nukleotida Reakcija sa kancerogenom (npr. bezopiren) Guanin Adicija veće hemijske grupe na nukleotid Mehanizmi popravke oštećene DNK 1) Direktna reparacija Reparacija O 6 -metilguanina Dimer timina Svetlo (energija) Fotoliaza (fotoreaktivacijski enzim) O 6 -metilguanin- metiltransferaza prenosi metilnu grupu sa O 6 -metilguanina na cisteinski ostatak u aktivnom centru enzima 6
Ekciziona reparacija 2) Reparacija isecanjem baza Deaminacijom citozina nastaje U. Uracil DNK glikozidaza kida vezu uzmeđu U i DNK i nastaje AP mesto. Njega prepoznaje AP endonukleaza i fosfodiesteraza koja uklanja šećer i fosfat. Nastala pukotina se popunjava sa DNK polimerazom i na kraju ligaza poveže lance. Uzrezivanje U Ekciziona reparacija 3) Isecanje nukleotida Nukleaza prepoznaje pirimidinski dimer. Helikaza izrezuje oligonukleotide koji sadrže i dimer. Nastalu pukotinu popunjava DNK polimeraza i povezuje ligaza 4) Reparacija nesparenih nukleotida (mismatch) Pogrešno sparena baza Metilacija A u okviru GATC gde A prelazi u 6-metiladenozin. Mut S se veže za pogrešno sparenu bazu a zatim se veže i Mut L. Vezivanje Mut L aktivira Mut H da kida novi lanac nasuprot mesta metilacije. Mut S i Mut L sa egzonukleazom izrezuju deo lanca koji sadrži pogrešno sparenu bazu. Pukotina se popunjava pomoću DNK polimeraze i ligaze. NASLEDNI POREMEĆAJI UZROKOVANI NEFUNKCIONISANJEM REPARACIONIH MEHANIZAMA Kseroderma pigmentozum ( Xeroderma pigmentosum ) Blumov sindrom ( Bloom syndrome ) Fankonijeva anemija ( Fanconi anemia ) Ataksija sa telangiektazijom ( Ataxia telangiectasia ) Progeria adultum ( Werner syndrome ) Nasledni nepolipozni kancer kolona ( Linch syndrome) Trihotiodistrofija ( Trichotiodystrophia ) Kseroderma pigmentozum ( Xeroderma pigmentosum ) Nedostatak ekscizione reparacije Nasleđuje se autozomno recesivno, sedam gena ( A-G ) Genetska heterogenost Učestalost 1: 250 000 Osetljivost na ultravioletno zračenje ( sunčeva svetlost) Mnogobrojne promene na koži Maligniteti kože Abnormalnosti očiju i nervnog sistema Blumov sindrom ( Bloom syndrome ) Autozomno recesivno oboljenje Mutacije u BLM genu na hromozomu 15q koji kodira jednog člana RecQ porodice DNK helikaza. Učestalost 100 slučajeva od 1950.god Povećana učestalost razmene između sestrinskih hromatida ( za prenatalnu dijagnostiku) Hromozomska nestabilnost Prenatalni i postnatalni zastoj u rastu Usko lice Često eritem izazvan suncem na licu Predispozicija za leukemije, limfome i ostale tumore Nedostatak imuniteta Hiper- i hipo-pigmentisana područja na koži 7
Fankonijeva anemija ( Fanconi anemia ) Mutacije u FA genu vode deficijenciji ekscizione reparacije Identifikovana su tri FA gena: FAA na 16q, FAC na 9q i FAD na 3p Autozomno recesivno oboljenje U nekim populacijama učestalost 1 : 22 000 slučajeva Zastoj u rastu Deformacije skeleta ( npr.radius i palac) Insuficijencija koštane srži ( pancitopenija ) Deformacije bubrega Lokalizovane promene pigmentacije Predispozicije za leukemije i druge maligne bolesti Ataksija sa telangiektazijom ( Ataxia telangiectasia ) Deficijencija u kinazi koja kontroliše ćelijski odgovor na oštećenje DNK Mutacije u ATM genu na hromozomu 11q Autozomno recesivno oboljenje Učestalost 1 : 40 000-300 000 Cerebralna ataksija Nedostatak imuniteta Telangiektazije na koži i konjuktivama Predispozicija za tumore Ekstremna osetljivost na radijaciju Progeria adultum ( Werner syndrome ) Deficijencija helikaze Mutacija u WRN genu na hromozomu br. 8 koji kodira jednog člana RecQ porodice DNK helikaza. U nekim populacijama učestalost 3 : 1 000 000 Autozomno recesivno Znaci ubrzanog starenja počinju u pubertetu 49 godina Hutchinson-Gillford syndrome Autozomno dominantno ( Progeria ) Mutacija u genu LMNA na hromozomu 1 Nasleđuju se kao sveže mutacije u gametogenezi roditelja Učestalost 1 / 4-8 000 000 Znaci ubrzanog starenja javljaju se već sa 18-24 meseca života Prosečan životni vek je oko 13 godina Hutchinson-Gillford syndrome ( Progeria ) Nasledni nepolipozni kancer kolona Deficijencija mismatch reparacije ( Lynch syndrome) Autozomno dominantno Učestalost 1 : 200 sa predispozicijom za malignitete Mutacije u genima MLH1, MSH2, MSH6, PMS, PMS2 8
Trihotiodistrofija ( Trichotiodystrophia ) Deficijencija ekscizione reparacije Mutacije u genima TTDA, XPB, XPD Autosomno recesivno učestalost: 1-2 / 1 000 000 Mentalna retardacija Patuljast rast Kosa sa malom koncentracijom sumpora Osetljivost na UV zračenje Ne postoji povećan rizik od maligniteta trihotiodistrofija forma koja se zove Cocayne-sindrom REKOMBINACIJE Nove kombinacije naslednog materijala koje nisu posledica mutacija Modeli rekombinacije: 1. Homologa (opšta) rekombinacija- razmena homologih segmenata 2. Specijalizovana rekombinacija- ograničene na određene delove hromozoma. Posledice su insercije, delecije i inverzije. 3. Transpoziciona rekombinacija- mobilni elementi menjaju poziciju u DNK molekulu Rekombinacija kod virusa Istovremeno u ćeliji se nađe više tipova virusa! Rekombinacija kod prokariota Transformacija - prenos slobodnih fragmenata DNK Transdukcijaprenos fragmenata DNK pomoću vektora Rekombinacija kod prokariota Konjugacija Razmena naslednog materijala direktnim kontaktom 9
Rekombinacija kod prokariota Homologna rekombinacija Roditeljske DNK komplementarnim sparivanjem baza- Crossing over 1. Posle pucanja DNK heliksa dolazi do njihovog prespajanja 2. Razmena se može desiti bilo gde duž DNK molekula 3. Na mestu razmene jedan DNK molekul se veže za drugi. Veza se zove heterodupleks i duga je oko 1000 bp. 4. Rekombinacija se dešava precizno na principu komplementarnosti 5. Ne dolazi do izmene u redosledu nukleotida Roditeljske DNK sa prekidom u mestu sa lepljivim jednolančanim krajevima rekombinanti Ukršteno prespajanje komplementarnim sparivanjem baza Holidejev model homologne rekombinacije MOLEKULARNI MODEL REKOMBINACIJE PREDLOŽEN JE 1964 god. (Robin Holliday) 1. Nastaje urez (engl. nick) na oba roditeljska lanca 2. Lanci DNA delomično se razmotaju i izvrše nukleofilni napad na drugi molekul DNK 3. Dolazi do spajanja s komplementarnim neprekinutim lancem 4. Ligacija prekinutih lanaca stvara krstastu formaciju (Hollidayeva veza) Holidejova veza Urezivanje roditeljkse DNK Razmena lanaca Ligacija Rešavanje Holidejovog intermedijara a) Dva homologa DNK(dve hromatide) b) Zasecanje lanaca DNK c) Formiranje Holidejove petlje d) Nastanak heterodupleksa e) Holidejev intermedijar f) Vertikalno razrešavanje dobijaju se dva hibridna dvolančana molekula DNK sa medjusobno izmenjenim krajevima g) Horizontalno razrešavanje dobijaju se dva hibridna dvolančana molekula DNK sa izmenjenim središnjim jednolančanim delovima 10