TRANSPORT JONA I ORGANSKIH JEDINJENJA KROZ MEMBRANE

TRANSPORT JONA I ORGANSKIH JEDINJENJA KROZ MEMBRANE

Transportni mehanizmi na membranama Prema potrebi za energijom i specifičnim učesnicima u transportu postoji 5 načina transporta kroz biološke membrane: Spontani ili pasivan transport Aktivan transport Endocitoza ili transport pomoću membranskih vezikula Transport putem razmene preko translokatora Transport jona povezan sa aktivnošću redoks sistema

Opšti pojmovi o pasivnom i aktivnom transportu Kretanje materija izazvano razlikama u koncentraciji na dvema stranama membrane, bez ulaganja energije, se označava kao pasivan transport Elektroliti i mnoga organska jedinjenja ulaze u ćeliju nezavisno od razlika u koncentraciji Transport često ide nasuprot gradijentu koncentracije Za to je potrebna energija Energija potiče od metaboličkih procesa u ćeliji, a takav transport se zove aktivan transport

Pasivni transport kroz membrane obuhvata: difuziju olakšanu difuziju (akvaporini i jonski kanali) Aktivni transport kroz membrane obuhvata: primarni aktivni transport (jonske pumpe) sekundarni aktivni transport (kotransporteri) transport ABC transporterima

Uniport Simport Antiport Elektro-neutralni transport Elektrogeni transport

Kod biljaka Uniport obavljaju: jonske pumpe učesnici u olakšanoj difuziji jonski kanali Simport i antiport obavljaju kotransporteri.

Endocitoza/Egzocitoza Poseban transport supstanci kroz membranu koji ne može da se svrsta ni u pasivni ni u aktivni transport ne zavisi od koncentracionog gradijenta, ali zahteva aktivnost membranskog sistema ćelije Fagocitoza i pinocitoza Egzocitozom se obavljaju: izgradnja ćelijskog zida, reparacija i rastenje ćelijske membrane, sekrecija nektara itd. Verovatno neki virusi ulaze u ćeliju na ovaj način (endocitozom) Obložene vezikule i uloga klatrina

Koncentracija pojedinih jona u ćeliji je gotovo uvek veća ili manja od one u okolnoj sredini. Ćelijska membrana deluje kao vrlo efikasna lipofilna barijera kroz koju joni ne mogu slobodno da difunduju. Joni se mogu transportovati kroz membranu kotransporterima (sekundarni aktivni transport) ili jonskim kanalima (olakšani pasivan transport).

Na + K + Mg 2+ Ca 2+ Cl - Chara ceratophylla ćelijski sok spoljašnji rastvor 84 0.21 77 0.04 20 6.5 13 3.3 176 0.13 Valonia ventricosa ćelijski sok morska voda 43 498 591 12 - - - - 629 580

Nemetabolička akumulacija jona Metabolička akumulacija jona

NEMETABOLIČKA AKUMULACIJA JONA i ORGANSKIH SUPSTANCI Supstanca koja uđe u ćeliju difuzijom može u citoplazmi da se promeni fizički ili hemijski pa u novom obliku više ne može da izađe napolje. Vitalna boja neutralno crveno pri ph 8 lako ulazi u biljne ćelije, jer je nedisosovana. U ćeliji je ph niže, pa boja disosuje, a membrana je nepropustljiva za jone koji nastaju. Na taj način se nakupi i oko 30 puta više boje unutar ćelije. Jon ili organska supstanca pretrpe neku hemijsku promenu, npr. ugrade se u neko drugo jedinjenje primer: vezivanje joda za skrob. Specijalni oblik nemetaboličke akumulacije jona u ćelijskom zidu biljaka - Donanov potencijal, Donanova faza, Donanov prostor, Donanova ravnoteža.

METABOLIČKA AKUMULACIJA JONA Koncentrisanje jona u ćelijama je rad koji zahteva ulaganje enerije, a izvori energije u biljnoj ćeliji mogu biti dva metabolička procesa: fotosinteza i disanje. Veza između njih i primanja jona je odavno uočena. Hoagland primljena količina broma srazmerna je intenzitetu svetlosti, tj. intenzitetu fotosinteze kod alge Nitella. U diskovima krtole krompira količina apsorbovanog broma proporcionalna je količini usvojenog kiseonika, tj. intenzitetu disanja.

SONO DISANJE KORENOVA PŠENICE Vreme (sati)

ELEKTROHEMIJSKI POTENCIJAL JONA Biološke membrane imaju vrlo nisku električnu provodljivost i slabu permeabilnost za jone. To su efikasne barijere kroz koje elektroliti ne mogu da prođu putem difuzije.

Transport elektrolita kroz membranu zavisi od sume hemijskog i električnog potencijala, što se naziva elektrohemijski potencijal. Uspostavljanje ravnoteže ne mora da znači i izjednačenje koncentracije. Do elektrohemijske ravnoteže dolazi kada je ukupan broj anjona i katjona, tj. nosilaca negativnih i pozitivnih naboja na dvema stranama membrane, izjednačen, bez obzira na vrstu jona. Može se desiti da je koncentracija (hemijski potencijal) nekog katjona u ćeliji veća nego van nje, a to stanje se održava zato što ćelija sadrži višak negativno naelektrisanih čestica (anjona)

Povećana koncentracija jednog jona u ćeliji nije sama po sebi dokaz da je taj jon transportovan aktivnim putem Da li je jon ušao aktivnim putem ili ne, odnosno da li je pri ustanovljenoj razlici u koncentraciji jona ćelija u elektrohemijskoj ravnoteži ili ne, može se pouzdano utvrditi primenom Nernstove jednačine

Promena slobodne energije sistema, ΔG Određuje je zbir hemijske i električne komponenta: ΔG = zf ΔE + 2,3RT log (C 2 /C 1 ) ΔE je membranski potencijal=rad koji mora da se obavi kako bi se naelektrisana čestica transportovala sa jedne strane membrane na drugu. ΔG ima negativan predznak onda kada se transport jona kroz membranu dešava niz gradijent konentracije i niz gradijent odgovarajućeg naelektrisanja; to znači da se entropija sistema povećava i da se transport obavlja spontano, bez utroška energije pasivan transport jona. ΔG ima pozitivan predznak onda kada se transport jona kroz membranu dešava uz gradijent konentracije i uz gradijent odgovarajućeg naelektrisanja; to znači da se entropija sistema smanjuje i da transport mora biti vezan za neki izvor energije, tj. uz utrošak energije aktivan transport jona.

NERNSTOVA JEDNAČINA RT C 2 E N = -----. ln ---- zf C 1 E N = E 1 - E 2 = Nernstov potencijal, tj. razlika između električnog potencijala u ćeliji (E 1 ) i u spoljašnjem rastvoru (E 2 ) R = gasna konstanta (8,314 J mol -1 K -1 ) T = apsolutna temperatura (u stepenima Kelvina, K) z = valenca jona (nosi pozitivan ili negativan predznak, u zavisnosti od toga da li je reč o katjonu ili anjonu) F = Faradejeva konstanta (96490 kulona) C 1 = koncentracija jona u ćeliji C 2 = koncentracija jona van ćelije

Kada se uvede dekadni logaritam: 2,3 RT C 2 E N = -----------. log 10 ----- zf C 1

Merenje membranskog potencijala (Δ E M )

Upoređivanje izračunate vrednosti ΔE N i izmerene vrednosti ΔE M za jedan, određeni jon daje odgovor na pitanje da li je sistem u elektrohemijskoj ravnoteži i da li je do prethodno konstatovane razlike u koncentraciji tog jona u ćeliji i van ćelije došlo pasivnim ili aktivnim transportom. Ako su ΔE N i ΔE M približno iste vrednosti, to znači da je sistem u elektrohemijskoj ravnoteži, a do razlike u koncentraciji jona došlo je pasivnim putem. Ako nisu, zaključak je da sistem nije u elektrohemijskoj ravnoteži, a do razlike u koncentracijama jona došlo je aktivnim transportom.

MEMBRANSKI PROTEINI - UČESNICI U TRANSPORTU KROZ MEMBRANE Podela transportnih proteina koja se zasniva na vrsti energije koju koriste za rad Jonske pumpe neutralne i elektrogene Kotransporteri ili prenosioci (u ovu grupu spadaju i transporteri koji obavljaju olakšanu difuziju, koja spada u pasivni transport!) Jonski kanali ABC transporteri

Primarni i sekundarni aktivni transport Jonske pumpe su enzimi adenozin-trifosfataze (ATPaze), koje hidrolizuju ATP i pomoću oslobođene energije prenose jone uvek u određenom smeru, nezavisno od njihove koncentracije (ali veoma često uz gradijent koncentracije). U biljnim ćelijama primarni učesnici aktivnog transporta su protonske ATPaze Prenose protone iz citoplazme u ćelijski zid i u vakuolu i generišu elektrohemijski gradijent protona. Energija koja proizilazi iz ovog gradijenta naziva se protonska motorna sila, a sam proces je primarni aktivni transport.

Protonska motorna sila ima dve komponente: hemijsku = razlika u hemijskom potencijalu, tj. koncentraciji protona rezultira razlikom u ph vrednosti između citoplazme (ph 7,2) i ćelijskog zida, odnosno ćelijskog soka (ph oko 5); ćelijski zid i ćelijski sok su uvek kiseliji od citoplazme. električnu = razlika u električnom potencijalu sa strana membrane ogleda se u tome što je citoplazma uvek negativno naelektrisana u odnosu na vakuolu i ćelijski zid; ΔE plazmaleme = - 120 mv, ΔE tonoplasta = - 90 mv. Mitchel-ova hemiosmotska hipoteza U generisanju protonske motorne sile kod biljaka, osim ATP-aza učestvuju i pirofosfataze, koje se nalaze na tonoplastu, kao i elektrogena NAD(P)H dehidrogenaza. Transport kroz kotransportere koristi elektrohemijski gradijent protona generisan prethodnim aktivnim transportom protona koji obavljaju protonske pumpe. Kotransporteri koriste posredno energiju oslobođenu hidrolizom ATP-a (na ATP-azama), tj. hemijsku komponentu protonske motorne sile, pa se zato transport u kojem učestvuju naziva sekundarni aktivni transport.

Električna komponenta protonske motorne sile omogućava transport kroz neke jonske kanale (koji obavljaju pasivan transport jona, uvek niz elektrohemijski gradijent jona) tako što dovodi do njihovog otvaranja ili zatvaranja. To su voltažni jonski kanali. Hemijska komponenta protonske motorne sile omogućava vraćanje protona niz hemijski gradijent kroz kotransportere i, na osnovu oslobođene energije koja je posledica transporta protona niz gradijent njihove koncentracije, simultani transport jona ili organskih jedinjenja obično uz elektrohemijski gradijent (sekundarni aktivni transport). SVI kotransporteri transportuju protone niz gradijent njihove koncentracije na plazmalemi iz ćelijskog zida u citoplazmu, a na tonoplastu iz ćelijskog soka vakuole u citoplazmu. Kotransport jona ili organskih jedinjenja može biti simport ili antiport (u odnosu na protone).

Veza između primarnog i sekundarnog aktivnog transporta

JONSKE PUMPE - ADENOZIN TRIFOSFATAZE Kod biljaka postoje H + - i Ca 2+ - ATPaze. Postoje tri tipa protonskih ATPaza, koje se razlikuju po strukturi i mestu na kome se nalaze:

(1) P-tip ATPaze - na ćelijskoj membrani biljaka i gljiva (sinonimi: E-P i E1E2 ATPaza); njihova je funkcija da transportuju protone iz citoplazme u apoplast (2) V-tip ATPaze - na tonoplastu (sinonim: tpatpaza) transportuju protone iz citoplazme u vakuolu. V-tip se nalazi takođe na lizozomima i vezikulama sa omotačem (3) F-tip ATPaze - na unutrašnjim membranama hloroplasta i mitohondrija i na membrani bakterija (označene i kao F0F1 ATPaze, reverzne ATPaze ili ATP sintaze); one transportuju protone, ali za razliku od drugih ATPaza ne obavljaju hidrolizu, nego sintezu ATP

Protonske ATPaze P-tipa

Ca 2+ -ATPaza je ATPaza P-tipa

Održavanje gradijenta koncentracije Ca 2+ u ćeliji neophodno je za signalnu funkciju Cajona.

Protonske ATPaze V-tipa

Protonske ATPaze F-tipa

Pirofosfataze Nisu ATPaze, ali jesu protonske pumpe. Nalaze se na tonoplastu, transportuju protone iz citoplazme u vakuolu i doprinose generisanju protonske motorne sile na tonoplastu.

H + -ATPaze su od ključnog značaja za fiziološke procese kod biljaka Regulacija kiselosti (ph) citoplazme Primanje jona i organskih jedinjenja u ćelije Promena turgora prilikom otvaranju stoma Promene turgora u pulvinusima nastije Transport soli u ksilem korena Punjenje floema saharozom u listovima Rastenje ćelija pod uticajem fitohormona Regulacija ćelijskog ciklusa Razvoj polarnosti u ćelijama koje rastu vrhom (korenske dlake, polenova zrna, hife gljiva, rizoidi algi, korenovi, somatski embrioni)

Značaj transportera u tonoplastu za fiziološke procese kod biljaka: Akumulacija osmotski aktivnih supstanci u ćelijskom soku i uloga u osmoregulaciji Održavanje turgora u ćelijama prilikom otvaranja stoma i rastenja Nakupljanje i otpuštanje neorganskih (joni) i organskih (malati kod CAM biljaka, šećeri kod šećerne repe i šećerne trske) materija u vakuolama Regulacija citoplazmatičnog kalcijuma i ph Akumulacija rezervnih proteina u semenima Akumulacija zaštitnih proteina

Prenosioci (kotransporteri) organskih jedinjenja i jona Prenosioci, ili kotransporteri, su membranski proteini čiji receptorni segment može da bude izložen jednoj ili drugoj strani membrane, u zavisnosti od promene konformacije molekula. Učestvuju u sekundarnom aktivnom transportu ili olakšanoj difuziji. NE koriste direktno energiju hidrolize ATP-a, već hemijsku komponentu protonske motorne sile. Mogu transportovati jone ili organske molekule, uniportom, simportom ili antiportom.

RAZLIKUJU SE DVE VRSTE PRENOSILACA: jedni učestvuju u katalizovanoj difuziji drugi u sekundarnom aktivnom transportu

OLAKŠANA (KATALIZOVANA) DIFUZIJA JONA

Katalizovana difuzija organskih molekula Javlja se u posebnim slučajevima, kao što je transport glukoze iz citoplazme u vakuolu, kada je njena koncentracija u citoplazmi visoka. Moguće je da iz floemskih elemenata, koji sadrže veliku koncentraciju saharoze, ova supstanca izlazi u okolne ćelija stabla putem katalizovane difuzije.

Transport prenosiocima, koji obavljaju katalizovanu difuziju, je uniport Katalizovana difuzija je pasivan proces

AKTIVAN TRANSPORT POMOĆU KOTRANSPORTERA Sekundarni aktivni transport pomoću kotransportera. Gradijent protona ostvaruju P- ATPaza na plazmalemi, V- ATPaza i pirofosfataza na tonoplastu. Kotransporteri na plazmalemi obavljaju simport protona sa saharozom, aminokiselinama, i glukozom, kao i nitratom, sulfatom ili fosfatom iz apoplasta u citoplazmu. Kotransporteri na tonoplastu obavljaju antiport protona iz vakuole i glukoze, saharoze i amino kiselina u vakuolu. Obe membrane sadrže i prenosioce za katalizovanu difuziju

JONSKI KANALI

Jonski kanali prenose SAMO jone, u jednom, uvek istom smeru (uniport), UVEK niz gradijent koncentracije jona. Smatra se da postoji više od 20 različitih jonskih kanala (Tester, 1990), koji se klasifikuju prema vrsti jona za koji su prvenstveno permeabilni. Kod biljaka su najbolje proučeni jonski kanali za K +, Cl - i Ca 2+.

Prema faktorima koji utiču na promene konformacije jonskih kanala i tako dovode do njihovog otvaranja ili zatvaranja, jonski kanali kod biljaka se dele na: Voltažne kanale (napr. K + kanali) Kanale čije je otvaranje pod kontrolom receptora, odnosno vezivanja agonista, liganada (regulatori rastenja, svetlost, fosfati, Ca 2+ itd.) za receptor. Primer ovakvih kanala su jonski kanali za Ca 2+.

Shematski prikaz kalijumovog voltažnog kanala (zavisnog od napona)

ABC transporteri GS-X pumpe koje se nalaze u tonoplastu transportuju konjugate glutationa (GS) i ksenobionata (herbicidi helati teških metala, toksini iz spoljašnje sredine) ali i konjugate GS sa katabolitima hlorofila i sekundarnim metabolitima iz citoplazme u vakuolu. Obavljaju aktivni transport uz utrošak 2 ATP-a (Mg 2+ zavisne ATPaze P-tipa). Ne generišu i ne zavise od protonskog elektrohemijskog gradijenta. Ne mogu se svrstati ni u primarni ni u sekundarni aktivni transport. U novije vreme otkriveni su i ABC transporteri u drugim membranama. Smatra se da oni imaju funkcije u rastenju i razviću biljaka (formiranje kutikule i Kasparijevih traka, transport hormona i sl.).

Current Opinion in Plant Biology 2018, 41:32 38

Membranski transporter Tip transportera Tip transporta Direktan utrošak ATP-a Supstance koje se transportuju kroz membranu Smer transporta Lokacija u biljnoj ćeliji Stimulatori aktivnosti Inhibitori aktivnosti Protonska ATPaza P-tip (elektrogena) Jonska pumpa Primarni aktrivni da protoni Uniport (iz citoplazme u apoplast) plazmalema Auksini, fuzikokcin, svetlost Vanadati Protonska ATPaza V-tip (elektrogena) Jonska pumpa Primarni aktrivni da protoni Uniport (iz citoplazme u vakuolu) tonoplast Anjoni (Cl - ) Anjoni (NO 3- ) Protonska ATPaza F-tip ATP-sintaza (reverzna ATPaza) Jonska pumpa Niz elektrohemi jski gradijent ne (sintetiše ATP) protoni Uniport (iz lumena tilakoida u stromu hloroplasta) unutrašnje membrane hloroplasta i mitohondrija / Azidi Ca ++ - ATPaza P- tip (elektrogena) Jonska pumpa Aktivni transport da joni kalcijuma Uniport (iz citoplazme u apoplast,vakuol u i organele) plazmalema, tonoplast i membrane organela / Vanadati Elektrogena pirofosfataza Jonska pumpa Primarni aktivni ne (troši pirofosfate) protoni Uniport (iz citoplazme u vakuolu) tonoplast Katjoni (K + ) Katjoni (Na + ) Elektrogena NAD(P)H dehidrogenaza Alternativna oksidaza Primarni aktivni ne elektroni (otpušta protone u citoplazmu) / plazmalema / /

Membranski transporter Tip Tip transportera transporta Direktan utrošak ATP-a Supstance koje se transportuju kroz membranu Smer transporta Lokacija u biljnoj ćeliji Stimulatori aktivnosti Inhibitori aktivnosti Prenosioci carriers Olakšana difuzija ne joni i mali organski molekuli (šećeri i aminokiseline) Uniport Sve biljne membrane / / Kotransporteri carriers Sekundarni aktivni transport ne (koriste hemijsku komponent u protonske motorne sile) protoni simultano sa jonima ili malim organskim molekulima Simport i antiport Sve biljne membrane / Supstance koje rasipaju elektrohemijsk i gradijent protona Jonski kanali kanali Pasivni transport ne (voltažni jonski kanali koriste električnu komponent u protonske motorne sile za otvaranje ili zatvaranje) joni Uniport (niz elektrohemijski gradijent jona) Sve biljne membrane Ligandi (kod nekih jonskih kanala fosfati, joni kalcijuma, biljni hormoni itd.) / Akvaporini kanali Pasivni transport ne voda Niz gradijent vodnog potencijala ABC-transporteri / / da joni teških metala, toksini, herbicidi Uniport (iz citoplazme u vakuolu) Sve biljne membrane / / tonoplast / /

REGULACIJA KONCENTRACIJE PROTONA (ph) u ćeliji ph citoplazme ima stabilne vrednosti oko ph 7. Na sniženje ph citoplazme utiču NH 4 + joni i povišene koncentracije NO 2, CO 2 i SO 2, dok na povišenje utiču joni NO 3-. Promene ph citoplazme imaju efekta na enzimske procese ph-stat sistem = mehanizam koji neutrališe promene ph citoplazme. Obuhvata dva mehanizma: Biofizički ph-stat - zasniva se na aktiviranju protonskih P-ATPaza čiji je optimum dejstva na ph 6,6. Podešava gruba odstupanja od neutralnog ph citoplazme. Biohemijski ph-stat zasniva se na ravnoteži između sinteze (iz PEP, karboksilacijom; PEP-karboksilaza čiji je optimum aktivnosti do ph 8,0) i razgradnje (dekarboksilacijom; malat NADPdekarboksilaza čiji je optimum aktivnosti na nižim vrednostima ph) jabučne kiseline. Podešava mala odstupanja ph vrednosti, fino i precizno reguliše ph citoplazme.

Tradicionalni koncept biohemijskog ph-stata 1 = PEP karboksilaza 2 = malat dehidrogenaza 3 = jabučni enzim (malat NADP-dekarboksilaza)