Regulacija ekspresije gena kod eukariota

Regulacija ekspresije gena kod eukariota

Regulacija ekspresije gena Višećelijski organizmi Čovek - 250 tipova ćelija Svaka ćelija gotovo istu DNK Regulacija ekspresije gena

Hijerarhija regulacije ekspresije gena kod eukariota: Klasični (genetički) Epigenetički Za sada nepoznati RNK svet Regulacija eksresije gena na nivou inicijacije transkripcije: izbor promotora, regulatoni elementi, regulatorni proteini Poremećaji u regulaciji ekspresije gena u patogenezi mnogih bolesti čoveka

Regulacija ekspresije gena kod eukariota na nivou hromatinskih struktura

Hromatin (eu- i hetero-) vs hromozom Hromatinske teritorije

Značaj asocijacije molekula DNK sa proteinima Obezbeđuje opštu organizaciju genoma u jedru Strukturni i funkcionalni značaj Pakovanje molekula DNK u jedro (50.000 puta manju dužinu nego što bi je imali bez asocijacije sa histonima) Razdvajanje molekula DNK tokom deobe Zaštita molekula DNK od dejstva nukleaza Učestvuje u svim fenomenima odgovornim za održavanje i ekspresiju genoma

Nukleozomalni histoni H2A, H2B, H3 i H4 Bazni (arginin i lizin bogati) proteini Domeni za uvijanje histona Fleksibilne petlje na C- kraju (histoni H2) N krajevi bez definisane strukture- histonski repovi Histonski repovi Domeni za uvijanje histona

Nukleozom Proteini histoni formiraju proteinsko jezgro Histonski oktamer ili histonsko jezgro

Organizacija hromatina Nukleozom - proteinsko jezgro i molekul DNK koji se 1,65 x obavija oko spoljašnjih površina proteinskog jezgra DNK jezgra (147bp) i vezna DNK (10 do 90bp)

Hromatinska vlakna Organizacija hromatina

Organizacija hromatina Hromatinske petlje (prosečna dužina DNK u petlji 85kb) vezane za nuklearni matriks

Organizacija hromatina Za vreme profaze ćelijske deobe u sisarskim ćelijama vlakno od 30 nm se pakuje u vlakno od 100 do 130 nm označeno kao hromonema. Hromoneme se pakuju u strukturu prečnika 200-250 nm - srednja profazna hromatida koja se pakuje u metafaznu hromatidu prečnika 500 750 nm.

Veza molekula DNK i histona - dinamična i nekovalentne prirode Elektrostatičko privlačenje, vodonične veze i hidrofobne interakcije Većina DNK vezujućih proteina prepoznaje svoje vezujuće mesto kada je ono oslobođeno histonskog oktamera ili se ona nalaze u linker regionima. Većina nukleozoma nije fiksirane lokalizacije.

Pozicioniranje nukleozoma Ponekad je pozicioniranje nukleozoma fiksno i dirigovano DNK vezujućim proteinima i sekvencom molekula DNK.

Kompleksi za remodelovanje nukleozoma Stabilnost odnosno dinamičnost interakcije histonskih proteina i molekula DNK regulisana je posebnom klasom proteinskih kompleksa koji se nazivaju kompleksi za remodelovanje nukleozoma (eng. Nucleosome Remodeling Complexes, NRC). Procesi su dinamični i lokalni. Promene u lokalizaciji nukleozoma u skladu sa trenutnim potrebama ćelije.

Kompleksi za remodelovanje nukleozoma Proteinski kompleksa od više subjedinica SWI/SNF kod kvasca ATP zavisna subjedinica visoko konzervisana Različita kombinacija subjedinica - modulacija funkcije Za određene subjedinice targeti na specifičnim hromozomskim mestima

Kompleksi za remodelovanje Specifičnost dejstva nukleozoma 1. interakcijom subjedinica NRCs i transkripcionih faktora. 2. interakcijom sa specifično modifikovanim histonskim proteinima preko svojih hromo i bromo domena.

Omogućavaju klizanje ili transfer nukleozoma Torzioni subdomen ATPazni domen Prateći subdomen ATP-azna subjedinica ima mogućnost pomeranja molekula DNK po površini oktamera. Torzioni domen povlači DNK po površini histonskog oktamera koja se pomera slično crvu koji puzi.

Regulacija ekspresije gena kod eukariota i histonski kod

Modifikacije histonskih proteina N-krajevi histonskih proteina - histonski repovi. Posttranslacione kovalentne modifikacije malim molekulima. Lizinski ostaci modifikuje se acetilacijom i metilacijom. Argininski ostaci modifikuju se metilacijom. Serinski i treoninski ostaci modifikuju se fosforilacijom.

Modifikacije histonskih proteina Histon acetil-transferaza (HAT) Histon - dezacetilaza Histon - metil - transferaza (HMT) Histon demetilaza

Modifikacije histonskih proteina Acetilacija histonskih repova u transkripciono aktivnim, a deacetilacija u transkripciono neaktivnim regionima hromatina. Acetilacija lizina neutrališe pozitivno naelektrisanje ak i redukuje afinitet vezivanja histona za negativno naelektrisan molekul DNK.

Modifikacije histonskih proteina Metilovani N-krajevi histona povezani su kako sa transkripciono aktivnim tako i sa transkripciono neaktivnim regionima hromatina. Metilacijom tačno određenih lizinskih ostataka na N- krajevima histona H3 i H4 uspostavlja se i održava heterohromatin.

Modifikacije histonskih proteina Fosforilisani N-krajevi histona prisutni su u regionima hromatina sa visokim nivoom transkripcije ali i u visoko kondezovanim hromozomima.

Efekat modifikacije zavisi od vrste i mesta modifikacije. Molekularni prekidač eu-/ hetero-hromatin. Lizin na poziciji 9 molekula H3 se i acetiluje i metiluje.

Koncept histonskog koda Kombinacija većeg broja modifikacija N-krajeva jednog ili nekoliko histona ostvaruje tačno određeni efekat na organizaciju hromatina.

Koncept histonskog koda Genetički jezik primarna struktura molekula DNK. Obrazac kovalentnih modifikacija histonskih proteina u određenom segmentu hromatina histonski kod. Histonski kod piši-briši jezik. Pisci enzimi koji modifikuju histone Čitaoci proteini sa specifičnim domenim Kratkotrajni ili dugotrajni efekat na transkripciju gena.

Bromodomen sadržajući proteini vezuju se za acetilovane N krajeve histonskih molekula (TFIID, HAT, NRC...)

Hromodomen sadržajući proteini vezuju se za metilovane N krajeve histon (proteini koji učestvuju u procesima transkripcionog utišavanja,hmt, NRC)

Heterohromatin protein 1 (HP1) D.melanogster koji učestvuje u procesima kondenzacije heterohromatina prepoznaje metilovan lizin 9 na repu histona H3

SANT domen sadržajući proteini prepoznaju nemodifikovane N krajeve histona Proteini sa ovim domenima imaju centralnu ulogu u procesima remodelovanja hromatina

Modifikovane N-krajeve histonskih molekula prepoznaju i proteini sa TUDOR domenom (ovi proteini često sadrže i RNK vezujući motiv) Proteini koji sadrže TUDOR domene uključeni u a.epigenetičku regulaciju b.metabolizam RNK c.obradu irnk d.obradu pre-mikro RNK e.biogenezu snrnkribonukleoproteina

Modifikacije N - krajeva histona Česta propagacija istog tipa modifikacije

Udruženi rad enzima za modifikaciju histona i nukleozom remodelirajućih kompleksa Zajedno menjaju lokalnu strukturu hromatina Regrutuju ih regulatorni proteini Omogućavaju da specifične sekvence molekula DNK postanu dostupne za vezivanje regulatornih proteina Transkripcija gena

Nasleđivanje histonskog koda Nasleđivanje obrasca ekspresije gena Epigenetička regulacija ekspresije gena Epigenetičkom regulacijom vrši se nasleđivanje: obrazac metilacije molekula DNK i obrazac modifikacije histona

Jezici genoma Dva nivoa informacije u okviru jednog genoma Genetička informacija (primarna struktura DNK) - read only Epigenetička informacija na nivou hromatina Histonski kod piši-briši sistem Determiniše transkripciono stanje gena

Regulacija ekspresije gena kod eukariota na nivou inicijacije transkripcije

Regulatorni elementi i regioni

Ekspanzija regulatornih regiona je najupadljivija kod viših eukariota. Veći broj signala je neophodan da bi se određeni gen eksprimirao u određeno vreme i u određenom tkivu. Ekspanzija regulatornih regiona reflektuje veoma složenu integraciju signala u regulaciji ekspresije gena.

Regulatorni elementi Podela u zavisnosti od lokacije i funkcije: Proksimalni promotorski elementi i uzvodne aktivatorske sekvence Pojačivači Prigušivači Elementi odgovora Granični elementi

Proksimalni promotorski elementi i uzvodne aktivatorske sekvence Nalaze se u blizini gena uzvodno od +1 mesta Pozitivan efekat na transkripciju kao i pojačivači Boksovi GC sadrže konsenzusnu sekvencu GGGCGG koja se pojavljuju u više kopija i za koju se vezuje protein Sp1 Boks CCAAT za koji se vezuje protein CBF

Pojačivači Kontrolišu vremensku i prostornu ekspresiju gena. Sastoje iz velikog broja regulatorno vezujućih mesta za koje se vezuju aktivatori transkripcije (regulatorni proteini). Skup transkripcionih regulatora na pojačivaču naziva se pojačivački kompleks (enhenserozom).

Pojačivači Od nekoliko stotina bp do 50 kb Regulišu transkripciju nezavisno od orijentacije Nalaze se uzvodno, nizvodno Ili u samom genu koji se transkribuje

Pojačivači Jedan pojačivač može učestvovati u regulaciji ekspresije većeg broja gena. Aktivirani pojačivač kontroliše ekspresiju samo jednog od mogućih ciljnih gena.

Pojačivači Jedan gen može imati veći broj alternativnih pojačivača koji vezuju različite grupe regulatornih proteina. Alternativni pojačivači kontrolišu ekspresiju istog gena u različitim vremenima i na različitim mestima (tkivima) odgovarajući na različite signale.

Prigušivači Regulatorni elementi za koje se na način specifičan za sekvencu vezuju regulatorni proteini koji imaju negativni efekat na transkripciju gena. Mogu biti locirani u promotoru, u njegovoj blizini ali i veoma udaljeni od njega. Registrovana je i pojava prigušivača u intronima nekih gena.

Elementi odgovora Regulatorni elementi u blizini promotora (do 1kb). Za ove elemente vezuju se ili unutarćelijski sekundarni glasnici (camp, npr.) ili receptori vanćelijskih signala (receptori steroidnih hormona, npr.).

Granični elementi izolatori i regulatoni regioni koji se vezuju za jedani matriks Regulatorni regioni koji se vezuju za jedarni matriks (eng. matrix attachment regions, MARs) su sekvence molekula DNK za koje se vezuju proteini jedarnog matriksa i na taj način učestvuju u formiranju hromatinskih petlji koje ograničavaju regione molekula DNK u kome regulatorni proteini vezani za regulatorne elemente ispoljavaju svoju ulogu.

Granični elementi - Izolatori

Regulacija ekspresije gena kod eukariota lokalni i pozicioni efekat Lokalni regulacija ekspresije gena na nivo jednog gena delovanjem transkripcionih aktivatora i represora. Funkcija regulatornih proteina je kontrolisana odgovarajućim signalima (najčešće vanćelijskim) i ovi proteini se vezuju u blizini odgovarajućeg gena i dovode do njegove aktivacije ili inaktivacije.

Pozicioni efekat regulacije ekspresije gena kod eukariota Pozicioni efekat podrazumeva da se gen isključuje zbog svoje lokacije u okviru genoma, a ne kao rezultat odgovora na specifične signale. Ovaj fenomen je poznat kao utišavanje gena ili transkripciono utišavanje ( zaključavanje gena). Mehanizmi koji leže u osnovi transkripcionog utišavanja su modifikacije histona i metilacija molekula DNK..

Izolatori Bitna osobina transkripcionog utišavanja je ta da se ono širi preko dugih regiona molekula DNK isključujući veliki broj gena, čak i one koji su vrlo udaljeni od mesta gde je ovaj mehanizam iniciran. Izolatori sposobni da inhibiraju širenje procesa modifikacije histona i na ovaj način štite gen od mehanizma transkripcionog utišavanja.

Hromatin imunoprecipitacija DNK vezujući protein se fiksiraju za molekul DNK tretiranjem sa glutar aldehidom. Izoluje se hromatin i genomska DNK seče se na fragmente od 200 300 bp.

Hromatin imunoprecipitacija Na fragmentima molekula DNK nastali restrikcionom digestijom nalaze se i dalje fiksirani proteini koji se vezuju za molekul DNK. Kompleksi fragmenata DNK i proteina tretiraju se specifičnim antitelom.

Hromatin imunoprecipitacija Kompleksi antitelo - regulatoni protein precipitiraju se pomoću G-sefaroze. Odvanje DNK i proteina proteolitičkim tretmanom. Umnožavanje sekvence DNK - PCR-om Sekvenciranje sekvenci molekula DNK. Informacija o segmentu molekula DNK za koji se vezuje ciljni protein.

Regulatori transkripcije Proteini koji se vezuju za regulatorne elemente. Po rezultatu svoje aktivnosti na transkripciju određenog gena dele se na aktivatore i inhibitore (represore) transkripcije. Poseduje dva funkcionalna domena: domen za vezivanje sa molekulom DNK (DNK vezivni domen) i domen za aktivaciju (aktivirajući domen).

Aktivatori transkripcije Gal4 regulatorni protein aktivator transkripcije - aktivira gene čiji su proteinski produkti enzimi neophodni za metabolizam galaktoze kod S. cerevisiae. Jedan od tih gena je GAL1. Gal4 u prisustvu galaktoze povećava nivo transkripcije GAL1 za oko 1000 puta.

Gal4 poseduje DNK vezivni domen i domen za aktivaciju. Prepoznaje specifičnu DNK sekvencu dugu 17 bp i vezuje se za nju u obliku dimera.

Regulatorni element gena GAL1 Regulatorno vezujuća mesta za Gal4 nalazi se u 4 kopije 275 bp uzvodno od gena GAL1 u okviru regulatornog elementa označenog kao - UZVODNA AKTIVIRAJUĆA SEKVENCA - UAS G (eng. Upstream activating sequence for GAL). 1 2 3 4 GAL1 UAS G 275 bp

Aktivatori transkripcije Dva proteinska molekula sa različitim funkcijama VP 16 protein Herpes v. uloga domena za aktivaciju. Oct 1 protein čoveka DNK vezujući protein. Protein VP 16 može da aktivira transkripciju samo u ćelijama u kojima se eksprimira protein Oct 1 i to zahvaljujući interakciji protein protein.

Sekvenca DNK koju prepoznaju regulatorni proteini dugačka je do 20 bp

Proteini sa homeodomenima Homeodomeni 60 uglavnom baznih ak - pripadaju klasi zavojnica okret zavojnica domena preko kojih ovi proteini prepoznaju molekul DNK (kao i bakterijski proteini). Prvo otkriveni kod D.melanogaster a onda i kod drugih eukariota uključujući i čoveka.

Homeodomeni sastoje se od 3 α zavojnice Zavojnica na C-kraju proteina stupa u interakciju sa velikim žljebom molekula DNK i naziva se zavojnica za prepoznavanje. Zavojnica α na N-kraju proteina je strukturna komponenta homeodomena koja pomaže u pozicioniranju zavojnice za prepoznavanje.

Cinkani prsti Mnogi regulatorni proteini koriste cink za stabilizaciju svog DNK - vezujućeg domena. Dva ostatka cisteina i dva ostatka histidina interaguju sa jonom cinka čime se stabiliše domen proteina koji interaguje sa molekulom DNK. Većina opštih transkripcionih faktora poseduje od 3 do 14 cinkanih prstiju koji obezbeđuju integritet ovih proteina i pospešuju njihov kontakt sa molekulom DNK.

Leucinski zatvarač Regulatorni proteini koji se u formi homo- ili hetero-dimera vezuju za sekvencu molekula DNK svoj međusobni kontakt mogu stabilizovati i preko motiva koji se naziva leucinski zatvarač.

Leucinski zatvarač Dva proteina ostvaruju međusobni kontakt hidrofobnim interakcijama aminokiselina leucina. Ovi leucini locirani su van domena za vezivanje sa molekulom DNK. U okviru ovih domena svaki 7 ak ostatak je leucin.

Zavojnica - petlja - zavojnica proteini HLH proteini poseduju dva heliksa povezana fleksibilnom petljom. Jedan heliks se vezuje za molekul DNK a drugi je odgovoran za dimerizaciju.

Eukariotski aktivatori indirektno regrutuju RNK pol na dva načina: Eukariotski aktivatori transkripcije interaguju sa medijatorom i/ili kompleksom TFIID regrutujući ih na promotor odgovarajućeg gena.

Aktivatori manjaju lokalnu strukturu hromatina Aktivatori mogu regrutovati komplekse za remodeliranje nukleozoma ili enzime za modifikaciju histona.

Klaster b globinskih gena čoveka Na 11. hromozomu 5 gena : ϵ - embrioni; dva fetalna γg i γa i dva adultna - δ- i β- Svaki od ovih gena mora da bude uključen/isključen u tačno određeno vreme tokom razvića u tačno definisanom tkivu.

Beta globinski gen Eksprimira se u adultnoj kosnoj srži. Dva pojačivača uzvodno i nizvodno od promotora. Samo u adultnoj kosnoj srži aktivatori transkripcije prisutni su u potrebnoj koncentraciji da se vežu za oba pojačivača.

Region za kontrolu lokusa Locus Control Region Pored regulatornih elemenata za svaki gen ponaosob postoje i regulatorni elementi koji se nalaze 30-50 kb uzvodno od klastera i koji su organizovani u region koji se naziva region za kontrolu lokusa (eng. locus control region, LCR) gena.

Region za kontrolu lokusa LCR sastavljen je od najmanje 4 HS mesta (hipersenzitivna mesta na dejstvo DNazaI) na međusobnom rastojanju od 2-4kb.

Mehanizam dejstva regiona za kontrolu lokusa HS mesta najčešće imaju ulogu pojačivača, kako kod čoveka tako i kod miša. Neke sekvence u okviru LCR funkcionišu kao izolatori. Različitom kombinacijom aktivnosti ovih elemenata obezbeđuje se i kontrolisana ekspresija globinskih gena.

Mehanizam dejstva regiona za kontrolu lokusa Aktvnost LCR, za razliku od klasičnih pojačivača, zavisi od orijentacije. LCR interaguje sa mnogim aktivatorima, represorima, DNK vezujućim faktorima i protein vezujućim faktorima. Prostorna blizina LCR i gena koji se eksprimira obezbeđuje se formiranjem aktivnog hromatinskog čvora.

Global kontrol region Uloga u razvoju ekstremiteta

Sinergizam u dejstvu aktivatora transkripcije Kooperativno vezivanje

Represori transkripcije a. Kompeticija b. Inhibicija c. Direktna represija d. Indirektna represija

Integracija signala Ekspresija gena HO kod kvasca u kasnoj G1 fazi ćelijskog ciklusa Kod kvasca aktivatori nemaju mogućnost delovanja na daljinu Protein SBF je aktivator transkripcije koji direktno interaguje sa medijatorskim kompleksom

Integracija signala Virusna infekcija indukuje aktivnost tri aktivatora transkripcije Jun/ATF, NFk-B i IRF koji formiraju pojačivački kompleks Protein koji menja arhitekturu molekula DNK HMGA-1 Pojačivački kompleks regrutuje protein CBP Protein CBP regrutruje kompleks za remodelovanje nukleozoma

Kombinatorna kontrola Mogućnost učešća jednog regulatornog proteina u kombinaciji sa drugim različitim regulatornim proteinima (aktivatorima ili represorima) u regulaciji ekspresije većeg broja gena naziva se kombinatorna kontrola. U situacijama kada isti signal reguliše ekspresiju većeg broja gena, jedan regulatorni protein može imati različit efekat na ekspresiju većeg broja gena i to zahvaljujući kombinatornoj kontroli.

Kombinatorna kontrola

Putevi prenosa signala kroz ćeliju Ekspresija gena jedne ćelije često je regulisana vanćelijskim signalima. Signali su najčešće proteini koje sintetiše jedna ćelija a koji dolaze u kontakt sa drugom ćelijom preko specifičnih receptora. Većina signala dolazi u kontakt sa regulatornim proteinima preko puteva prenosa signala (signalne transdukcije).

Prva klasa receptora Receptori koji prolaze kroz plazma membranu i imaju određene enzimske aktivnosti. Receptori sa tirozin kinaznom aktivnošću imaju sposobnost autofosforilacije kao i fosforilacije drugih substrata. Nekoliko familija receptora nema enzimsku aktivnost ali su kuplovani sa intracelularnim tirozin kinazama direktnim protein-protein interakcijama. Recpetor se aktivira vezivanjem signala

Receptori puteva signala Receptori koji su kuplovani, u unutrašnjosti ćelije, sa GTPvezujućim i hidrolizujućim proteinima (G-proteini). Receptori imaju strukturu koju karakteriše prisustvo 7 transmembranskih domena (serpentine receptori).

Receptori puteva signala Receptori koji su locirani u citoplazmu a nakon vezivanja liganda migriraju u jedro gde kompleks ligand-receptor direktno utiče na transkripciju gena.

Signalni put proteina STAT (eng. Signal Transducers and Activators of Transcription)

Faktor rasta Signalni put kinaze MAP Receptor za faktor rasta GRB2 (eng. Growth factor receptor bound protein 2) SOS (eng. guanine nucleotide exchange factor) Protein Ras - onkogen

Proteini koji maskiraju druge proteine Protein retinoblastoma Rb tumor supresorni protein ili antionkogen maskira aktivatora transkripcije E2F koji reguliše ekspresiju brojnih gena čija proteinski produkti ima ključnu ulogu u procesima kao što su: propagacija ćelije kroz ćelijski ciklus, replikacija DNK, apoptoza. Protein Rb inaktivira se fosforilacijom.

Signalni put glukokortikoidnog receptora

Signalni put glukokortikoidnog receptora

Signalni put glukokortikoidnog receptora Glukokortikoidni receptor vezuje se za sekvence u molekulu DNK koje se nazivaju GRE glukokortikodni element odgovora (eng. glucocorticoid response element, GRE). GRE je 15 nukleotida duga konsenzusna sekvenca GGTACANNNTGTTCT, gde je N bilo koji nukleotidi. Element odgovora postoji u dve forme glukokortikoidni receptor vezan za jednu formu aktivira a za drugu inhibira transkripciju.

Vezan za jednu formu elementa odgovora, glukokorikoidni receptor zadobija konformaciju koja omogućava njegovo vezivanje sa proteinom CBP. Protein CBP je ko-aktivator transkripcije. Ne poseduje domen za vezivanje za molekul DNK ali ima aktivnost histon-acetilaze kao i sposobnost interakcije sa proteinima transkripcione mašinerije. Vezan za drugu formu elementa odgovora, GR zadobija konformaciju koja mu omogućava da regrutuje enzime histon - deacetilazu i na taj način inhibira transkripciju sa okolnih gena.

Regulacija ekspresije gena na nivou elongacije transkripcije Transkripcija gena Hsp70 kod Drosophila Produktivna faza elongacije transkripcije ovog gena omogućena aktivnošću regulatornog proteina HSF

Transkripciono utišavanje ili utišavanje gena Neki geni transkripciono su neaktivni i bez dejstva određenih signala i dejstva represora, a represija njihove transkripcije posledica je njihovog položaja u okviru molekula DNK (oblast heterohromatina). Dva mehanizma koji leže u osnovi fenomena transkripcionog utišavanju su metilacija DNK i modifikacije N- krajeva histona (modifikacije histonskih repova).

Modifikacije histona kao mehanizam transkripcionog utišavanja Telomerni regioni genoma kvasca. Kompleks Sir (eng. Silent information regulator, Sir). Regulatorni proteini Sir3 i Sir4 vezuju se za histone. Protein Sir2 ima funkciju histon deacetilaze.

Za efikasno transkripciono utišavanje telomernih regiona kod kvasca potrebna je aktivnost još jednog proteina. Protein Rap1 (eng. Repressor activator protein 1, Rap1) prepoznaje ponovljene sekvence u telomerama (ponovci GC) i ima sposobnost regrutovanja kompleksa Sir.

Aktivirani protein Sir2 vrši deacetilaciju N-krajeva histona. Lokalna deacetilacija širi se rapidno niz hromatin stvarajući heterohromatin proces propagira samoga sebe. Dejstvo proteina Sir 2 zaustavlja metilacija N-krajeva histona H3 time što blokira vezivanje kompleksa Sir.

Metilacija molekula DNK kao mehanizam transkripcionog utišavanja Dodavanje metil grupe od strane enzima DNK metil-transferaze na 5 poziciju pirimidinskog prstena citozina. Ova modifikacija pogađa citozine u okviru dinukleotidnih sekvenci CG koje se mogu ponavljati od 10 do 20 puta u okviru regiona koji se nazivaju CpG ostrvca. Veličina CpG ostrvaca kreće se od 1000 bp do 2000 bp. Sisarski genomi sadrže preko 20.000 CpG ostrvaca.

Metilacija molekula DNK kao mehanizam transkripcionog utišavanja Najčešće metilovane sekvence u genomu čoveka su promotori i regulatorni elementi određenih gena. Metilovane sekvence nedostupne za vezivanje proteina. Specifični represori prepoznaju svoja mesta vezivanja samo u slučajevima kada su te sekvence metilovane.

Protein MBD (eng. methyl-cpg binding domain protein)

Genetičko utiskivanja (eng. imprinting) Pojava ekspresije samo jedne kopije gena u diploidnoj ćeliji i to u zavisnosti da li je nasleđena od majke ili oca. Metilacija molekula DNK u osnovi ovog fenomena. Detektovano je kod insekata, sisara, nematoda i cvetnica. Različiti geni utisnuti u različitim vrstama. Može biti tkivno specifični fenomen i specifičan za stadijum razvića. Većina utisnutih gena kod sisara ima ulogu u kontroli embrionalnog rasta i razvića.

11. hromozom čoveka Igf2 - insulinu sličan faktor rasta 2 H19 - utisnuti majčinski eksprimirani transkript protein CTCF - proteina sa 11 cinkanih prstiju - CCCTC vezujući faktor Genetičko utiskivanja (eng. imprinting)

Epigenetička regulacija ekspresije gena Obrazac ekspresije gena može biti nasledan Signal oslobođen iz jedne ćelije, tokom razvića, može imati uticaja na ekspresiju specifičnih gena u susednim ćelija. Takav obrazac ekspresije gena može se zadržati u brojnim ćelijskim generacijama bez obzira na prolaznost signala. Nasleđivanje obrasca ekspresije gena u odsustvu mutacija ili inicijalnog signala označeno je kao epigenetička regulacija ekspresije gen.

Nasleđivanje obrasca modifikacije histona

Obrazac metilacije molekula DNK može se verodostojno nasleđivati aktivnošću enzima koji su označeni kao metilaze za održavanje

Post-transkripciona regulacija ekspresije gena kod eukariota

Regulacija ekspresije gena na nivou obrade prekursora irnk Alternativno splajsovanje Regulatori splajsovanja Pojačivači i prigušivači splajsovanja na pre-irnk

Determinacija pola kod Drosophila

Aktivatori sa X hr SisA i SisB Represor Dpn sa 2. hr

Regulacija ekspresije gena kod eukariota na nivou translacije Regulacija ekspresije gena GCN4 kod kvasca. GCN4 transkripcioni aktivator gena koji kodiraju enzime uključene u biosintezu aminokiselina.

U uslovima niskog nivoa aminokiselina Translacioni faktor eif2 je fosoforilisan Količina inicijatorske trnk je smanjena Sinteza proteina GCN4

U uslovima visokog nivoa aminokiselina translacioni faktor eif2 je nefosoforilisan odsustvo sinteza proteina GCN4

Post-translaciona regulacija ekspresije gena kod eukariota Preko 100 tipova kovalentnih modifikacija proteina Fosoforilacija Ubikvitinacija Formiranje disulfidnih mostova Protreolitičko cepanje proteina Degradacija bioloških makromolekula

RNK interferencija Negativna (sekvencno-specifičina) regulacija ekspresije gena na post-transkripcionom nivou. Mehanizam koji omogućava da kratki molekuli RNK mogu da blokiraju ekspresiju gen sa kojim imaju homolognu sekvencu. Prvi put fenomen uočen 1990. godine kod petunija - utišavanje gena čiji su proteini odgovorni za produkciju biljnog pigmenta odgovornog za ljubičastu boju cveta

Andrew Fire i Craig Mello 1998. godine - prvi in vitro model dvolančana RNK (dsrnk) injekciono uneta u C. elegans male privremene RNK - strnk (eng. small temporal) utišavanje homolognih gena

RNK interferencija Poslednjih par godina postalo je jasno da su strnk prototip velike familije malih RNK mikro RNK (mirnk). Od tada, na hiljade mirnk identifikovano je u gotovo svim genomima metazoa, uključujući crve, muve, biljke i sisare. Milijardu godina star fenomen. Mehanizam razvijen u težnji eukariota da se zaštiti od dejstva RNK virusa i drugog stranog genetičkog materijala. Uloga u genetički regulisanim događajima tokom razvića i mnogim fiziološkim procesima nakon razvića.

Model RNK interferencije - sirnk Dajser (eng. Dicer) - enzim sličan RNazi III prepoznaje i seče dsrnk na fragmente od 21 do 23 bp. Dvolančane RNK dobijene aktivnošću enzima Dajser nazivaju se kratke interferirajuće RNK (sirnk).

Model RNK interferencija Utišavajući kompleks kompleks RISC (eng. RNA induced silencing complex) Sadrži različite proteine jedan od njih je član Argonaut familije za koga se veruje da interaguje sa kratkim ds RNK. Denaturacija dvolančane sirnk na način zavisan od ATP-a. Nakon denaturacije, jedan lanac sirnk (vodeći lanac) selektivno se inkorporira u kompleks RISC. U prvo vreme se mislilo da drugi lanac sirnk (prateći lanac) biva degradovan.

Utišavajući kompleks sa vodećim lancem RNK postaje aktivan i biva usmeren ka homolognim irnk. Katalitičke komponente RISC-a identifikovane su i lokalizovane u regionima citoplazme nazvanim citoplazmatska tela što su lokalni regioni degradacije irnk.

RNK interferencija Inhibicija translacije irnk Destrukcije irnk Direktna blokada ekspresije modifikacijom histona u regionu pomotora ciljnog gena Amplifikacija signala RNK zavisna RNK polimeraza (RdRP)

Mikro RNK (mirnk) Uključene u procese regulacije ekspresije gena kod eukariota. Kodirane u genomu - geni mirnk. Transkripti gena za mirnk su jednolančane RNK dugačke oko 70 nukleotida - primarne mirnk (pri-mirnk). Sekundarna struktura ukosnice obezbeđuje dvolančanost primarne mirnk. Dejstvom Droša proteina nastaju kraći prekursori mirnk premirnk koji napuštaju jedro uz pomoć proteina izvoznika. Enzim Dajser katalizuje cepanje pre-mirnk i formiraju se zrele mirnk (21-22bp).