1. Sistemi za kontrolu kvaliteta proteina, molekularni šaperoni i proteazom

1. Sistemi za kontrolu kvaliteta proteina, molekularni šaperoni i proteazom Proces ekspresije gena koji kodiraju proteine nije završen prevođenjem informacije sadržane u irnk u redosled aminokiselina polipeptidnog lanca. Da bi postao funkcionalan (biološki aktivan), novosintetisani polipeptidni lanac mora da pretrpi određene promene odgovorne za sazrevanje (obradu) funkcionalnog proteina (slika 1), koje obuhvataju nekovalentne interakcije i posttranslacione kovalentne modifikacije. Većina promena koje trpi novosintetisani polipeptid ostvaruje se nekovalentnim interakcijama (slika 1). One podrazumevaju savijanje polipeptida u jedinstvenu trodimenzionalnu nativnu strukturu, vezivanje kofaktora neophodnih za aktivnost proteina i asembliranje proteina sa drugim subjedinicama ukoliko je protein deo multisubjediničnog kompleksa. Slika 1. Sazrevanje funkcionalnog proteina. Da bi novosintetisani protein postao funkcionalan, pored prostornog savijanja često trpi i posttranslacione kovalentne modifikacije, a ostvaruje i nekovalentne interakcije sa drugim molekulima (partner-proteini sa kojima ispoljava biološku ulogu). 1

Mnogi proteini trpe i posttranslacione kovalentne modifikacije na tačno određenim aminokiselinama (slika 1). Do danas je poznato preko sto različitih tipova kovalentnih modifikacija, a najčešće su: glikozilacija, fosforilacija, acetilacija, ubikvitinacija i sumoilacija. Reverzibilne posttranslacione modifikacije proteina su način da ćelija kontroliše aktivnost samog proteina. Na primer, mnogi proteini se aktiviraju fosforilacijom specifičnog aminokiselinskog ostatka, a njegovom defosforilacijom se inaktiviraju. Postoje i drugi proteini koji se defosforilacijom aktiviraju i fosforilacijom inaktiviraju (npr. protein Rb). Informacija neophodna za sve nabrojane korake sazrevanja funkcionalnog proteina sadržana je u redosledu aminokiselina, primarnoj strukturi polipeptidnog lanca koji se sintetiše na ribozomima. 1.1. Kotranslaciono prostorno savijanje polipeptidnog lanca Reakcija prostornog savijanja proteina (eng. folding) je obično veoma brza i dešava se za par sekundi ili kraće, a započinje pre završetka sinteze proteina na ribozomima. Rastući polipeptidni lanac stiče sekundarnu i tercijarnu strukturu još dok izlazi kroz kanal za izlaz polipeptida u velikoj subjedinici ribozoma. Navedeno ukazuje da se proces prostornog savijanja rastućeg polipeptidnog lanca odvija uporedo sa njegovom sintezom (slika 2). Slika 2. Kotranslaciono prostorno savijanje polipeptida. Prostorno savijanje proteina dešava se neposredno nakon translacije. Ono započinje još tokom napuštanja velike subjedinice ribozoma. Prvo se prostorno savija N-kraj, dok se C-kraj još uvek sintetiše. U trenutku kada dođe do hidrolize novosintetisanog polipetida iz peptidil-trnk, oslobođeni polipeptid je već stekao najveći deo svoje konformacije, ali ona nije finalna funkcionalna konformacija. 2

Tokom miliona godina evolucije aminokiselinska sekvenca proteina nije bila selektovana samo za trodimenzionalnu stukturu koju može da zauzme, već i za sposobnost brzog prostornog savijanja još u trenucima kada rastući polipeptidni lanac izlazi iz ribozoma. Smatra se da je ova osobina bila kritična za evoluciju multidomenskih proteinskih struktura, naročito kod eukariota. 1.1.1. Brza i spora faza prostornog savijanja polipeptida Formiranje nativne trodimenzionalne strukture proteina odvija se kroz brzu i sporu fazu. Tokom brze faze prostornog savijanja polipeptidni lanac stiče grubu trodimenzionalnu strukturu. Ova faza povezana je sa procesom translacije. Kako jedan proteinski domen multidomenskog proteina izlazi iz ribozoma, on u roku od nekoliko sekundi stiče kompaktnu strukturu koja sadrži većinu finalne sekundarne strukture ( helikse i ploče), uređene na način koji je vrlo sličan finalnoj tercijarnoj konformaciji. Nastala otvorena i fleksibilna struktura polipeptida se naziva izlivena (eng. molten) globula. U odnosu na finalnu trodimenzionalnu strukturu izlivena globula je otvorena i manje uređena (slika 3). Za sintezu polipeptida prosečne veličine potrebno je nekoliko minuta, dok je za stvaranje forme izlivene globule potrebno nekoliko sekundi. To potvrđuje da se brza faza formiranja prostorne konformacije proteina, koji je time stekao najveći deo svoje nativne konformacije, odvija još tokom sinteze samog polipeptida. Slika 3. Brza i spora faza prostornog savijanja oslobođenog novosintetisanog proteina: a) forma izlivene globule; b) finalna trodimenzionalna struktura proteina. U formi izlivene globule jedan od heliksa prisutan u finalnoj strukturi je parcijalno formiran, dok svi heliksi sadže pocepane krajeve. Brzo formirana forma izlivene globule je početna tačka za relativno spor proces prostornog podešavanja mnogih bočnih lanaca, što za rezultat ima sticanje finalne trodimenzionalne konformacije proteina. Ova spora faza odvija se nakon procesa translacije. Često je potpomognuta aktivnošću proteina poznatih kao molekularni šaperoni ili molekularni pratioci. 3

1.1.2. Izloženi hidrofobni regioni predstavljaju kritičan signal za kontrolu kvaliteta proteina Kada se protein savija u kompaktnu strukturu, hidrofobni ostaci zauzimaju unutrašnjost proteina. Pored toga, između različitih delova molekula uspostavlja se veliki broj nekovalentnih interakcija. Skup svih energetski najpovoljnijih uređenja određuje finalnu konformaciju proteina sa najmanjom slobodnom energijom (tercijarnu strukturu proteina). Protein koji ima izložen hidrofobni region znatne veličine na svojoj površini obično je neispravan. Hidrofobni regioni proteina teže da stupe u međusobnu interakciju stvarajući proteinske agregate (slika 4). Parcijalno odmotani proteini, odnosno proteini kojima je delom narušena sekundarna i tercijarna struktura označavaju se i kao parcijalno denaturisani proteini, dok su proteini koji su kompletno odmotani označeni kao denaturisani proteini. Ovakvi proteini ne samo da nisu korisni za ćeliju, već mogu biti i opasni. Mnoge neurodegenerativne bolesti, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, odlikuju se prisustvom proteinskih agregata u neuronima koji podležu degeneraciji. Slika 4. Hidrofobni regioni proteina su uzrok mogućeg nastanka proteinskih agregata. Stvaranje proteinskih agregata je štetno za ćeliju jer su proteini agregata nefunkcionalni i kao takvi mogu imati i toksični efekat na ćeliju. 1.2. Ćelijski mehanizmi za kontrolu kvaliteta proteina nakon njegove sinteze Ćelija je razvila mehanizme za kontrolu kvaliteta proteina koji pomažu proteinima da zauzmu ispravnu prostornu konformaciju i otklanjaju nekompletno ili pogrešno savijene proteine, prepoznajući izložene hidrofobne regione (slika 5). 4

Novosintetisani proteini nekada mogu da se saviju na ispravan način i da sami asembliraju sa partner-proteinima u multisubjedinične komplekse. U ovom slučaju proteini stiču finalnu konformaciju bez dodatne pomoći. Nekompletno savijeni proteini bivaju prepoznati od strane molekularnih šaperona, posebne klase proteina uz čiju je pomoć savijanje proteina efikasnije. Molekularni šaperoni pokušavaju da poprave" neispravno savijene proteine dajući im novu šansu da se ispravno saviju. U isto vreme, pokrivajući hidrofobne nizove ciljnih proteina, molekularni šaperoni privremeno sprečavaju formiranje štetnih proteinskih agregata. Kada pokušaji ponovnog savijanja proteina ne uspeju, aktivira se dodatni mehanizam: nepravilno ili nekompletno savijeni proteini se potpuno degraduju proteolizom. Proteolitički put počinje prepoznavanjem hidrofobnih nizova na površini proteina i na kraju takav protein biva prebačen u mašinu za razgradnju proteina, poznatu kao proteazom. Ovaj proces je zavistan od ubikvitinskog sistema za obeležavanje proteina, koji takođe ima centralnu funkciju i u razgradnji nekih ispravno savijenih proteina čija je funkcija regulisana njihovom degradacijom. Pokazano je da više od trećine novosintetisanih polipeptidnih lanaca biva selektovano za brzu degradaciju kao rezultat delovanja sistema za kontrolu kvaliteta proteina. Slika 5. Ćelijski mehanizmi za kontrolu kvaliteta sintetisanih proteina. Neki proteini stiču finalnu konformaciju bez pomoći drugih molekula, dok drugim proteinima u tome pomažu molekularni šaperoni. Nepravilno ili nekompletno savijeni proteini potpuno se degraduju proteolizom. 5

1.3. Molekularni šaperoni Molekularni šaperoni su posebna klasa proteina uz čiju je pomoć prostorno savijanje mnogih proteina efikasnije. Šaperoni se prolazno vezuju za nesavijene ili agregirane proteine i to za izložene hidrofobne površine. Svojom aktivnošću olakšavaju pravilno savijanje proteina. Uloge molekularnih šaperona su da: 1) spreče agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih polipeptida i tako im omoguće savijanje u nativnu konformaciju, 2) omoguće udruživanje polipeptida u funkcionalno aktivne oligomerne komplekse, 3) dovedu do dezagregacije, odvijanja i ponovnog savijanja u biološki aktivan oblik onih proteina koji su već agregirani i/ili parcijalno denaturisani, 4) omoguće transport proteina kroz biološke membrane u odvijenom obliku, a bez neželjenih interakcija sa drugim proteinima (šaperoni su neophodni i pre i posle transporta, zato što protein mora ostati u odvijenoj formi pre transporta, a kasnije zahteva pomoć šaperona da bi zadobio nativnu konformaciju na svom odredištu), 5) omoguće degradaciju nepovratno denaturisanih proteina (slika 6). Slika 6. Uloga molekularnih šaperona. Nakon translacije neki proteini sponatno zauzimaju ispravnu konformaciju (1), dok drugi proteini zauzimaju nepravilnu konformaciju (2). Takvi proteini svoju finalnu trodimenzionalnu stukturu zauzimaju uz pomoć molekularnih šaperona (3). U uslovima stresa česta je pojava da se već pravilno savijeni proteini parcijalno odmotavaju (4). Molekularni šaperoni omogućavaju degradaciju nepovratno denaturisanih proteina (5). Pored toga, molekularni šaperoni sprečavaju da se novosintetisani proteini pogrešno saviju (6) ili formiraju agregate (7). Dezagregacija već formiranih proteinskih agregata moguća je delovanjem molekularnih šaperona (8). 6

Molekularni šaperoni spadaju u grupu proteina toplotnog šoka (eng. Heat-shock proteins, Hsp), proteina čiji se nivo sinteze drastično povećava nakon kratkog izlaganja ćelije povišenim temperaturama (npr. sa 37 C na 42 C). Povećani nivo sinteze molekularnih šaperona pri povišenim temperaturama je odgovor ćelije na povećan nivo pogrešno prostorno savijenih proteina usled delovanja povišene temperature. Molekularni šaperoni bi takvim denaturisanim proteinima trebalo da pomognu da ponovo zauzmu ispravne prostorne konformacije. Eukariotske ćelije poseduju dve glavne familije molekularnih šaperona označene kao Hsp60 i Hsp70. Različiti članovi familija proteina Hsp60 i Hsp70 funkcionišu u različitim organelama. Tako, mitohondrije sadrže sopstvene proteine Hsp60 i Hsp70 koji se razlikuju od onih u citosolu, dok savijanje proteina u endoplazmatičnom retikulumu pomaže član familije Hsp70, označen kao BIP. Članovi familija proteina Hsp60 i Hsp70 odlikuju se sledećim zajedničkim osobinama: 1) pokazuju afinitet za izložene hidrofobne nizove pogrešno savijenih proteina, 2) predstavljaju ATP-aze (enzime koji katalizuju hidrolizu ATP-a) koje se vezuju za pogrešno savijene polipeptide i slobodnom energijom hidrolize ATP-a utiču da pogrešno savijeni protein proba da zauzme nativnu konformaciju, odnosno savlada energetsku barijeru za prelaz iz denaturisanog/agregiranog stanja u ispravno savijeni protein, i 3) svoju funkciju u pomaganju proteinima da se saviju ostvaruju sa malom grupom pridruženih pomoćnih proteina. Ove dve familije proteina Hsp deluju u različitim vremenskim periodima života proteina, a razlikuju se i po mehanizmu ostvarivanja svoje funkcije. Članovi familije Hsp70 stupaju u interkaciju sa rastućim polipeptidima tokom njihove translacije i novosintetisanim polipeptidima nakon njihovog oslobađanja sa ribozoma. Njihova uloga je da se vežu za hidrofobni peptidni segment i oslobode ga na ATP-zavisan način u odvijenoj konformaciji. Savijanje se zatim dešava bilo spontano ili posredstvom članova familije Hsp60. Članovi familije Hsp60 ne stupaju u interakciju sa rastućim polipeptidima, već deluju kasnije u toku života proteina. Molekularni šaperoni familije Hsp70 deluju kao pojedinačni proteini koji se vezuju za ciljni protein pomažući mu da zauzme pravilnu konformaciju. Molekularni šaperoni familije Hsp60 formiraju velike oligomerne strukture u čiju izolovanu unutrašnjost ulazi ciljni protein. Familija molekularnih šaperona Hsp60 poznata je i pod nazivom šaperonini, a njihovi pomoćni proteini kao ko-šaperonini. 1.3.1. Familija molekularnih šaperona Hsp70 Familija molekularnih šaperona Hsp70 deluje rano u životu mnogih proteina, odnosno u periodu pre nego što protein bude oslobođen sa ribozoma (slika 7). Molekularni šaperoni ove familije prepoznaju niz od približno sedam hidrofobnih aminokiselina na površini polipeptida, sa ciljem da spreče nasumičnu agregaciju rastućeg polipeptida i pomognu mu da zauzme nativnu konformaciju. 7

Slika 7. Molekularni šaperoni familije Hsp70. Molekularni šaperoni familije Hsp70 vezuju se za interaktivne regione proteina još dok se on sintetiše, sprečavajući nasumičnu agregaciju. Regioni proteina se zatim oslobađaju kako bi uspostavili interkacije na odgovarajući način i zauzeli ispravnu konformaciju. Za ciljni protein se prvo vezuje pomoćni protein Hsp40, a zatim monomer Hsp70 u kompleksu sa ATP-om (Hsp70-ATP). Protein Hsp70 ima ATP-aznu aktivnost i vrši hidrolizu ATP-a u ADP, podležući konformacionoj promeni koja mu omogućava da se čvršće veže za ciljni protein. Faktor za razmenu nukleotida, protein GrpE, uklanja nastali ADP, što uzrokuje da protein Hsp40 prvo napusti formirani kompleks, a zatim disocira i Hsp70. Ponovljeni ciklusi vezivanja i oslobađanja proteina Hsp40 i kompleksa Hsp70-ATP pružaju šansu ciljnom polipeptidu da ponovo proba da zauzme ispravnu konformaciju. 1.3.2. Familija molekularnih šaperona Hsp60 (šaperonini) Familija molekularnih šaperona Hsp60 deluje kasnije tokom života proteina, nakon što je on kompletno sintetisan. Proteini ove familije formiraju oligomernu strukturu u obliku bureta, koja u trenutku kada obavlja svoju funkciju stupa u interakciju sa pomoćnim proteinom, čija je struktura u obliku kape. Struktura bureta je izgrađena od 14 monomernih jedinica proteina GroEL, organizovanih u dva heptamerna prstena koji su naslojeni jedan na drugi u suprotnoj orijentaciji, tako da su polovine strukture bureta simetrične (slika 8). Centralna šupljina bureta je na sredini, preko C- krajeva monomernih jedinica GroEL, podeljena na dve simetrične šupljine, a sami C-krajevi zalaze u ove šupljine. Strukturu kape formira sedam monomernih jedinica pomoćnog proteina GroES (Hsp10). Struktura kape je sa jedne strane udubljena, tako da kada ona stupi u interakciju sa strukturom bureta i zatvori jednu od dve centralne šupljine, značajno se povećava zapremina same šupljine (slika 8). 8

Slika 8. Molekularni šaperoni familije Hsp60. Struktura bureta formirana je od proksimalnog i distalnog prstena koji predstavljaju oligomerne komplekse proteina GroEL. Strukturu kape formiraju pomoćni proteini GroES. Savijanje proteina vrši se u proksimalnom prstenu oligomernog kompleksa GroEL i zahteva prisustvo ATP-a. Oslobađanje supstrata i kape zahteva hidrolizu ATP-a. U svakom ciklusu samo jedna polovina simetričnog bureta, odnosno jedan naslojen prsten, stupa u interakciju sa ciljnim proteinom. Opšte uzev, može se govoriti o dva naslojena prstena koji čine strukturu bureta: onaj prsten koji je aktivan i asociran sa kapom označava se kao proksimalni, dok se onaj koji je u tom trenutku neaktivan označava kao distalni (slika 8). Familija šaperona Hsp60 prepoznaje hidrofobne regione mnogih pogrešno savijenih proteina, kao što su denaturisani proteini ili nepravilno savijeni, upravo sintetisani proteini, koje dovodi familja šaperona Hsp70. Naime, šaperoni Hsp70 pomažu savijenje rastućeg polipeptida. Međutim, ako on ne zauzme pravilnu konformaciju, nakon oslobađanja takvog proteina od ribozoma, šaperoni Hsp70 ciljni protein dovode do mašinerije Hsp60, čime on dobija novu šansu da zauzme ispravnu konformaciju. Stoga, dve familije molekularnih šaperona, Hsp70 i Hsp60, formiraju mrežu kooperirajućih proteina. Vezivanje ciljnog proteina ostvaruje se interakcijom između hidrofobnih regiona ciljnog proteina i hidrofobnih regiona proteinskih ostataka monomera GroEL, koji su izloženi u šupljini jednog prstena. Takođe, svaka monomerna jedinica GroEL vezuje i po jedan molekul ATP-a. Prsten koji je vezao ciljni protein i molekule ATP-a postaje proksimalni prsten. Struktura kape, zatim, zatvara otvor proksimalnog prstena, pri čemu samo vezivanje kape indukuje konformacione promene proksimalnog prstena, što za posledicu ima povećanje zapremine šupljine proksimalnog prstena. Ove promene parcijalno odmotavaju (privremeno istežu) ciljni protein. Istovremeno, oni regioni monomera GroEL koji su stupili u interakciju sa ciljnim proteinom sada uspostavljaju interakcije i sa kapom GroES, čime se ciljni protein oslobađa. Oslobođeni ciljni protein u izolovanoj hidrofilnoj unutrašnjosti proksimalnog prstena dobija novu šansu da zauzme pravilnu konformaciju. Nakon otprilike 15 sekundi, dolazi do hidrolize ATP-a i oslobađanja ciljnog proteina, bez obzira na to da li se savio ili nije, i ciklus se ponavlja. 9

Hidroliza ATP-a u proksimalnom prstenu menja osobine distalnog prstena na takav način da sada distalni prsten može da veže ATP i novi ciljni protein. Ovo uslovljava i oslobađanja kape i ciljnog proteina iz proksimalnog prstena. Mašinerija Hsp60 ovim ulazi u novi ciklus, s tim da prsten koji je u prethodnom ciklusu bio distalni sada postaje proksimalni, i obrnuto. 1.4. Proteazom mašinerija za degradaciju proteina Ćelija poseduje mehanizme kojima može brzo da otkloni posledice grešaka prilikom translacije i pogrešno savijene proteine. Krajnja mašinerija za razgradnju proteina u eukariotskim ćelijama je ATP-zavisna proteaza, nazvana proteazom. U eukariotskim ćelijama proteolitička degradacija proteina vrši se i u lizozomima. Lizozomi najčešće degraduju protein nespecifično. To su organele okružene membranom koje sadrže pedesetak hidrolitičkih enzima, uključujući i proteaze (katepsine). Proteazomi čine do 1% ukupnih ćelijskih proteina u svim do sada ispitivanim ćelijama. Lokalizovani su u nukleusu i citoplazmi, a neki su asocirani sa membranama endoplazmatičnog retikuluma u različitim ćelijskim tipovima. Proteazomi se u uslovima gladovanja mogu detektovati u lizozomima koji predstavljaju mesta njihove razgradnje. Holoenzim 26S proteazom sastoji se od 20S jezgra proteazoma čija su oba kraja asocirana sa 19S kapama. Jezgro proteazoma je u obliku cilindra u čijoj unutrašnjosti se degraduje protein, dok 19S kape prepoznaju, vezuju i odmotavaju proteine obeležene za degradaciju, omogućavajući im da uđu u šupljinu jezgra (slika 9). Struktura 20S proteazoma predstavlja centralni cilindar (bure) koji je izgrađen od 4 međusobno naslojena prstena (slika 10). Svaki prsten je sačinjen od sedam subjedinica koje se dele u dve grupe: α subjedinice, koje čine dva spoljašnja prstena i proteolitički su neaktivne, i β subjedinice, koje formiraju dva unutrašnja prstena, a tri od njih su proteolitički aktivne. Uloga 20S proteazoma je razgradnja polipeptida. Proteolitički aktivne β subjedinice pripadaju familiji N-terminalnih hidrolaza, čija proteolitička aktivnost zavisi od N-terminalnog ostatka treonina, koji ima ulogu nukleofila i ključan je za katalitičku aktivnost. Aktivna mesta proteaza nalaze se na površini unutrašnje šupljine 20S cilindra (slika 10). 19S kape funkcionišu kao regulatorne kapije na ulazu u šupljinu 20S cilindra. Predstavljaju multiproteinske komplekse sastavljene iz dvadesetak polipeptida, koji formiraju poklopac i pod. Poklopac 19S kape selektivno prepoznaje i vezuje proteine obeležene za degradaciju. Pod 19S kape razmotava protein i usmerava ga u centralnu katalitičku šupljinu 20S proteazoma. Najmanje šest proteina poda, smeštenih blizu ivica cilindra, ima ATP-aznu aktivnost kojom se proteini obeleženi za degradaciju odmotavaju i ubacuju u unutrašnju šupljinu 20S cilindra. 10

Slika 9. Proteazom mašinerija za degradaciju proteina. Holoenzim 26S proteazom sastavljen je iz jezgra, predstavljenog 20S proteazomom, čije obe strane asociraju sa po jednom 19S kapom, koje prepoznaju, vezuju i odmotavaju proteine obeležene za degradaciju. Kapa ima svoj poklopac i pod. Poklopac prepoznaje proteine označene za degradaciju, a pod ih usmerava ka centralnoj šupljini. Slika 10. Jezgro proteazoma. Jezgro proteazoma predstavlja centralni cilindar kog formiraju četiri prstena. Svaki prsten sastoji se od sedam subjedinica. Spoljašnje prstenove obrazuju α subjedinice, a dva unutrašnja prstena obrazuju β subjedinice. Tri β subjedinice su proteolitički aktivne, a aktivna mesta ovih proteaza nalaze se na površini unutrašnje šupljine 20S cilindra (obeležene crvenim tačkicama na slici levo). Ključna osobina proteazoma, koja ga razlikuje od jednostavnih proteaza i koja je jedan od razloga za složenost ove strukture, jeste da on predstavlja procesivnu mašineriju: jednostavne proteaze hidrolizuju supstrat samo na jednom mestu pre nego što disociraju od supstrata, dok proteazom drži supstrat vezan dok ga celog ne razgradi do kratkih polipeptida dužine 4 do 10 aminokiselina. Za razliku od tipičnih proteaza, 20S proteazom omogućava raskidanje velikog broja peptidnih veza, posedujući višestruke proteolitičke aktivnosti u jednoj proteolitičkoj odaji. 11

1.5. Obeležavanje proteina za degradaciju Sa nekoliko izuzetaka, proteazom deluje na proteine koji su specifično obeleženi za degradaciju kovalentno vezanim većim brojem kopija proteina, koji se naziva ubikvitin. Ubikvitin je relativno mali protein izgrađen iz 76 aminokiselina. Opisan je 1975. godine kao vrlo zastupljen, visoko konzerviran protein, zbog čega je i dobio naziv ubikvitin. Predstavlja jedan od najkonzerviranijih proteina koji se u samo 3 aminokiseline razlikuje između kvasca i čoveka. Ubikvitin postoji u ćeliji u slobodnoj formi ili je kovalentno vezan za veliki broj različitih unutarćelijskih proteina. Za mnoge od tih proteina obeležavanje ubikvitinom je signal za njihovu degradaciju u proteazomu. Veći broj aktiviranih ubikvitina vezuje se za protein i nastali niz međusobno povezanih ubikvitina, označen kao poliubikvitinski lanac, predstavlja signal za degradaciju proteina u proteazomu. Da bi se konjugovao sa ciljnim proteinom, ubikvitin prvo mora biti aktiviran. Aktivacija ubikvitina se odvija kroz nekoliko koraka (slika 11). Slika 11. Obeležavanje proteina za degradaciju. Obeležavanje proteina za degradaciju vrši se malim proteinima ubikvitinima. Da bi se protein obeležio za degradaciju ubikvitin se aktivira enzimom za aktivaciju ubikvitina (E1). Aktivirani ubikvitin se sa enzima za aktivaciju reakcijom transesterifikacije prebacuje na enzim za konjugaciju ubikvitina (E2). Protein E2 nalazi se u kompleksu sa jednim od članova familije proteina E3. Funkcionalni kompleks E2-E3 naziva se ubikvitin ligaza. Protein E3 prepoznaje signal za degradaciju na ciljnom proteinu. Ubikvitin vezan za E2 prebacuje se na specifični lizinski ostatak ciljnog proteina. Jednom kada je ciljni protein mono-ubikvitiran, poliubikvitinski lanac se formira kroz iste ubikvitin-konjugacione kaskade. Multiubikvitinski lanac na ciljnom proteinu je ono što prepoznaju kape proteazoma. 12

Prvi korak u aktivaciji ubikvitina je njegovo vezivanje za protein E1, nazvan i enzim za aktivaciju ubikvitina (eng. ubiquitin activating enzyme). Karboksilna grupa C-terminalnog Gly ubikvitina se vezuje za specifični cisteinski ostatak proteina E1 visokoenergetskom tioestarskom vezom. Reakcija zahteva prisustvo ATP-a i uključuje stvaranje intermedijera u kome je ubikvitin kovalentno vezan za AMP. Aktivirani ubikvitin se zatim u reakciji transesterifikacije prebacuje sa cisteinskog ostatka proteina E1 na cisteinski ostatak proteina E2, nazvanog enzim za konjugaciju ubikvitina (eng. ubiquitin conjugating enzyme). Protein E2 nalazi se u kompleksu sa jednim od članova familije proteina E3. Funkcionalni kompleks E2-E3 se naziva ubikvitinligaza i odgovoran je za prepoznavanje i obeležavanje ciljnog proteina poliubikvitinskim lancem. Protein E3 prepoznaje i vezuje se za specifičan signal za degradaciju na ciljnom proteinu. Protein E2 pomaže u formiranju ubikvitin-proteinskog konjugata. Naime, ubikvitin vezan za cisteinski ostatak E2 prebacuje se na specifični lizinski ostatak ciljnog proteina. U ponovljenim reakcijama formira se poliubikvitinski lanac vezan za određeni lizinski ostatak ciljnog proteina. U poliubikvitinskom lancu, C-kraj svakog ubikvitina se vezuje za specifični lizinski ostatak na poziciji 48 prethodnog ubikvitina, čime se formira linearni niz konjugata ubikvitin-ubikvitin. Do 50 ubikvitinskih molekula može biti vezano za ciljni protein. Poliubikvitinski lanac na ciljnom proteinu je ono što prepoznaje specifičan receptor na proteazomu. U ćelijama sisara postoji oko 30 različitih, ali strukturno sličnih proteina E2, i nekoliko stotina različitih proteina E3, koji formiraju komplekse sa specifičnim proteinima E2. Ovo znači da se ubikvitin-proteazomski sistem sastoji od mnogo različitih, ali slično organizovanih proteolitičkih puteva, koji imaju zajednički protein E1 na početku puta i proteazom na kraju, a razlikuju se u ubikvitin-ligazama i pomoćnim faktorima. Različite ubikvitin-ligaze prepoznaju različite signale za degradaciju i time deluju na različite vrste unutarćelijskih proteina. Proteolitički put koji prepoznaje i razgrađuje abnormalne proteine u ćeliji bi morao da pravi razliku između kompletnih proteina koji imaju pogrešnu konformaciju i mnogih rastućih polipeptida na ribozomima ili onih koji su se upravo oslobodili od ribozoma, a koji još nisu stekli svoju finalnu konformaciju. Ovo nije jednostavan problem i pokazano je da ubikvitinproteazomski sistem prepoznaje i razgrađuje neke rastuće i novosintetisane polipeptide ne zato što su oni abnormalni, već zato što trenutno prikazuju signal za degradaciju u koracima sticanja svoje trodimenzionalne strukture. Ovo povećava mogućnost da normalni i inače dugoživeći, ali rastući (pa samim tim konformaciono nezreli) proteini mogu biti smatrani od strane ubikvitinproteazomskog sistema kao oštećeni, sve dok proteini ne zauzmu svoje finalne konformacije. Zato je savijanje novosintetisanih proteina u kinetičkoj kompeticiji sa putevima koji ih obeležavaju za degradaciju. Šaperoni, uključujući i članove familije Hsp70, imaju važnu ulogu ne samo u savijanju novosintetisanih proteina, već i u kompeticiji procesa njihove degradacije ubikvitin-proteazomskim sistemom. Uloga ubikvitin-proteazomskog sistema nije samo u tome da prepozna i eliminiše proteine koji imaju pogrešnu trodimenzionalnu strukturu ili druge greške. Ovaj sistem reguliše nivo, a 13

time i funkciju određenih proteina, kroz kontrolu njihove degradacije. Naime, usled promenjenih uslova ili stanja ćelije, koncentracija nekih proteina mora biti brzo promenjena. 1.6. Regulacija ekspresije gena na nivou degradacije proteina Kontrola funkcije nekih proteina ostvaruje se kroz regulaciju njihove degradacije. Takvi proteini mogu biti kratkoživeći proteini (proteini koji se sve vreme brzo degradaju) ili kondicionalno (uslovno) kratkoživeći proteini (proteini koji su metabolički stabilni pod određenim uslovima, dok su pod drugim uslovima nestabilni). Na primer, mitotički ciklini su stabilni tokom celog ćelijskog ciklusa, sve do trenutka prelaska iz metafaze u anafazu, kada dolazi do njihove brze degradacije. U ćeliji postoji čitav niz mehanizama kojima se kontroliše regulisana razgradnja proteina koji se mogu podeliti na dva opšta puta indukovane degradacije proteina: aktivacija ubikvitin-ligaze i aktivacija signala za degradaciju na ciljnom proteinu. 1.6.1. Regulisana razgradnja proteina aktivacijom ubikvitin-ligaze Ovaj način kontrolisane razgradnje proteina ostvaruje se aktivacijom specifičnog proteina E3, čime se formira nova specifična ubikvitin-ligaza. Aktivacija E3 može da se ostvari na veći broj načina (slika 12). Slika 12. Aktivacije ubikvitin-ligaza. a) fosforilacijom specifičnog aminokiselinskog ostatka pomoću neke proteinske kinaze; b) alosteričkom aktivacijom usled vezivanja nekog malog molekula (liganda); c) alosteričkom aktivacijom usled dodavanja proteinske subjedinice. 14

1.6.2. Regulisana razgradnja proteina aktivacijom signala za degradaciju Kao odgovor na unutarćelijske ili sredinske signale protein može da ispoljava signal za degradaciju, što za posledicu ima njegovu brzu ubikvitinaciju i razgradnju u proteazomu. Slično aktivaciji ubikvitin-ligaza, i aktivacija signala za degradaciju može se ostvariti na više načina (slika 13). Slika 13. Aktivacija signala za degradaciju. a) fosforilacijom specifičnog ak ostatka na proteinu, čime se otkriva do tada sakriven signal za degradaciju; b) regulisanom disocijacijom proteinske subjedinice, i c) snažan signal za degradaciju može nastati kidanjem određene peptidne veze. Snažan signal za degradaciju može nastati raskidanjem određene peptidne veze, čime se formira novi N-kraj, kojeg specifičan protein E3 prepoznaje kao destabilišući N-kraj. N- terminalni signal za degradaciju posledica je pravila N-kraja po kome je in vivo poluživot proteina zavisan od N-terminalnog aminokiselinskog ostatka. Kvasac S. cerevisiae ima 12 destabilišućih N-terminalnih aminokiselina (Arg, Lys, His, Phe, Leu, Tyr, Trp, Ile, Asp, Glu, Asn i Gln). Svaku od njih prepoznaje specifična ubikvitin ligaza, koje su konzervisane od kvasaca do čoveka. Kontrolisana razgradnja proteina ima veliku ulogu u procesima regulacije ćelijskog ciklusa degradacijom ciklina, programirane ćelijske smrti, stečenog imunskog odgovora obradom peptida antigena, itd. 15

Ključni koncepti Da bi novosintetisani protein postao funkcionalan, pored prostornog savijanja često trpi i posttranslacione kovalentne modifikacije, a ostvaruje i nekovalentne interakcije sa drugim molekulima (partner-proteini sa kojima ispoljava biološku ulogu). Informacija neophodna za sve nabrojane korake sazrevanja funkcionalnog proteina sadržana je u redosledu aminokiselina (primarnoj strukturi) polipeptidnog lanca koji se sintetiše na ribozomima. Formiranje nativne trodimenzionalne strukture proteina odvija se kroz brzu i sporu fazu. Tokom brze faze prostornog savijanja polipeptidni lanac stiče grubu trodimenzionalnu strukturu. Nastala otvorena i fleksibilna struktura polipeptida se naziva izlivena globula. Brzo formirana forma izlivene globule je početna tačka za relativno spor proces prostornog podešavanja mnogih bočnih lanaca, što za rezultat ima sticanje finalne trodimenzionalne konformacije proteina. Ćelija je razvila mehanizme za kontrolu kvaliteta proteina koji pomažu proteinima da zauzmu ispravnu prostornu konformaciju i otklanjaju nekompletno ili pogrešno savijene proteine, prepoznajući izložene hidrofobne regione. Molekularni šaperoni su posebna klasa proteina uz čiju je pomoć prostorno savijanje mnogih proteina efikasnije. Šaperoni se prolazno vezuju za nesavijene ili agregirane proteine i to za izložene hidrofobne površine. Svojom aktivnošću olakšavaju pravilno savijanje proteina. Uloge molekularnih šaperona su da: 1) spreče agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih polipeptida i tako im omoguće savijanje u nativnu konformaciju, 2) omoguće udruživanje polipeptida u funkcionalno aktivne oligomerne komplekse, 3) dovedu do dezagregacije, odvijanja i ponovnog savijanja u biološki aktivan oblik onih proteina koji su već agregirani i/ili parcijalno denaturisani, 4) omoguće transport proteina kroz biološke membrane u odvijenom obliku, a bez neželjenih interakcija sa drugim proteinima (šaperoni su neophodni i pre i posle transporta, zato što protein mora ostati u odvijenoj formi pre transporta, a kasnije zahteva pomoć šaperona da bi zadobio nativnu konformaciju na svom odredištu), 5) omoguće degradaciju nepovratno denaturisanih proteina. Eukariotske ćelije poseduju dve glavne familije molekularnih šaperona označene kao Hsp60 i Hsp70. Ove dve familije proteina Hsp deluju u različitim vremenskim periodima života proteina, a razlikuju se i po mehanizmu ostvarivanja svoje funkcije. Članovi familije Hsp70 stupaju u interkaciju sa rastućim polipeptidima tokom njihove translacije i novosintetisanim polipeptidima nakon njihovog oslobađanja sa ribozoma. Članovi 16

familije Hsp60 ne stupaju u interakciju sa rastućim polipeptidima, već deluju kasnije u toku života proteina. Molekularni šaperoni familije Hsp60 formiraju velike, oligomerne strukture u čiju izolovanu unutrašnjosti ulazi ciljni protein. Familija molekularnih šaperona Hsp60 poznata je i pod nazivom šaperonini, a njihovi pomoćni proteini kao košaperonini. Ćelija poseduje mehanizme kojima može brzo da otkloni posledice grešaka prilikom translacije i pogrešno savijene proteine. Krajnja mašinerija za razgradnju proteina u eukariotskim ćelijama je ATP-zavisna proteaza, nazvana proteazom. Holoenzim 26S proteazom sastavljen je iz jezgra, predstavljenog 20S proteazomom, čije obe strane asociraju sa po jednom 19S kapom, koje prepoznaju, vezuju i odmotavaju proteine obeležene za degradaciju. Kapa ima svoj poklopac i pod. Poklopac prepoznaje proteine označene za degradaciju, a pod ih usmerava ka centralnoj šupljini. Obeležavanje proteina za degradaciju vrši se malim proteinima ubikvitinima. Da bi se protein obeležio za degradaciju ubikvitin se aktivira enzimom za aktivaciju ubikvitina (E1). Aktivirani ubikvitin se reakcijom transesterifikacije sa enzima za aktivaciju prebacuje na enzim za konjugaciju ubikvitina (E2). Protein E2 nalazi se u kompleksu sa jednim od članova familije proteina E3. Funkcionalni kompleks E2-E3 naziva se ubikvitin ligaza. Protein E3 prepoznaje signal za degradaciju na ciljnom proteinu. Ubikvitin vezan za E2 prebacuje se na specifični lizinski ostatak ciljnog proteina. Jednom kada je ciljni protein mono-ubikvitiran, poliubikvitinski lanac se formira kroz iste ubikvitinkonjugacione kaskade. Multiubikvitinski lanac na ciljnom proteinu je ono što prepoznaju kape proteazoma. U ćeliji postoji čitav niz mehanizama kojima se kontroliše regulisana razgradnja proteina i mogu se podeliti na dva opšta puta indukovane degradacije proteina: aktivacija ubikvitin-ligaze i aktivacija signala za degradaciju na ciljnom proteinu. Aktivacija ubikvitin-ligaza vrši se fosforilacijom specifičnog aminokiselinskog ostatka pomoću neke proteinske kinaze; alosteričkom aktivacijom usled vezivanja nekog malog molekula (liganda); ili alosteričkom aktivacijom usled dodavanja proteinske subjedinice. Aktivacija signala za degradaciju vrši se fosforilacijom specifičnog ak ostatka na proteinu, čime se otkriva do tada sakriven signal za degradaciju; regulisanom disocijacijom proteinske subjedinice. Snažan signal za degradaciju može nastati raskidanjem određene peptidne veze. 17

Pitanja 1. Navedi najčešće korake u sazrevanju funkcionalnog proteina. 2. Šta je izlivena globula? 3. Šta su moleklarni šaperoni? 4. Navedi uloge molekularnih šaperona u ćeliji? 5. Navedi sličnosti u aktivnosti proteina Hsp60 i Hsp70? 6. Navedi razlike u aktivnosti proteina Hsp60 i Hsp70? 7. Opiši strukturu proteazoma. 8. Navedi korake u procesu obeležavanja proteina za degradaciju. 9. Navedi načine aktivacije ubikvitin ligaza. 10. Navedi načine aktivacije signala za degradaciju. 18