ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI KATALAZE SPEKTROFOTOMETRIJSKOM METODOM (CAT100)

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI KATALAZE SPEKTROFOTOMETRIJSKOM METODOM (CAT100) 1. TEORETSKI DIO Katalaza je široko rasprostanjen enzim i sreće se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja dio antioksidativne zaštite organizma. Katalaza razlaže toksični vodikperoksid na molekul kisika i vodu. Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, svaki sadrži preko 500 aminokiselina. Sadrži četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju enzimu da reaguje sa vodikperoksidom. Zastupljen je gotovo kod svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i anaerobnih), biljaka, životinja do čovjeka. Kod čovjeka je široko zastupljenja posebno u ćelijama jetre u peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni ph za ljudsku katalazu je oko 7, dok kod ostalih organizama, u zavisnosti od vrste ph se kreće između 4-11. Ljudska katalaza djeluje na 37 C, dok kod nekih jednoćelijskih organizama optimalna temperatura djelovanja je 90 C. Osnovna uloga ovog enzima je razgradnja vodikperoksida. Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Iako kompletan mehanizam reakcije nije poznan, smatra se da reakcija teče u dva koraka: H 2 O 2 + Fe(III)-E H 2 O + O=Fe(IV)-E(.+) H 2 O 2 + O=Fe(IV)-E(.+) H 2 O + Fe(III)-E + O 2 Ovdje Fe () -E predstavlja centar željeza u grupi hema na koji je vezan enzim. Fe(IV)-E(.+) je mezomerna forma Fe(V)-E, što znači da željezo nije kompletno oksidirano to +V, ali dobija tzv. podržavajući elektron iz liganda hema. Ovaj hem je stoga označen kao radikalski katjon ( +). Vodikperoksid ulazi u aktivni centar, u interakciju sa aminokiselinama Asn 147 (asparagin na poziciji 147) i His74, što dovodi do toga se proton (hidrogen jon) prebacije između atoma kisika. Slobodni kisik koordinira, oslobađajući novonastalu molekulu vode i Fe(IV)=O. Fe(IV)=O reaguje sa slijedećim vodikperoksidom formirajući Fe(III)-E i proizvodeći vodu i kisik. Reaktivnost željeznog centra može biti poboljšana pomoću prisustva fenolatnog liganda na

Tyr357, koji može učestovovari u oksidaciji Fe(III) do Fe(IV). Ova reakcija se može poboljšati i pomoću interakacije His74 i Asn174 sa intermedijerima reakcije. Brzina reakcije se može determinirati pomoću Michaelis-Mentenove konstante. Katalaza može katalizirati i oksidaciju, pomoću vodikperoksida, različitih metabolite i toksina, kao što su formaldehid, mravlja kiselina, fenoli, acetilaldehid i alkoholi. Dešava se slijedeća reakcija, čiji mehanizam je i dalje nepoznat. H 2 O 2 + H 2 R 2H 2 O + R Joni teških metala (kao što su bakarni joni) mogu da se ponašaju kao nekompeticijski inhibitori katalaze. Otrovi, kao što su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snažno se vezuju za hem katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju. Kod čovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid. Glutationperoksidaza je u fiziološkim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je čak aktivnija od katalaze. Kada koncentracija vodikperoksida poraste uključuje se katalaza. Vodikperoksid zajedno sa superoksidnim anjonom (O 2- ), hidroksilnim radikalom (OH ) i singletnim kisikom spada u slobodne radikale kisika. Vodikperoksid je štetni produkt mnogih metaboličkih procesa, a da bi se spriječilo oštećenje ćelija i tkiva, mora se desiti brza konverzija u manje štetne materije. Stiga katalaza pomaže ćeliji da je ubrza dekompozicija vodikperoksida u manje reaktivan gasoviti kisik i molekulu vode. Biološki značaj nije uvijek opravdan, jer kod nekih vrsta miševa genetički nedostaje katalaza, što ukazuje da nekim organizmima ovaj eznim nije neophodan. Sa druge strane, nedostatak katalaze može povećati vjerovatnost razvoja diabetesa tipa 2. Katalaza se koristi u industriji hrane sa uklanjanja vodikperokdisa iz mlijeka prije proizvodnje sira. Može se koristiti i u tekstilnoj industiriji za uklanjanje vodikperoksida sa materijala. Katalaza test je jedan od tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju bakterija. Prisustvo enzima katalaze se detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije koje su katalaza-pozitivne dodavanjem vodikperoksida oslobađaju kisik. 2. EKSPERIMENTALNI DIO Reagensi Pufer za analizu 10x (A.B. 10x); 100 ml; šifra proizvoda: A 9725; Natrijumfosfatni puffer, 500 mm, ph 7,0 Hromogeni reagens; 1 vial; šifra proizvoda: C 5237

Otopina za prekid reakcije;100 ml; šifra proizvoda: S 5691; 15 mm natrijum-azid u vodi Pozitivna kontrola katalaze; 0,25 ml; šifra proizvoda: C 8362 iz goveđe jetre (EC 1.11.16. Kristalna suspenzija u vodi koja sadrži 0,1 % timol, 30-50 mg proteina po ml (Biuret), 3-10 x 10 6 jedinica po ml (kolorimetrijska analiza) 3% (w/w) otopina hidrogen-peroksida; 10 ml; šifra proizvoda: H 6520 Peroksidaza, 5 mg; šifra proizvoda: P 6782; Izolirana iz hrena (EC 1.11.1.7), bez prisustva soli; 800-1200 jedinica po mg otopine mjereno sa ABTS kao supstratom pri 25 C, pri ph 5,0 Pufer za razrijeđivanje enzima (EDB); šifra proizvoda E 5779; 50 mm natrijumfosfatni pufer, ph 7,0 koji sadrži 0,1 % TRITON X-100 Upotrijebiti vodu HPLC čistoće (0,055 Scm -1 ) vodu u svim slučajevima. Upute o pripremi nude reagense dovoljne za 25 kolorimetrijskih analiza plus kalibracionu krivu ili 20 UV analiza. Otopine supstrata i pufera treba čuvati na sobnoj temperaturi, a otopine enzima na 4 C. POSTUPAK 1x Pufer za analizu (A.B. 1x): Razblažiti sa vodom 2 ml pufera A.B. 10x na 20 ml (10 puta). Pufer A.B. 1x je 50 mm natrijum-fosfatni pufer, ph 7,0. Čuvati na sobnoj temperaturi. Otopina peroksidaze: Odvagati 1 mg čvrste peroksidaze i otopiti u 1,45 ml A.B. 1x. Otopina peroksidaze može se čuvati na 4 C do dvije sedmice. Reagens za razvijanje boje: 150 mm natrijum -fosfatni pufer, ph 7,0, sadrži 0,25 mm 4-aminoantipirin i 2 mm 3,5- dihlor-2-hidroksibenzensulfonsku kiselinu. Pripremiti 200 ml hromogene otopine. Pomiješati 60 ml pufera A.B. 10x sa 140 ml vode u čaši od 250 ml. Dodati 10 ml ovako razrijeđenog pufera u originalnu posudicu hromogenog reagensa (kat.br. C 5237) i miješati dok se potpu no ne otopi. Prebaciti hromogenu otopinu u čašu sa puferom i dobro promiješati. Podijeliti na odgovarajuće alikvote (po 30 ml) i čuvati na -20 C. Otopina je stabilna 12 mjeseci. Izbjegavati višestruko zamrzavanje-topljenje. Prije upotrebe pripremiti reagens za razvijanje boje dodavanjem 30 µl otopine peroksidaze na 30 ml hromogene otopine. Reagens za razvijanje boje može se čuvati na 4 C tri dana, ako je potrebno. Priprema standardne otopine katalaze: Katalaza je kristalna suspenzija u vodi, a kristali se talože na dnu posudice. Promiješati energično posudicu sa katalazom da se postigne homogena suspenzija i odmah ukloniti 20 µl suspenzije (preporučuje se pipetiranje mikro-pipetom nekoliko puta pipette up and down - prije uklanjanja suspenzije). Razblažiti seriju od po 20 µl suspenzije enzima 10000 puta (primjer ovakvog razrijeđivanja je razrijeđivanje 20 µl suspenzije enzima sa puferom za razrijeđivanje enzima (EDB) na 400 µl (1:20), zatim razrijeđivanje 20 µl prvobitno razrijeđene otopine 400 µl (1:400) i na kraju, razrijeđivanje 20 µl druge otopine na 500 µl 1:10 000). Za reakciju koristiti između 2-5 µl krajnje razrijeđene otopine. Dobro promiješati prije dodavanja u reakcionu smjesu.

Pripremiti kontrolu katalaze svježu svaki dan. Metoda je linearna u području od 0,25-3 jedinice po reakcionoj smjesi, u zavisnosti od trajanja reakcije. Otopina supstrata za kolorimetrijsku analizu (200 mm H 2 O 2 ): Koncentracija od 3 % H 2 O 2 (H 6520) je u granicama od 3-4 %. Prema tome, bitno je spektrofotometrijski odrediti tačnu koncentraciju i korigovati je na 200 mm prije upotrebe otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu u metodi. Razrijediti 200 µl 3 %- ne otopine H 2 O 2 (H 6520) na 1 ml pomoću A.B. 1x pufera. U cilju određivanja tačne koncentracije otopine supstrata, razrijediti 50 l gornje otopine na 1,00 ml (20 x) sa AB 1x puferom. Očekivana koncentracija je u granicama od 10-15 mm. Odrediti stvarnu koncentraciju preko UV apsorbanse, mjerenjem apsorbanse na 240 nm (za slijepu probu koristiti A.B. 1x pufer). Izračunati stvarnu koncentraciju H 2 O 2 pomoću Beer-ovog zakona (ε mm =0,0436): [H 2 O 2 ](mm) = A 240 /0,0436 Nivelirati konačnu koncentraciju otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu na tačno 200 mm sa A.B. 1x puferom. Standardizirana otopina supstrata za kolorimetrijsku analizu može se čuvati na 4 C 6 dana. Konačna koncentracija H 2 O 2 u ispitivanoj smjesi je 50 mm. 10 mm H 2 O 2 otopina: Ova otopina je za dobijanje kalibracionog pravca apsorbanse crvene kinon-iminske boje prema koncentraciji H 2 O 2. Razblažiti 200 µl standardizirane otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu (200 mm H 2 O 2 ) na 4 ml sa A.B. 1x puferom. Ova otopina može se čuvati na 4 C 6 dana. Otopina supstrata za UV analizu (20 mm H 2 O 2 ): Priprema volumena dovoljnog za 20 direktnih UV analiza. Razblažiti 200 µl 3 %-og H 2 O 2 (H 6520) na 10 ml sa A.B. 1x puferom. Odrediti stvarnu koncentraciju spektrofotometrijski kao u prethodno opisanom postupku. Nivelirati konačnu koncentraciju otopine supstrata za UV analizu na tačno 20 mm sa A.B. 1x puferom. Standardizirana otopina supstrata za UV analizu može se čuvati na 4 C 6 dana. Konačna koncentracija H 2 O 2 u ispitivanoj smjesi je 10 mm. Ova procedura omogućava reagense dovoljno za 100 testova. Priprema uzorka: Kada su uzorci pripremani razgradnjom deterdžentom ili hipotoničnim puferom, za razblaživanje uzoraka može se koristiti A.B. 1x pufer. Ako su uzorci pripremljeni u izotoničnom puferu koji održava peroksizome, razblažiti uzorak sa EDB puferom koji sadrži TRITON X-100. Ako je koncentracija proteina u uzorcima veoma niska (manja od 0,025 mg/ml), albumin goveđeg seruma (A 8022) se može dodati puferu u koncentraciji od 0,5 mg/ml za stabilizaciju enzima. Za biološke uzorke količina enzima (razblaženje i volumen) po reakciji moraju se odrediti. U tabeli 1 su dati primjeri razblaženja i volumena za različite primjere uzorke, koji se mogu koristiti kao smjernice. Iako se većina reakcija može izvesti za 1-5 minuta, reakciono vrijeme se može znatno produžiti kod analiza za niske aktivnosti katalaze. Prilikom analize ekstrakata tkiva količina katalaze će ovisiti o tome iz kojeg organa tkivo potiče. Najviša aktivnost je u jetri i bubrezima, a najmanja u vezivnom tkivu. Ekstrakti stanica iz kultura tkiva se često analiziraju bez razblaživanja. Produkti razgradnje krvi

pokazuju relativno veliki iznos aktivnosti, pa se prema tome trebaju odgovarajuće razblažiti. Tabela 1. Razrijeđenja uzoraka katalaze iz različitih izvora TKIVO Razrijeđenje otopine na zadanu vrijednost proteina Volumen dodan na reakcionu smjesu Reakciono vrijeme (min) Slijepa proba - - - Lizat čovječijih crvenih krvnih zrnaca Područje od ΔA 520 (slijepa proba-uzorak) po reakciji 1,20-1,32 (počevši od A 520 ) 0,2 mg/ml 2-6 µl 2 min 0,21-0,71 Lizat leukocita 2,0 mg/ml 2-4 µl 3 min 0,28-0,64 Lizat hepg2 2,0 mg/ml 2-4 µl 3 min 0,21-0,43 Lizat jetre pacova 0,3 mg/ml 5-10 µl 1 min 0,36-0,78 Lizat mozga pacova 0,7 mg/ml 10-20 µl 3 min 0,014-0,028 Lizat slezene pacova 0,3 mg/ml 5-10 µl 3 min 0,11-0,21 Lizat bubrega pacova 0,3 mg/ml 5-10 µl 3 min 0,28-0,57 Standard katalaze 10,000-puta 2-4 µl 1 min 0,36-0,71 Ako nema raspoloživih informacija o izvoru preporučljivo je da se napravi nekoliko razblaženja (1, 10, 20 i 50 puta razrijeđenija otopina) i pokrenuti reakciju od jedne minute sa 10 µl svakog razrijeđenja. Preporučene razrijeđene otopine trebale bi smanjiti koncentraciju hidrogen-peroksida u reakciji za 30 50 % za 1-5 minuta. Čuvanje/stabilnost Ovaj proizvod dostavlja se na ledu i preporučuje se čuvanje na 2-8 C. Kada se čuva zatvoren, komponente su stabilne 12 mjeseci. Procedura za kolorimetrijsku i UV analizu Katalaza ima mogućnost da razgradi hidrogen-peroksid preko dva različita reakciona puta. U prvom, poznatim kao katalazni put, dvije molekule hidrogen-peroksida se pretvaraju u vodu i oksigen (katalazna aktivnost): protein-fe 3+ + H 2 O 2 protein-fe 3+ -OOH + H 2 O (Primarni kompleks) protein-fe 3+ -OOH + H 2 O 2 protein- Fe 3+ -OH + H 2 O + O 2

Ukupna reakcija daje: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Primarni kompleks se može također razložiti po drugom reakcionom putu (peroksidazna razgradnja): protein-fe 3+ -OOH + AH 2 protein- Fe 3+ -OH + H 2 O + A gdje je AH 2 interni ili eksterni donor vodika. Alkoholi male molekulske mase se mogu koristiti kao elektron donori. Katalazni put je predominantan kada je koncentracija hidrogen-peroksida veća od 0,1 mm, a peroksidazni put je dominantan kada je koncentracija manja od 0,1 mm ili kad je supstrat alkil-peroksid. Procedura kolorimetrijske analize Ovaj metod analize se zasniva na mjerenju hidrogen-peroksidnog supstrata zaostalog nakon djelovanja katalaze. Najprije, katalaza pretvara hidrogen-peroksid u vodu i kisik (katalitički put), a zatim ova enzimatska reakcija se zaustavlja sa natrijum-azidom. Alikvot reakcione smjese se tada analizira za određivanje preostale količine hidrogenperoksida kolorimetrijskom metodom. U kolorimetrijskoj metodi se koristi supstituirani fenol (3,5 -dihloro-2-hidroksibenzen-sulfonska kiselina) koji se oksidativno spaja na 4- aminoantipirin u prisustvu hidrogen-peroksida i peroksidaze iz hrena (HRP) dajući crvenu kinoniminsku boju (N -(4-antipiril)-3-hloro-5-sulfonat-p-benzokinon-monoimin) koji apsorbira na 520 nm. Aktivnost katalaze se mjeri pri razblaženoj koncentraciji supstrata (H 2 O 2 ), pošto nije izvodivo zasititi enzim supstratom pri koncentraciji većoj od 1 M. Također, preko 100 mm H 2 O 2 dolazi do brze deaktivacije katalaze supstratom. Koncentracija H 2 O 2 koja se koristi u ovoj analizi (50 mm) omogućava mjerljiv signal, a da ne izaziva inaktivaciju enzima. Priprema standardne krive 1. Apsorbansa crvene kinoniminske boje prema količini H 2 O 2 (0,0125-0,075 µmol). Pripremiti seriju standardnih otopina uzimanjem 0, 125, 250, 500 i 750 µl otopine 10 mm H 2 O 2 u kivetama za mikrocentrifugu i dodavanjem A.B. 1x pufera do konačnog volumena od 1 ml. Miješati okretanjem. Tabela 2. Razrijeđenja za pripremu kalibracionog pravca hidrogen-peroksida Volumen 10 mm H 2 O 2 (µl) A.B. 1x pufer (µl) H 2 O 2 u standardnim otopinama (µmol) H 2 O 2 u reakcionoj smjesi (µmol) 0 1000 0 0 125 875 1,25 0,0125 250 750 2,5 0,0250 500 500 5,0 0,0500 750 250 7,5 0,0750

Napomena: Koncentracije H 2 O 2 prikazane u tabeli 2 zasnovane su na tačno 10 mm koncentraciji početne otopine. Vrijednosti trebaju biti korigirane na stvarnu koncentraciju H 2 O 2 određenu spektrofotometrijski (vidjeti pripremu 10 mm H 2 O 2 ). 2. Prebaciti alikvot od 10 µl od svake otopine u drugu kivetu i dodati 1 ml reagensa za razvijanje boje. Sačekati 15 minuta, a zatim očitati apsorbansu na 520 nm. Napomena: Serije standardnih otopina H 2 O 2 trebaju biti svježe pripremljene svaki dan. 3. Nacrtati standardnu krivu apsorbanse na 520 nm prema konačnoj količini H 2 O 2 u reakcionoj smjesi. Reakcija kolorimetrijske analize Reakcija za analizu izvodi se na sobnoj temperaturi (oko 25 C). Omogućiti da A.B. 1x pufer, otopina supstrata za kolorimetrijsku analizu (200 mm H 2 O 2 ) i reagens za razvijanje boje dostignu sobnu temperaturu. Enzimatska reakcija katalaze 1. Pripremiti uzorke kao što je predloženo u odjeljku priprema uzorka i dodati odgovarajući volumen (x µl) u mikrocentrifugalnu kivetu; 2. Dodati (75-x µl) A.B. 1x pufera u mikrocentrifugalnu kivetu; 3. Početi reakciju dodatkom 25 µl otopine supstrata za kolorimetrijsku analizu; 4. Miješati okretanjem i inkubirati 1-5 minuta; 5. Dodati 900 µl otopine za zaustavljanje reakcije, dobro zatvoriti i okrenuti kivetu; Tabela 3. Reakciona shema kolorimetrijske enzimatske reakcije katalaze Volumen uzorka A.B. 1x pufer Otopina 200 mm H 2 O 2 Slijepa proba 0 µl 75 µl 25 µl Uzorak x µl 75-x µl 25 µl Kolorimetrijska reakcija: 6. Uzeti 10 µl alikvota iz enzimatske reakcione smjese katalaze i prebaciti u drugu kivetu za mikrocentrifugu. Dodati 1 ml reagensa za razvijanje boje. Miješati okretanjem; Napomena: Izvesti ovaj korak u roku od 15 minuta od zaustavljanja enzimske reakcije. 7. Čekati najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi zbog razvijanja boje, a zatim mjeriti apsorbansu na 520 nm. Proračuni 1. Odrediti količinu H 2 O 2 (µmol) koja ostaje u kolorimetrijskoj reakcionoj smjesi upotrebom H 2 O 2 standardne krive. Npr. OD 520 od 1,4 je ekvivalentna sa 0,082 µmol H 2 O 2. A 520 (slijepa roba)= µmol H 2 O 2 u slijepoj probi

A 520 (uzorak)= µmol H 2 O 2 u slijepoj probi Δ µmol (H 2 O 2 )= µmol H 2 O 2 (slijepa proba)- µmol H 2 O 2 (uzorak) Δ µmol (H 2 O 2 ) je razlika količine H 2 O 2 dodane u kolorimetrijskoj reakciji između slijepe probe i datog uzorka. 2. Vrijednost iz prethodnog proračuna može se koristiti da se odredi aktivnost katalaze: Aktivnost (µmol/min/ml)=δµmol (H 2 O 2 )*d*100 / V*t Δ µmol (H 2 O 2 ) = razlika u količini H 2 O 2 dodanoj u kolorimetrijskoj reakciji između slijepe probe i datog uzorka d = razblaženje originalnog uzorka za reakciju katalaze t = vrijeme trajanja reakcije katalaze (minute) V = volumen uzorka u reakciji katalaze (x ml = 0,00x ml) 100 = razblaženje alikvota reakcije katalaze u kolorimetrijskoj reakciji (10 µl iz 1 ml) Procedura UV analize Ovaj postupak se također može koristiti za izvođenje brze i direktne UV analize. UV analiza je pogodna za uzorke katalaze koji su oslobođeni supstanci koje mogu interferirati pri mjerenju u UV području od 240 nm (vidjeti tablicu 5). Interferirajuće supstance, kao što su TRITON X-100 ili proteini, koji apsorbiraju u UV području, moraju biti prisutni u koncentracijama dovoljno niskim da bi se mogla mjeriti apsorbansa na 240 nm. Ova analiza omogućava spektrofotometrijsko praćenje opadanja apsorbanse hidrogenperoksida na 240 nm sa kinetičkim programom. Analiza se izvodi u kratkom vremenskom periodu (30 sekundi), zbog činjenice da je koncentracija H 2 O 2 (10 mm) mnogo niža od K M (1,2 M) sistema. Analiza reakcije se izvodi na sobnoj temperaturi (približno 25 C). Program za kinetiku ima sljedeće parametre: Početak mjerenja = nakon 3 sekunde Interval = 5 sekundi Očitanja = 7 Enzimatska reakcija katalaze (pogledati tabelu 3): 1. Pripremiti uzorak kao što je predloženo u odjeljku priprema uzorka, dodati odgovarajući volumen (x µl) u kvarcnu kivetu; 2. Dodati (500-x) µl A.B. 1x pufera u kvarcnu kivetu i miješati okretanjem; 3. Početi reakciju dodatkom 0,5 ml otopine supstrata (20 mm H 2 O 2 ) za UV analizu i miješati okretanjem; 4. Pratiti opadanje A 240 u roku od 30 sekundi pomoću programa za kinetiku. Napomene: Početna A 240 treba biti oko 0,500. Za slijepu probu koristiti pufer kojim je razrijeđivan uzorak. Koncentracija TRITON X-100 u ispitivanom uzorku ne smije preći udio od 0,02 %. Pouzdani detekcioni limit je 0,025 ΔA 240 /min., koji odgovara 0,575 µmol/min.

Tabela 4. Reakciona shema UV enzimatske reakcije katalaze Volumen uzorka A.B. 1x pufer 20 mm H 2 O 2 otopina Slijepa proba 0 500 µl 500 µl Uzorak x µl 500-x µl 500 µl Proračuni jedinice/ml = d = razblaženje originalnog uzorka za reakciju katalaze V = volumen uzorka u reakciji katalaze, (x µl = 0,00x ml) 0,0436 = ε mm za hidrogen peroksid 1 = volumen reakcione smjese u ml Definicija jedinice: Jedna jedinica katalaze razlaže 1,0 mol hidrogen-peroksida na oksigen i vodu u minuti, pri ph 7,0 na 25 C i koncentraciji supstrata od 10 mm hidrogen-peroksida. Napomena: Aktivnost određena UV analizom je približno jedna trećina od mjerenja sa kolorimetrijskom analizom. Razlog tome je razlika u koncentracijama supstrata (20 mm kod UV analize prema 50 mm u kolorimetrijskoj analizi). Dijagram kompatibilnosti Različiti spojevi mogu interferirati u analizama. Budući da je krv jedan od izvora za određivanje aktivnosti katalaze, antikoagulansi kao što su natrijum citrat, kalijum EDTA ili heparin su ispitivani na njihov efekat na analizu. Također, endogeni spojevi kao što su hemoglobin ili albumin imaju uticaja na analizu. Podrazumijeva se da je uzorak razblažen prije analize, ali u tkivima sa niskim sadržajem katalaze ove komponente mogu interferirati, zbog niskog faktora razblaženja. Uz to, može biti prednost u primjeni UV analize ako interferirajuće supstance jako utiču na kolorimetrijsku analizu.

Tabela 5. Efekti supstanci na kolorimetrijsku i UV analizu Supstance Askorbinska kiselina Albumin, goveđi Natrijum citrat Kolorimetrijska analiza 20 % inhibicije pri 20 µm Kompatibilno pri 50 mg/ml Kompatibilno pri 20 mm Trikalijum EDTA Kompatibilno pri 4 mm Hemoglobin Heparin Kompatibilno pri 0,8 mg/ml Kompatibilno pri 14 jedinica/ml Glukoza Kompatibilno sa 5 mm TRITON x-100 Konmpatibilno sa 0,5% UV analiza Kompatibilno do 100 µm Kompatibilno pri 1,5mg/mL Kompatibilno pri 5 mg/ml Kompatibilno pri 1 mm Kompatibilno pri 1 mg/ml Kompatibilno na 20 jedinica/ml Kompatibilno sa 50 mm Kompatibilno sa 0,02% Očekivana konc. u nerazrijeđenom uzorku 29 µm u RBC *, 77 µm u plazmi 35-50 mg/ml u krvi 10-14 mm u krvi 3,4 mm u krvi 120-180 mg/ml u krvi 1 jedinica/ml u krvi 17-44 mm u krvi Nije normalno prisutno 3. Rezultati Za pripremu kalibracionog pravca A = f(jedinice katalaze) koristiti standard katalaze 1:10 000, (objašnjenje dato u dijelu Priprema standardne otopine katalaze). Izvesti kolorimetrijsku reakciju sa 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 i 3,0 jedinice katalaze. A se dobije kada se od apsorbanse slijepe probe kolorimetrijska reakcija sa 200 mm H 2 O 2 bez prisustva katalaze (A blank ) oduzme apsorbansa standarda (A standard ), što odgovara razgrađenom H 2 O 2, odnosno aktivnosti katalaze. Kada se izmjeri A uzorka ( A uzorka = A blank - A uzorka ), iz jednačine kalibracionog pravca y = ax+b, gdje y odgovara A uzorka izračuna se broj jedinica katalaze (x) i preračuna na masu tkiva ili proteina. U tablicu upisati odgovarajuće podatke: Jedinice katalaze 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 A 1 A 2 A sr A (A blank - A sr )

OVJERA VJEŽBE