Analiza namirnica 37 APSORPIJA ZRAČENJA (Ultravioletna i vidljiva oblast) Kada zrak bele svetlosti prolazi kroz staklenu posudu ispunjenu tečnošću, intenzitet izlazne svetlosti je manji od intenziteta ulazne. To smanjenje intenziteta nije podjednako za elektromagnetne talase svih talasnih dužina: neki talasi apsorbovaće se više od drugih, tako da se spektri upadnog i propuštenog zračenja razlikuju, zbog čega tečnost izgleda obojena onom bojom koja odgovara spektru izlazne svetlosti. U Tablici 1 navedena su približna područja talasnih dužina vidljive svetlosti kojima se pripisuje određena boja, zajedno s njihovim komplementima (osnovna boja i njen komplement dopunjuju se do bele boje). Tablica je preuzeta iz National Bureau of Standards, USA (NBS). Ako zanemarimo refleksiju, boja rastvora u propuštenoj svetlosti uvek je komplement apsorbovane boje. Tako će rastvor, koji apsorbuje u plavoj oblasti, u propuštenoj svetlosti izgledati žut, a onaj koji apsorbuje zeleno, izgledati purpuran, itd. Za analitičara je od važnosti činjenica da je spektar apsorbovane svetlosti svojstvo supstance koja vrši apsorpciju. Rastvor koji sadrži hidratisani jon bakra (u 2+ ), apsorbuje žutu boju, a propušta plavu, pa se bakar u rastvoru može određivati merenjem stepena apsorpcije žute boje pod standardizovanim uslovima. Na taj način se u načelu može kvantitativno odrediti svaka obojena supstanca. Štaviše, ako je supstanca samo slabo obojena ili čak bezbojna, ona se ipak može odrediti ako joj se doda reagens koji će je pretvoriti u intenzivno obojeno jedinjenje. Na primer, dodatak amonijaka u pomenuti rastvor bakra intenzivira apsorpciju žute boje, pa on sam izgleda mnogo intenzivnije plav, što omogućuje osetljivije određivanje. Tablica 1. Boje spektra vidljive svetlosti Interval talasne dužine (nm) Boja Komplementarna boja 400-465 Ljubičasta Žutozelena 465-482 Plava Žuta 482-487 Zelenoplava Narandžasta 487-493 Plavozelena rvenonarandžasta 493-498 Plavičastozelena rvena 498-530 Zelena rvenopurpurna 530-559 Žućkastozelena rvenkastopurpurna 559-571 Žutozelena Purpurna 571-576 Zelenkastožuta Ljubičasta 576-580 Žuta Plava 580-587 Žućkastonarandžasta Plava 587-597 Narandžasta Zelenkastoplava 597-617 rvenkastonarandžasta Plavozelena 617-780 rvena Plavozelena
Analiza namirnica 38 Opšti naziv za hemijsku analizu koja se sprovodi merenjem apsorpcije zračenja bio bi apsorptometrija. Precizniji izraz kolorimetrija koristi se pri radu u vidljivoj oblasti spektra, dok se spektrofotometrija odnosi na upotrebu spektrofotometra. Sve što je rečeno u prethodnom primeru koji se odnosi na vidljivu oblast spektra važi takođe za njegov ultraljubičasti i infracrveni deo. Teorija Apsorpcija pri propuštanju monohromatskog zračenja kroz rastvor neke supstance kvantitativno je iskazana Lambert-Beerovim zakonom: P P P 0 dp = = P 0 k n Relativno smanjenje intenziteta upadnog zračenja (-dp/p) je proporcionalno (k=const) broju apsorbujućih molekula (n), koje zrak na svom putu sreće. Ovde P 0 označava intenzitet upadnog, a P intenzitet propuštenog zračenja. Izraz (1), iskazan u tzv. diferencijalnom obliku, integrisanjem i transformisanjem, dobija svoj upotrebni oblik: P0 1 log = log P T = A = a b c gde se T naziva transmitansa (ili %T=100 T propušteno zračenje kao procenat od upadnog), A apsorbansa, a je konstanta, b dužina puta zraka kroz rastvor, a c je koncentracija apsorbujućih molekula u rastvoru. (b x c je proporcionalno n!) Apsorbansa teorijski može da varira od 0 do. U praksi su apsorbanse čija je vrednost veća od 2 ili 3 skoro neupotrebljive, jer to znači da rastvor apsorbuje 99% (T=0,01), odnosno 99,9% (T=0,001) upadne svetlosti. Zbog potrebe za određenom preciznošću analitičke metode, interval upotrebljivih vrednosti apsorbanse je još uži, ali to, naravno, zavisi od korišćenog instrumenta za merenje intenziteta zračenja. Karakteristične veličine u apsorptometriji Konstanta "a" u izrazu (2) naziva se apsorptivnost. Ona je karakteristika konkretne kombinacije rastvarača i rastvorka pri zadatoj talasnoj dužini zračenja. U tom smislu možemo je grubo smatrati svojstvom supstance koja se analizira, za razliku od dužine (b), koncentracije (c), i apsorbanse (A), koje su sve karakteristike uzorka. Transmitansa (T=10 -A ) je veličina koju koristimo kada nas zanima propuštena svetlost. Na primer, bojeni filtri za kolorimetriju ili fotografiju često se dimenzionišu preko %T (procenta propuštene svetlosti). Ova veličina eksponencijalno opada s koncentracijom ispitivane supstance, pa je stoga za svrhe apsorptometrije pogodnija upotreba apsorbanse, čija je zavisnost od koncentracije (prema Lambert-Beerovom zakonu) linearna. Apsorptivnost (a) je veličina koja se koristi kada molekulska masa ispitivane supstance nije poznata, dok se molarna apsorptivnost (ε) koristi pri poređenju (1) (2)
Analiza namirnica 39 apsorpcije ekvimolarnih rastvora supstanci čije su molekulske mase poznate. Prema Lambert-Beerovom zakonu, apsorptivnost je konstanta nezavisna od koncentracije, dužine puta zraka kroz rastvor i intenziteta upadnog zračenja, jednom reči karakteristika supstance. Slika 1. Lambert-Beerov zakon Slika 2. Apsorpcioni spektar kalijumpermanganata u vodi. U intervalima A-F, B-E i -D molarna apsorptivnost (ε) ima vrednosti: 1750, 2300 i 2500. Iako iz Lambert-Beerovog zakona proizlazi linearna zavisnost apsorbanse od koncentracije, u nekim slučajevima (Sl. 1) se može zapaziti pozitivna (1) ili negativna (2) devijacija, što znači da apsorptivnost ipak nije potpuno konstantna. To, međutim, ne utiče na mogućnost korišćenja apsorptometrije u analitičke svrhe ukoliko se uz pomoć serije standarda snimi realna kalibraciona kriva. Prava vrednost apsorbanse uvek se odnosi na neku određenu talasnu dužinu. Međutim, kako praktični uređaji rade sa zračenjem koje prekriva neku užu ili širu oblast talasnih dužina, i apsorptivnost određena pomoću njih predstavlja srednju vrednost za tu oblast. Slika 2 prikazuje apsorpcioni spektar jona permanganata u vodi zavisnost njegove molarne apsorptivnosti (ε) od talasne dužine. Bilo bi poželjno raditi sa uskom trakom spektra (-D) i to pri maksimumu apsorpcije (oko 520 nm), što se može postići primenom skupog uređaja spektrofotometra. S druge strane, jeftiniji uređaji, namenjeni za rutinski rad kolorimetri, koji vrše izdvajanje talasnih dužina primenom bojenih filtara, rade sa znatno širim područjem talasnih dužina (npr. A-F), zbog čega su očito i manje osetljivi. Treba napomenuti da širina spektra upadne svetlosti ima direktnog uticaja na linearnost zavisnosti apsorbanse od koncentracije. Što je širina spektra upadne svetlosti veća, to je i veća verovatnoća odstupanja od Lambert-Beerovog zakona. I obrnuto, retko su registrovane devijacije pri primeni laserske svetlosti koja je potpuno monohromatska.
Analiza namirnica 40 Instrumenti Uređaji za merenje selektivne apsorpcije zračenja rastvorima, poznati su kao kolorimetri, apsorptometri ili spektrofotometri. Izraz kolorimetar, kako je pomenuto, rezervisan je za jednostavne vizuelne ili fotoelektrične uređaje, namenjene radu u vidljivoj oblasti spektra. Apsorptometri obuhvataju i kolorimetre, ali se mogu primeniti i na druge oblasti spektra. Spektrofotometri funkcionišu slično apsorptometrima, osim što rade sa znatno užim intervalom talasnih dužina, ostvarenim uz pomoć monohromatora. Navedene klase uređaja razlikuju se samo po stepenu složenosti, ali ne i suštinski. Kolorimetri Pre primene fotoelektričnih uređaja, kolorimetrijska analiza se obavljala isključivo vizuelnim putem. Mnoge od ovih metoda i dalje su u upotrebi zbog jednostavnosti, a tačnost od ±5%, koja se njima generalno postiže, dovoljna je za mnoge svrhe. Takvi vizuelni kolorimetri obično se nazivaju komparatorima, jer se intenzitet boje uzorka nepoznate koncentracije, upoređuje sa intenzitetom boje serije standardnih razređenja. Slika 4. Komparator s Nesslerovim cevima Slika 5. Duboscqov komparator Komparacija se može vršiti u Nesslerovim cevima: kalibrisanim epruvetama s ravnim poliranim dnom (Sl. 4). Nepoznati rastvor i razređenja standarda sipaju se u niz ovakvih epruveta do iste visine i sve postavi u specijalni stalak na mutno staklo kroz koje odozdo prodire difuzna bela svetlost. Boja se posmatra odozgo, kroz cevi, tako da je ovim načinom, moguće smestiti nepoznati uzorak (U) između dva standarda iz serije: po jednog s prvom intenzivnijom (S 1 ), odnosno prvom manje intenzivnom (S 2 ) bojom. Za njegovu koncentraciju se tada uzima srednja koncentracija između dva susedna standarda. Drugi, nešto složeniji uređaj je Duboscq-ov komparator (Sl. 5), kod koga je moguće varirati debljinu sloja uzorka, kroz koji svetlost treba da prođe do oka. Ova debljina se
Analiza namirnica 41 podešava sve dok se ne postigne izjednačenje vizuelnog utiska kroz uzorak (U) i standard (S). Tada se koncentracija nepoznatog uzorka može izračunati iz odnosa: b c = b' c' gde su b i b' - put svetlosti kroz standard, odnosno uzorak, a c i c' - koncentracija standada, odnosno uzorka. Fotoelektrični kolorimetri (filtar-fotometri) Primer ovakvog kolorimetra prikazan je na Sl. 6. Svetlost koja polazi iz kontinualnog izvora, deli se na dva snopa, prolazi kroz obojeni filter (koji propušta srazmerno širok spektar talasnih dužina) i pada na dve fotoelektrične ćelije proizvodeći u njima električni potencijal, čija je veličina proporcionalna intenzitetu upadne svetlosti. Ispred radne fotoćelije Slika 6. Šema fotoelektričnog kolorimetra se postavlja kiveta sa uzorkom, a druga fotoćelija je referentna. (Pošto intenzitet svetlosnog snopa varira od napona u električnoj mreži, ova varijacija se jednako odražava na obe fotoćelije.) U idealnom slučaju, kada ispred radne fotoćelije ne bi bilo kivete, obe fotoćelije bi pri jednakom osvetljavanju proizvodile isti električni potencijal. U realnom svetu dve fotoćelije nikada ne daju jednak električni odgovor, pa se pre početka rada one pomoću promenljivog otpornika uravnotežuju tako da između njih ne protiče nikakva struja. U praktičnom smislu to znači da kazaljku instrumenta koji meri struju između fotoćelija, a koji je direktno izbaždaren u %T, treba pomoću odgovarajućeg dugmeta doterati na vrednost 100 (100% transmitanse). To znači da u odsustvu uzorka uređaj propušta 100% svetlosti. (Obe fotoćelije primaju isti intenzitet svetlosti, struja između njih je nula.) Pri postavljanju kivete sa uzorkom u radni snop deo zračenja se apsorbuje, što rezultuje u manjem električnom potencijalu radne fotoćelije i remećenju električne ravnoteže: između dve fotoćelije poteče struja čiji se intenzitet očitava na instrumentu (na čijoj skali se direktno očitava %T ili A). Početna kalibracija na T=100% može se vršiti uz kivetu sa čistim rastvaračem, odnosno slepom probom (koja sadrži sve, osim obojene supstance), tako da se na ovaj način eliminišu uticaji nebitnih sastojaka na apsorpciju. Preciznost opisanih uređaja ne prelazi ±(3-4)%. Spektrofotometri Kod instrumenata iz ove klase koji su namenjeni za manuelan rad apsorpcija se pri svakoj talasnoj dužini meri prvo za slepu probu, pa onda za uzorak (Sl. 7).
Analiza namirnica 42 Slika 7. Šema funkcionisanja spektrofotometra Zrak iz svetlosnog izvora, na jednoj strani se direktno upućuje u referentnu fotoćeliju, a na drugoj, kroz kondenzator i ulazni prorez u fokusirajući uređaj. Taj zrak se potom razlaže na difrakcionoj rešetki pričvršćenoj za rotatabilni nosač, tako da se različite talasne dužine snopa izlazne svetlosti mogu usmeravati ka izlaznom prorezu i dalje, kroz kivetu sa uzorkom ili slepom probom, do radne fotoćelije. Uočljivo je postojanje dve fotoćelije, kao i kod kolorimetra sa slike 6. Ovakav sistem automatski kompenzuje fluktuacije intenziteta svetlosti izazvane variranjem napona u električnoj mreži. Postoje jeftiniji uređaji sa samo jednom fotoćelijom koji su, u srazmeri sa cenom, zbog toga nestabilniji i manje precizni. Spektrofotometar sa slike 7 može da radi i u vidljivoj i u ultraljubičastoj oblasti, uz promenu svetlosnog izvora i fotoćelije, što je danas najčešća izvedba. Donja granica u UV-oblasti je 165-210 nm (zavisno od svetlosnog izvora), a gornja je oko 650 nm (u vidljivoj), odnosno do 1000 nm (u bliskoj infracrvenoj oblasti). Tipična spektralna širina svetlosnog snopa je 10-20 nm. Složeniji uređaji, namenjeni za rad u široj oblasti spektra, pored difrakcione rešetke sadrže i dodatne filtre, odnosno prizme za efikasniju selekciju talasnih dužina zračenja, tako da rade sa spektralnim trakama, užim od 10 nm. Svi ovakvi uređaji rade i u vidljivoj i u UV-oblasti, što znači da im konstrukcija podrazumeva transparentnost u ultraljubičastoj oblasti (sočiva, kivete). Skuplje varijante ovakvih uređaja, namenjene automatskom snimanju apsorpcije uzoraka u širokoj oblasti talasnih dužina, snabdevene su odgovarajućim pogonom koji tokom rada ravnomerno rotira optičku rešetku i na odgovarajući način podešava ostale delove optičkog sistema, tako da se rezultat merenja dobija kao spektrogram zapis na pisaču.
Analiza namirnica 43 Primene apsorptometrije Kao što je navedeno, apsorpcija vidljivog i ultraljubičastog zračenja rezultat je interakcije zračenja s valentnim elektronima. Selektivna apsorpcija u nekom delu spektra može se očekivati od jedinjenja, koje ima slobodne elektronske parove ili nepopunjene niže elektronske ljuske. Razmotrimo, na primer, atom bakra, koji u elektronskim nivoima K, L, M i N sadrži 2, 8, 18 i 1 elektron. Njegov jednovalentni jon u + ima konfiguraciju 2, 8, 18, a dvovalentni, u 2+ : 2, 8, 17. Jon u 2+ se u vodenom rastvoru, gradeći kompleksno jedinjenje, koordinativno vezuje s ligandima koji imaju nepopunjen elektronski par (voda, amonijak, hlorni anjon, itd.). Konfiguracija takvog kompleksnog jona je: 2, 8, 17, 8. Dakle, najviši nivo (N) popunjen je stabilnim oktetom, ali u prethodnom nivou (M) ima 17 umesto 18 elektrona. Taj nepopunjeni elektronski nivo može da prihvati elektrone, pobuđene zračenjem, pa je u ovom slučaju to i razlog intenzivne plave boje jona u 2+ u rastvoru. Kod organskih jedinjenja, s druge strane, apsorpcija zračenja je vezana za postojanje relativno pokretnih elektronskih parova. Tako, potpuno zasićena jedinjenja ne pokazuju apsorpciju u vidljivom i ultraljubičastom delu spektra jer su atomi međusobno vezani čvrstim, kovalentnim σ-vezama. Jedinjenja koja sadrže izolovane dvostruke veze već jako apsorbuju u dalekoj UV-oblasti (195 nm za etilen). Međusobno konjugovanje dvostrukih veza čini njihove π-elektrone srazmerno pokretljivijim, tako da je potrebna manja energija za pobuđivanje molekula. Shodno tome, apsorpcija se pomera ka većim talasnim dužinama. Kod sistema od više konjugovanih dvostrukih veza, apsorpcija već ulazi u vidljivi deo spektra. Tako, na primer, β-karoten, sa sistemom od 11 konjugovanih dvostrukih veza, apsorbuje intenzivno između 420 i 480 nm, i stoga je sam žutozelene boje. Očigledno je da razvijenost sistema konjugovanih π-veza (dvostrukih i trostrukih) direktno doprinosi pokretljivosti elektrona, a samim tim i obojenosti jedinjenja (apsorpciji u vidljivom spektru), koja ih sadrže. Takav sistem se u nekom jedinjenju može prostirati i na ceo molekul i naziva se hromoforna grupa ili hromofor. Na primer, hemoglobin i mioglobin sadrže hromofornu grupu hem, u kojoj je nosilac boje kompleksno vezani jon gvožđa, dok ostatak molekula - proteinski deo - nije obojen i ne apsorbuje u vidljivom delu spektra. Talasna dužina pri kojoj jedinjenje maksimalno apsorbuje zračenje predstavlja sredstvo identifikacije hromoforne grupe u dotičnom molekulu. Pri tome se spektar u opštem slučaju unekoliko menja zbog prisustva različitih supstituenata na vodonikovim atomima hromoforne grupe (pomeranje maksimuma apsorpcije ka većim talasnim dužinama i promena vrednosti apsorbanse). Supstituenti sposobni da proizvedu takav efekat nazivaju se auksohromne grupe ili auksohromi. Dakle, auksohromi su modifikatori apsorpcionog ponašanja hromofora. U Tabeli 5 su ilustrativni primeri nekih tipičnih hromofora. Tu su navedeni i rastvarači u kojima je merenje vršeno, zbog toga što rastvarač menja fizičko polje oko molekula rastvorka utičući na energetsko stanje njegovih π-elektrona, što sve rezultuje u promeni talasne dužine maksimuma apsorpcije, ali ne i u promeni apsorptivnosti.
Analiza namirnica 44 Tabela 5 Reprezentativne hromoforne grupe λ max nm log ε Okten-3 Acetilen Aceton Diazoetilacetat Butadien Krotonaldehid Dimetilglioksi m Oktatrienol N N O N O N heksan 185 3,9 230 0,3 kao gas 173 3,8 heksan 188 2,9 279 1,2 etanol 252 3,9 371 1,1 heksan 217 4,3 etanol 217 4,2 321 1,3 etanol 226 4,2 etanol 265 4,7 Dekatetraenol [ ] etanol 300 4,8 4 Vitamin A [ ] etanol 328 3,7 5 Benzen heksan 198 255 3,9 2,4 Jedinjenje Hromofor Rastvarač 1,4- Benzohinon O O heksan 245 285 435 Naftalin etanol 220 275 314 5,2 2,7 1,2 5,0 3,7 2,5 Difenil heksan 246 4,3 U homologom nizu aromatskih jedinjenja benzenov prsten je najjednostavniji konjugovani sistem. Iz Tabele 5 se vidi da kondenzovanje ili konjugovanje još jednog prstena (naftalin, difenil) pomera maksimum ka većim talasnim dužinama. Tabela 6 prikazuje efekat nekih auksohroma na apsorpciju benzena.
Analiza namirnica 45 Tablela 6 Efekat auksohroma na benzenski hromofor Etilenska traka Bezenska traka Jedinjenje Rastvarač λ max (nm) log ε λ max (nm) log ε Benzen ikloheksan 198 3,90 255 2,36 Anilinijum jon Sirć. kis. 203 3,88 254 2,20 Hlorbenzen Etanol 210 3,88 257 2,23 Tiofenol Heksan 236 4,00 269 2,85 Fenol Voda 210,5 3,79 270 3,16 Anilin Voda 230 3,93 280 3,16 Fenolat jon Alkalni vodeni rastvor 235 3,97 287 3,42 Hinoidni prsten je mnogo efikasniji hromofor od benzenovog, što se može videti na primeru promene boje kiselo-baznog indikatora fenolftaleina (slika 9): Slika 9. Promena boje fenolftaleina u zavisnosti od ph rastvora. U kiselom rastvoru konjugacija ne prelazi granice individualnih benzenovih prstenova, izuzev što je jedan prsten konjugovan s karbonilnom grupom. Stoga ovaj oblik apsorbuje u UV-oblasti, ali ne i u vidljivoj, pa sam izgleda bezbojan. U baznoj sredini, rezultujući anjon sadrži jedan prsten, konvertovan u odgovarajući hinon, a konjugovani sistem se sada preko centralnog ugljenikovog atoma proteže i na ostala dva prstena. eo molekul postaje hromofor, jako apsorbuje u vidljivoj oblasti i stoga sâm ima crvenu boju.
Analiza namirnica 46 Kvalitativna analiza Ultraljubičasti i vidljivi apsorpcioni spektri pružaju korisne informacije o strukturi organskih jedinjenja. Selektivna apsorpcija je retko u toj meri karakteristična, da bi se na osnovu nje moglo nesumnjivo identifikovati neko konkretno jedinjenje, pa ipak ona može da posluži za isključivanje alternativa. Na primer, nepostojanje značajne apsorpcije u intervalu od 270-280 nm nepobitan je dokaz da jedinjenje ne sadrži benzenov prsten. Ako apsorpcije nema od 210 nm pa do vidljive oblasti, jedinjenje sigurno ne sadrži nezasićen konjugovani sistem. Ako se, pak, transparentnost produžava sve do 180 nm, onda u jedinjenju nema ni izolovanih dvostrukih veza. Slični zaključci mogu se donositi na bazi apsorpcionih maksimuma različitih hromofora. Kvantitativna analiza Kvantifikovanje apsorbujuće supstance u rastvoru može se izvesti direktnom primenom Lambert-Beer-ovog zakona, tj. merenjem apsorbanse pri maksimumu apsorpcije dotičnog jedinjenja. Treba voditi računa o tome da u rastvoru nema ometajućih supstanci koje bi značajno apsorbovale pri istoj talasnoj dužini. Stoga je važan deo skoro svake fotometrijske analize prethodno prečišćavanje uzorka. Ukoliko se primenjuje neka rutinska, poznata metoda, za koju je od ranije utvrđeno važenje Lambert-Beerovog zakona, onda je dovoljno da se apsorbansa uzorka nepoznate koncentracije uporedi sa standardom. Pri razvijanju nove metode je, međutim, neophodno da se prethodno u to uverimo snimajući standardnu (kalibracionu) krivu pomoću serije standardnih rastvora ispitivane supstance. Kako je već pomenuto, supstance koje ne sadrže hromofore (i ne apsorbuju svetlost u značajnoj meri) ipak se mogu odrediti fotometrijski posle reakcije sa specifičnim reagensom, pri čemu se hromofor stvara u količini, proporcionalnoj količini ispitivane supstance. Zapravo ovakva situacija je verovatno najčešća, pa stoga u literaturi postoji niz uputstava za prevođenje neobojenih jedinjenja u obojene derivate u cilju njihovog kvantitativnog određivanja fotometrijskim putem. Aditivnost apsorbansi Prema Lambert-Beerovom zakonu apsorbansa je proporcionalna broju apsorbujućih entiteta koje zrak sreće na svom putu. Pri tom se nigde ne naglašava da ti entiteti moraju biti iste vrste. Stoga, ako imamo u rastvoru više hromofora koji apsorbuju u istoj oblasti spektra, važi: n A = A = b što znači da je apsorbansa aditivno svojstvo. 1 i Aditivnost apsorbansi leži u osnovi uobičajenog merenja apsorpcije uzorka prema tzv. slepoj probi ili rastvaraču, čime se vrši korekcija zbog eventualne apsorpcije koju ispoljavaju nebitni sastojci uzorka, odnosno nečistoče u rastvaraču. n 1 a c i i
Analiza namirnica 47 Na ovaj način, iz ukupne apsorpcije rastvora dve komponente može se odrediti jedna komponenta ako je poznata apsorpcija, odnosno koncentracija druge komponente. Na sličan način se u rastvoru može odrediti više komponenata, ukoliko su poznati njihovi pojedinačni spektri apsorpcije. Određivanje je sve tačnije što su maksimumi apsorpcije pojedinih komponenata više razdvojeni. Opisanom metodikom se, na primer, merenjem apsorpcije pri 3 talasne dužine određuje u mesu koncentracija pigmenata koji nastaju kao rezultat reakcija mioglobina. Diferencijalna spektrofotometrija Pri standardnoj proceduri pripreme uređaja za analizu skala instrumenta na kome se očitava intenzitet propuštene svetlosti podešava se na oba kraja. U odsustvu propuštene svetlosti (u mraku) podešava se jedan kraj skale (%T=0), a zatim, pri svetlosti propuštenoj kroz čist rastvarač (ili slepu probu), podešava se drugi kraj (%T=100). Na taj način se svaki efekat uzorka na transparentnost rastvora smešta u interval transmitanse od 0 do 100% (A = - 0). Opisani standardni postupak nije uvek podesan, naročito onda kada se radi u blizini jednog od dva kraja skale, na primer, ako je transmitansa standarda 10%, a ispitivanog uzorka 7%. Zbog toga se gubi na preciznosti merenja, jer se za očitavanje koristi samo deseti deo skale instrumenta. Desetostruko povećanje tačnosti postiglo bi se ako bismo gornju granicu transmitanse podesili prema standardu, umesto prema čistom rastvaraču (slepoj probi). Tada bi ispitivani uzorak pokazao transmitansu od 70%. Analognu situaciju imamo i kod vrlo slabo obojenih rastvora: na primer, kada je %T standarda 90, a uzorka 93. I tada se za merenje koristi samo deseti deo skale. U ovom slučaju tačnost očitavanja se povećava desetostruko ako se podešavanje donje granice transmitanse (%T=0) ne izvrši u mraku (pri potpunom odsustvu svetlosti), već prema standardu. Dva navedena primera omogućavaju da se opisani postupak uopšti i da se oba kraja skale podese prema standardnim rastvorima, odabranim tako da se koncentracija ispitivanog uzorka nađe između njih. Bilo koju oblast transmitanse, na primer, između 30 i 35%, možemo podesnom kalibracijom razvući na celu skalu (0-100%). Naglasimo da kod nekih uređaja nije moguće izvršiti ovakvu korekciju skale. Upravo obrnutu situaciju imamo kada kod jeftinijih uređaja radimo u blizini granice osetljivosti fotoćelije. (Fotoćelija proizvodi električni napon samo kada je obasja svetlost iz ograničenog intervala talasnih dužina!) Tada će se često desiti da se gornji kraj skale instrumenta (potpuno osvetljena fotoćelija) ne može doterati na T=100%, već na neku nižu vrednost %T aktuelno. Merenje (doduše, sa smanjenom tačnošću) ipak možemo izvesti, ako registrovanu transmitansu uzorka (T uzorka reg ) preračunamo na procentualni deo od T aktuelno : T uzorka stvarno = T uzorka reg 100 % T aktuelno
Analiza namirnica 48 Fotometrijska titracija Pri konvencionalnoj titrimetriji, završna tačka se utvrđuje na osnovu promene boje indikatora, što često postaje netačno u razređenim rastvorima, u veoma obojenim rastvorima ili ako se boje dva oblika indikatora malo razlikuju. Ukoliko se titracija vrši u kiveti fotometra i pri maksimumu apsorpcije boje indikatora, onda se završna tačka može objektivno utvrditi kao prelom na grafiku: apsorbansa dodata zapremina tečnosti. Pribor za fotometrijsku titraciju često se nudi kao dodatak uz spektrofotometar i obuhvata: titracionu ćeliju, biretu, mešalicu, a često su ovi dodaci tako spregnuti da se dodavanje tečnosti i merenje apsorbanse vrše automatski, a tok titracije registruje na pisaču u vidu grafika.