XI. MIKROSKOPAI OPTINĖS SISTEMOS. XI. Mikroskopai. sites.google.com/site/optinessistemos/ 2016 pavasario semestras

Transcript

1 OPTINĖS SISTEMOS XI. Mikroskopai sites.google.com/site/optinessistemos/

2 Mikroskopas Pagrindiniai mikroskopijos principai Vaizdų susidarymas Kohler apšvietimas Tiesioginis ir invertuotas mikroskopas Objektyvai ir okuliarai Poliarizuojamasis mikroskopas Tamsaus lauko mikroskopas Fazinio kontrasto mikroskopas Nomarskio (DIC) mikroskopas Konfokalinis mikroskopas

3 Mikroskopo skiriamoji geba Prisimename lęšio (objektyvo) skiriamąją gebą (Abbės kriterijų arba Airy disko spindulį): =, /# =, λ Begalybėje esantis taškas, bus atvaizduojamas į r spindulio dėmę (su žiedais). Tačiau kaip bus su tašku, kuris nėra begalybėje? Ar gausime mes tą patį rezultatą?

4 Vaizdų formavimosi principai mikroskope Δϕ=λ/2 (Abbės teorija) Amplitudiniam objektui, difragavusios ir tiesioginės šviesos fazės skiriasi per λ/2 XI. MIKROSKOPAI Destruktyvi interferencija Kiekvieną objektą galima nagrinėti, kaip difrakcinė gardelę (Furjė analizė)

5 Vaizdų formavimosi principai mikroskope (Abbės teorija) XI. MIKROSKOPAI Kuo gardelės periodas yra mažesnis, tuo difrakcinis kampas yra didesnis. Mikroskopas išskirs objektą, jei jame bus sudarytos sąlygos destruktyviai interferencijai, t.y. objektyvas surinks šviesą bent iš vieno difragavusio spindulio. = λ = λ Centrinis apšvietimas Šį kampą apsprendžia kondensoriaus = λ + λ = = λ 2 2 Šoninis apšvietimas

6 Skaitinė apertūra Kuo platesnis, spindulių surinkimo kampas, tuo geresnė skiriamoji geba Didesnis NA, trumpesnis darbinis atstumas XI. MIKROSKOPAI

7 XI. MIKROSKOPAI

8 Didinimas Mikroskopo veikimo principas (geometrinis): 1. Objektyvas sukuria realų objekto atvaizdą 2. Okuliaras veikia kaip lūpa (padidina tarpinį atvaizdą). Bendras didinimas M mik =M obj x M okul = h h = = [210] = = +1 Akiai Not-infinity corrected objektyvui Infinity corrected objektyvui

9 Paprastas mikroskopas XI. MIKROSKOPAI Naudojamas taip vadinamas DIN standartas: Deutsche Industrie Norm. Reikalavimai: realus atvaizdas formuojamas 160mm vamzdyje parfokalus atstumas - 45 mm objektas- atvaizdas ilgis 195 mm Šiuo metu plačiau naudojami infinity corrected objektyvai, (ne 160 mm) DIN okuliarai turi 23mm diametrą: Objekto - atvaizdo Atstumas = 195 mm Vamzdžio ilgis = 160 mm Parfokalus atstumas = 45 mm J.Paul Robinson

10 Mikroskopas su finite - corrected optika XI. MIKROSKOPAI Okuliaras Atvaizdo plokštumas 195 mm 160 mm Objektyvas 45 mm Bandinys

11 Infinity-corrected optika Okuliaras Atvaizdo plokštumas Kolimuotas spindulių sklidimas Vamzdžio lęšis Kita optika Kita optika Objektyvas Bandinys Privalumas yra tame, kad optiniame kelyje bus sritis kuriame spinduliai yra kolimuoti, todėl galėsime įdėti papildomus optinius elementus neįnešant aberacijų. Be to fokusuoti mes galime judinant objektyvą.

12 Kohler apšvietimas

13 Mikroskopo apšvietimo suderinimas Kohler apšvietimo suderinimas: Pastatome objektyvą židinyje (stebime bandinį per okuliarą. Uždarome lauko diafragmą. Fokusuojame kondensorių taip, kad diafragmą matytumėme ryškiai. Išcentruojame kondensorių (kad diafragma būtų regimojo lauko centre. Atidarom diafragmą, kad ji užpildytų visą regimąjį lauką (bet ne daugiau). Stebim, matuojam tą ko mums reikia... Jei suderinome teisingai, apšvietimas bus tolygus ir mes nematysim dulkių, kurios nusėdusios ant kondensoriaus ar kolektoriaus lęšių.

14 Objektyvai

15 Užrašai ant Objektyvo

16 Mikroskopo objektyvai: Bandinio stikliukai Standartiniai stikliukų storiai #00 = #0 = #1 = #1.5 = #2 = #3 = #4 = #5 = mm Alyva 60x 1.4 NA PlanApo Mikroskopo objektyvas Padėklas Stikliukas Bandinys

17 Interferenciniai objektyvai Speciali objektyvų klasė interferenciniuose taikymuose Mirau objektyvas Maikelsono objektyvas

18 Okuliarai 1 Tarpinis atvaizdas 2 Lauko diagrama 3 Eye relief 4 Išėjimo vyzdys Paprastas okuliaras Teigiamas okuliaras Neigiamas okuliaras

19 Objektyvo ir okuliaro suderinimas Paprastai objektyvas ir okuliaras turi būti suderinti tarpusavyje (jei objektyve nepavyko kompensuoti aberacijų, gamintojas gali tas aberacijas kompensuoti okuliare). Todėl ne visada iš vieno mikroskopo išimtas objektyvas (okuliaras) veiks gerai kitam mikroskope (ypač kitos firmos). BUS NEKOMPENSUOTOS ABERACIJOS Tačiau moderniuose infinity-corrected objektyvuose visos aberacijos yra pašalinamos pačiame objektyve, arba vamzdžio lęšyje, todėl papildomai kompensuoti okuliarą jau nėra būtina. Be to, objektyvo didinimas turėtų būti visada didesnis, negu okuliaro. Kodėl? Didesnis didinimas reiškia didesnis NA. O NA apsprendžia skiriamąją gebą.

20 Kondensorius Paskirtis: Sufokusuoti šviesą į bandinį; Užpildyti visą objektyvo skaitinę apertūrą. Didžioji dalis mikroskopų turi taip vadinamą Abbe s kondensorių (susidedanti iš dviejų lęšių, be aberacijų korekcijos). Paprastai jei dirbama su didelio NA apertūros objektyvais (> 1 NA), kondensorių taip pat reikia naudoti kartu su alyva.

21 XI. MIKROSKOPAI

22 Tipinis mikroskopas XI. MIKROSKOPAI Epiillumination Source Image from Nikon promotional materials Brightfield Source

23 Invertuotas mikroskopas Daugiau taikomas biologijoje ar ten kur reikia manipuliuoti bandiniu realiu laiku. Nikon Dabar naudojam CCD kameras

24 Atspindžio mikroskopas Skirtas stebėti neskaidrius bandinius. Kondensorius yra tuo pačiu ir objektyvas.

25 Tamsaus lauko mikroskopija Mikroskopas, kuris surenka tik difragavusią šviesą

26 Poliarizuotos šviesos mikroskopas XI. MIKROSKOPAI Mikroskopas kuriame bandinys talpinamas tarp poliarizatorių (paprastai sukryžiuotų) ir stebimas poliarizacijos sukimas sukeliamas bandinio. Specialūs objektyvai, pagaminti stengiantis sumažinti įtempius

27 Fazinio kontrasto mikroskopas Δϕ=λ/4 Problema su faziniais objektais- jie neturi amplitudinės moduliacijos, be to difragavusios irnedifragavusios šviesos fazių santykis yra apytiksliai λ/4. Taigi objektyvo surinkta šviesa interferuos ne destruktyviai ir neturėsime kontrasto. Idėja: reikia sukurti sąlygas optinėje sistemoje, kad nedifragavusi šviesa būtų pagreitinama (pavėlinama) per λ/4. Tada bendras fazės pokytis bus λ/2 (arba 0) ir šviesa galės interferuoti atvaizdo plokštumoje destruktyviai (konstruktyviai) taigi bus sąlygos tokios, kaip ir amplitudiniams objektams. Pirmasis tą sugalvojo Fritz Zernike ir už tai gavo Nobelio premiją.

28 Šviesus laukas Fazinis kontrastas

29 Fazinio kontrasto mikroskopo principas Taigi, kaip užvėlinti (pagreitinti) tiesioginę spinduliuotę, per λ/4. XI. MIKROSKOPAI Žiedinė apertūra Užlaiko spinduliuotę per λ/4 ir dalį jos sugeria (kad gauti geresnį kontrastą) (paprastai integruojama į objektyvą)

30 XI. MIKROSKOPAI

31 Pagreitinta nedifragavusi šviesa Teigiamas kontrastas (destruktyvi interferencija) Sulėtinta nedifragavusi šviesa Neigiamas kontrastas (konstruktyvi interferencija)

32 Fazinio kontrasto mikroskopas Fazinis kontrastas įvedamas tik tam, kad mes galėtumėme kontrastingiau matyti fazinį objektą. Pats atvaizdo intensyvumas neneša jokios informacijos apie objekto būvi t.y. stebėdami objektą, paprasčiausiu atveju galima gauti tik kokybinė informaciją (norint kiekybinės informacijos, reikia atlikti interferencinius matavimus). Pvz. turime du fazės pokyčius (difragavusios ir nedifragavusios) kurie lygus 240 ir 320. Rezultate intensyvumas bus toks pat. Kai objekte yra staigūs fazės šuoliai, fazinis kontrastas nebeveikia gerai, atsiranda artefaktai (fazinis halas).

33 Nomarskio (DIC) mikroskopas XI. MIKROSKOPAI Idėja: paleidžiame per objektą du spindulius, kurie eina ne per tą pačią objekto vietą, bet yra šiek tiek paslinkti (labai mažai). Jei objekte yra kažkoks gradientinis fazės pokytis, interferuojant šiuos du spindulius, mes matysime skirtumą (visai kaip interferometras, bet atraminis spindulys irgi eis per fazinį objektą). Kaip tą galima įgyvendinti: 1. Imame poliarizatorių, kuris sukuria tiesiškai poliarizuotą šviesą. 2. Įleidžiame šią šviesą į Nomarskio (Wollastrono) prizmę ( ji padalins spindulį į dvi dalis su priešingom poliarizacijoms) 3. Kondensorius priverčia šiuos spindulius sklisti lygiagrečiai. poslinkis priklauso nuo naudojamo objektyvo: 100x, NA m 40x, NA m 16x, NA m 4. Spinduliai surenkami objektyvu ir kita Nomarskio (Wollastrono) prizme sujungiami į vieną (ja galima derinti fazinį užlaikymą tarp abiejų spindulių, kad būtų geriausias kontrastas). 5. Šviesa praeina pro analizatorių, kad išėjime būtų tik tiesiškai poliarizuota šviesa (kad gautųsi interferencija).

34 Nomarskio mikroskopas Taigi toks mikroskopas matys fazinį gradientą, bet jis irgi turės artefaktų. Bandiniai atrodys trimačiais (turės netikrą šešėlį), bet neturės halo.

35 Nomarskio vs fazinis kontrastas Pigesnis Fazinis Lengviau justiruojamas Naudoja mažą aperturą Fazinis halas Nejautrus dvigubam lūžiui Didelis fokusavimo gylis (maža apertūra, matysim vaizdus iš įvairių bandinio sluoksnių) Su absorbuojančiais bandiniais prasčiau veikia Brangesnis DIC Sudėtingesnis justiravimas Pilna apertūra Šešėlio efektas Jautrus dvigubam lūžiui Mažas fokusavimo gylis Veiks ir su spalvotais (ar neskaidriais bandiniais)

36 Kontrasto gerinimas atspindžio mikroskopuose XI. MIKROSKOPAI

37 Konfokalinis mikroskopas Konfokalinis mikroskopas padidina skiriamąją gebą ir leidžia matyti vaizdą 3D. Pagrindinis triukas: prieš detektorių įstatoma maža apertūra (konjuguota su apšvietimo apertūra), kuri surinks šviesą tik iš vienos z plokštumos. Skenuojant lazerio spindulį XY kryptimi, gaunamas vienas bandinio pjūvis, o objektyvą transliuojant z kryptimi gaunami pjūviai pagal Z ašį.

38 Nipkow o disko konfokalinis mikroskopas XI. MIKROSKOPAI