Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez

Transcript

1 Memoria de Prácticas 1º curso Grao de Bioloxía USC

2 Curso Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana Sueiro, Francisco de la Torre, María Teresa Herrera, Javier Sampedro, Fátima Adrio, Francisco Salgado, Jesús Aboal, Carmen Leirós, Carmen Bermejo

3 ÍNDICE DE CONTIDOS 1. MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, E BENESTAR ANIMAL TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE CONTIDOS DE BIBLIOTECA

4

5 1. MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, E BENESTAR ANIMAL (código calendario de prácticas: FA)

6

7 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA BALANZAS DE LABORATORIO E PIPETAS 1. Obxectivo 1.1 Consideracións prácticas e manexo dunha balanza de precisión de calibración externa. 1.2 Consideracións prácticas e manexo de pipetas. Pipetas automáticas, fixas e variables. Pipetas repetitivas. 2. Introdución A fisioloxía e outras ramas da bioloxía son ciencias cuantitativas que requiren dun sistema de medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa. 2.1 Balanzas de laboratorio Un dos instrumentos de medida máis usados no laboratorio é a balanza, utilizada para medir cantidades pequenas de masa. A masa, propiedade característica dos corpos, é a cantidade de materia dunha sustancia ou material. Concepto diferente ao de peso: forza da atracción gravitatoria que a Terra exerce sobre a materia. A balanza compara a masa descoñecida dunha sustancia coa masa dun patrón ou patróns de referencia (internos ou externos), sometidas ambas á mesma aceleración debida á gravidade. Ao proceso de comparar masas denomínase pesada. O trazo que define ás balanzas de laboratorio é o da precisión xunto ao de alta resolución. Unha vez calibradas, teñen tamén un alto grao de exactitude. 3

8 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Exactitude: grao de concordancia entre o valor real e o valor medido. Precisión: capacidade de dar o mesmo resultado en medicións diferentes realizadas nas mesmas condicións. Grao de concordancia ou repetitividade dun resultado. Unha balanza será precisa cando diferentes medidas dunha mesma magnitude sexan moi parecidas. Unha medida común da variabilidade é a desviación estándar das medicións. Resolución: incremento de peso máis pequeno que permite diferenciar unha medida doutra. Lexibilidade: división máis pequena na pantalla da balanza Tipos de balanzas As balanzas de laboratorio varían na súa capacidade máxima de carga e na súa legibilidade, e clasifícanse como: 1. Microbalanzas: capacidade de 0,5-3 g; lexibilidade de 0,001 mg 2. Balanzas semimicro: capacidade g, según a casa comercial, e lexibilidade de 0,01 mg 3. Balanzas analíticas: g e lexibilidade de 0,1 mg 4. Balanzas de precisión: capacidade de carga de g; lexibilidade 0,001g- 0,1 g Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión Algunhas balanzas, do tipo 2-4, teñen capacidade e lexibilidade dual: poden aumentar a súa capacidade diminuíndo a súa legibilidade ou diminuír a súa capacidade e aumentar a súa lexibilidade. 4

9 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Consideracións prácticas en medidas de masa 1. Localización da balanza a) Nunha sala cunha entrada, o mínimo número de fiestras. Evitar a luz directa do sol e correntes de aire. Evitar choques e vibracións. Se as balanzas están situadas en lugares con alto grao de vibración, recoméndase colocalas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, a amortiguación por aire evita todo tipo de oscilacións e vibracións dunha forma efectiva). b) Manter a temperatura da sala constante. Humidade entre 45-60%. c) Realizar as medidas lonxe de fontes de calor e de aparellos que utilicen ventiladores. 2. Cuidados básicos a) Comprobar que a cámara de medida e o prato estean limpos. b) Verificar sempre a nivelación da balanza. c) Conectar e esperar tempo de arrequecemento. Se se deixa no modo stand by evítase posteriores esperas. d) Usar sempre un pesasustancias ou frasco da menor medida posible, limpos e secos. e) Non usar frascos de plástico cando a humidade estea por baixo do 30-40%. f) A temperatura do frasco e o seu contido deben de estar á mesma temperatura do ambiente da cámara de medida. As diferenzas de temperatura causan correntes de aire. g) Evitar o contacto directo dos dedos ao pór ou sacar os pesasustancias ou frascos da cámara de medida. h) Pór o pesasustancias ou frasco no centro do prato de medida. i) Verificar se o mostrador indica cero ao empezar a operación. Tarar a balanza se fose necesario. j) Calibrar a balanza regularmente se os patróns de referencia son externos. As balanzas analíticas de precisión que utilizan patróns internos poden calibrarse automaticamente. Exercicio 1. Nivelación, calibración e precisión dunha balanza Denver Maxx. Preparación de 100 ml de NaCl 1 M. 5

10 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 2.2 Pipetas No laboratorio, a medición precisa do volume é tan importante como a medición precisa da masa. A medición fiable do volume realízase cunha pipeta, unha bureta ou un matraz aforado. As pipetas permiten a transferencia de volumes medidos exactamente dun recipiente a outro Tipos de pipetas de uso común no laboratorio 1. Aforadas: transfiren un só volume fixo, hainas desde 0.5 a 200 ml. 2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 ml. Ambas se enchen ata a marca de calibración. A superficie alta dun líquido contido nun tubo estreito presenta unha marcada curvatura ou menisco. É unha práctica común usar a parte inferior do menisco dos líquidos acuosos como o punto de referencia na calibración e emprego das pipetas. O enchido das pipetas nunca se debe de facer aspirando coa boca. Existen accesorios auxiliares para macropipeteado que facilitan a operación de carga e descarga. Pipeta aforada Pipeta graduada Aspirador Macro de Brand Aspiradores de seguridade Dentalab A transferencia realízase apoiando a pipeta no bordo do recipiente recibidor e nunca se sopra o líquido residual. 6

11 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Exercicio 2. Manexo de aspiradores de seguridade de pipetas da casa Dentalab. 1. Aspiración: Vire a roda cara arriba e aspire, sen producir burbullas, ata situarse un pouco por encima da marca de calibración. Desprace lentamente a roda en sentido contrario para o axuste da pipeta. Preste atención ao menisco. 2. Baleirado: Presionar a panca unha vez que a pipeta estea dentro do tubo ou recipiente recibidor. 3. Pipetas automáticas: micropipetas e macropipetas a) Micropipetas: transferencia de volumes de microlitros de líquido. - Monocanal de volume fixo: único volume de transferencia, existen distintas pipetas que cobren o intervalo entre 1 ml e 1000 ml. - Monocanal de volume variable: elección do volume de transferencia mediante desprazamento dun micrómetro de axuste localizado na parte dianteira ou superior do dispositivo. Posúen un indicador do volume seleccionado. Cun número reducido de aparellos cóbrese o intervalo entre 0,1 ml e 1000 ml. - Multicanal: igual que a anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultaneamente o mesmo volume. Intervalo entre 0,5-300 ml. Micrómetro Indicador de volume Monocanal fixa e variable Multicanal e variable b) Macropipetas: transferencia de volumes de mililitros de líquido. - Monocanal de volume variable: ata 2, ata 5 ou ata 10 ml. 7

12 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, O uso adecuado das pipetas automáticas está asociado á elección da punta de pipeta correspondente. N: 0,1 20 μl A: 0,5 20 μl B: μl C: μl D: μl E: 0,5 5 ml * As máis comúns son a B e a D, puntas amarelas e azuis respectivamente. Exercicio 3. Manexo de carga e descarga de pipetas automáticas. 1. Elixa unha pipeta de volume variable das dispoñibles no laboratorio. 2. Seleccione o volume desexado virando con coidado o micrómetro. Nunca supere a capacidade máxima da pipeta. 3. Insira a punta desechable adecuada á pipeta elixida. 4. Oprima o botón pulsador situado na parte superior da pipeta ata un primeiro tope. Esta operación despraza un volume de aire coñecido na punta desechable. 5. Insira a punta desechable dentro do líquido, auga destilada no noso caso, e libere a presión sobre o botón pulsador. Este feito aspira o líquido pola punta. 6. Coloque a punta sobre a parede do recipiente recibidor e oprima o botón pulsador ata o primeiro tope. Logo dun segundo, oprima o botón ata un segundo tope para baleirar completamente a punta. 7. Expulsar a punta desechable. 8. Practique ata conseguir o dominio da pipeta. 9. Cando estea seguro pase ao exercicio seguinte. 8

13 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Exercicio 4. Comprobación do pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx). 1. Utilice unha pipeta de 1 ml fixa ou variable. 2. Utilizar como líquido de transferencia auga destilada. 3. Situar un vaso de precipitados de 25 ml sobre a balanza e axustala a cero. 4. Pipetear no vaso un mililitro. 5. Anote a súa masa. 6. Volva a tarar a balanza e engada 1 ml máis. 7. Anote a súa masa. 8. Repita a operación ata completar 5 mostras. 9. Cambie a pipeta cun compañeiro e inicie o proceso desde o punto 3-8. O uso de pipetas automáticas esixe unha comprobación regular da exactitude e precisión das mesmas. Exactitude: indicada por E = diferenza entre o valor medio e o valor nominal referida ao valor nominal en %. O control da exactitude realízase mediante control gravimétrico e aplicando un factor de corrección Z. Z = 1,0032 μl/mg se o control realízase a unha temperatura de 21,5 ºC a unha presión atmosférica de 1013 mbar e con auga destilada. Precisión: indicada polo coeficiente de variación e definido este como a desviación estandard en %, referida ao valor medio. Exercicio 5. Simulación do control da exactitude da pipeta automática de 1 ml, utilizando os datos obtidos no exercicio 4. 9

14 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 4. Pipetas automáticas repetitivas No laboratorio disponse tamén de pipetas automáticas repetitivas para a dosificación en serie ou para situacións que requiren transferencia repetida dun volume particular. Permite dosificar repetitivamente un volume determinado cunha soa carga. Palanca de dosificación Mando selector de volume O número de repeticións depende do volume seleccionado no mando deslizante de axuste e do combitip correspondiente (ver táboa 1). Palanca de bloqueo e de llenado combinados Táboa 1 Exercicio 6: Manexo dunha pipeta repetitiva. 10

15 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, INSTRUMENTO BÁSICO DE MEDIDA PEACHÍMETRO O PHMETRO 1. Obxetivo 1.1 Consideracións prácticas, calibración e manexo dun phmetro. 2. Introdución O phmetro, portátil ou de sobremesa, é un instrumento utilizado nos laboratorios químicos e biolóxicos para medir o ph das disolucións. O ph determina moitas da características notables da estrutura e actividade das biomacromoléculas e, xa que logo, o comportamento de células e organismos. O phmetro utilízase tamén para determinar o ph de augas, chans, bebidas e alimentos. Os instrumentos portátiles facilitan a medida en campo. Ao phmetro, que mide a diferenza de potencial existente entre dous electrodos, conéctase un electrodo combinado de ph: un electrodo de vidro (indicador) e un electrodo de referencia montados ambos nun só corpo. Constitúese así o sistema necesario para a medida de ph, que debe ser sempre precedida dunha calibración do equipo con disolucións tampón de ph coñecido. Se o phmetro ha de ser informado da temperatura da mostra conéctase tamén un sensor de temperatura, a non ser que o electrodo dispoña do mesmo. A medida do ph vese afectada pola temperatura. Electrodo combinado de ph No debuxo móstranse os compoñentes e localización das partes esenciais dun electrodo combinado de ph, co electrodo indicador no centro e o de referencia no exterior. 11

16 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Conector Tipos de elementos de referencia Cable Cabezal Para emulsións De penetración Orificio de relleno De superficie Tipos de electrodos Para micromuestras Electrolito de referencia: (KCl 3M) ponte salino entre o electrodo e o exterior. Impide que os compoñentes da disolución obxeto de medida mistúrense cos do electrodo de referencia. Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados e con barrera a iones Ag + Diafragma: punto de unión entre electrolito e mostra. De cerámica porosa, que permite un pequeno fluxo de electrolito cara ao exterior estableciendose o circuíto eléctrico para medición. Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl. Membrana de vidrio: sensible a H 3 O + Electrodo con sensor de temperatura. 12

17 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 3. Consideracións prácticas 1. Se o electrodo de ph é rellenable, verificar o nivel de electrolito de referencia. Este debe chegar cerca do orificio de enchido, asegurando un bo fluxo de electrolito a través do diafragma. 2. Verificar a ausencia de burbullas de aire na zona da membrana, se se observa algunha sacudir o electrodo cuidadosamente. 3. Limpar o electrodo con auga destilada. Non secar cun pano, utilizar un papel sen pelusa, aplicándoo suavemente para evitar cargas electrostáticas, e retirar o exceso de auga. 4. Se as medicións realízanse a temperatura ambiente mergullar o electrodo ata cubrir como mínimo o diafragma. 5. Se as medicións realízanse a temperatura distinta da ambiente mergullar o electrodo ata cubrir o sensor de temperatura e o elemento de referencia. 4. Calibración 1. Recoméndase unha calibración diaria antes de proceder ás medicións. Se se realizan moitas é aconsellable repetir a calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar a posible deriva do electrodo (potencial de asimetría) ou unha perda de sensibilidade do mesmo (pendente). 2. Co phmetro conectado, e o electrodo mergullado en disolución tampón de ph coñecido (7.02 xeralmente), esperar o tempo indicado nas instrucións do aparello antes de proceder á calibración. 3. Calibrar sempre con disolucións tampón frescas. Estas altéranse co paso do tempo, coa calor, a luz e, especialmente, coa contaminación. 13

18 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 4. Non devolver ao frasco do tampón a disolución utilizada. Utilizar frascos pequenos para a calibración. 5. Entre medidas, lavar con auga destilada e utilizar un papel sen pelusa para retirar o exceso de auga. 6. É recomendable para a calibración, así como para as medicións, utilizar axitación. Un imán e un axitador magnético proporcionan rapidez e repetibilidade nas lecturas. Tipos de calibración 1. Nun punto, cando se miden valores de ph próximos ao valor do tampón utilizado. 2. En dous puntos, a habitual. Recoméndase como primeiro tampón o de ph 7 e como segundo tampón pode utilizarse o de ph 4 ó 9 dependendo de se se traballa na zona aceda ou alcalina. Corríxese o potencial de asimetría e a perda de sensibilidade do electrodo. 3. En tres puntos: se se mide en toda a escala de ph. Primeiro punto o tampón de ph 7, segundo e terceiro punto dous dos valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25ºC). Compénsase o potencial de asimetría e sensibilidade tanto na zona aceda como na alcalina. Exercicio 1. Calibración en dous puntos dos equipos, marca CRISON, dispoñibles no laboratorio, e seguindo o manual de instrucións do equipo correspondente. DISOLUCIÓNS E CONCENTRACIÓNS DISOLUCIÓNS STOCK, DISOLUCIÓNS DE TRABALLO, DISOLUCIÓNS TAMPÓN 1. Obxetivo 1.1 Consideracións prácticas e preparación de disolucións usadas na experimentación. 1.2 Preparación dunha disolución tampón e medida do ph. 14

19 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 2. Introdución A experimentación biolóxica utiliza técnicas de laboratorio que poden ser de observación, analíticas e /ou bioensaio. O bioensaio pode realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, ou in vitro, utilizando órganos, tecidos ou suspensións de células illadas. O bioensaio é unha técnica moi utilizada en Fisioloxía Animal. Os estudos requiren habitualmente o uso de disolucións cunha concentración iónica e osmolaridade que manteñan a integridade e funcionalidade celular, e nos in vitro, ademais, que a disolución estea tamponada. É dicir, que conteña un sistema tampón ou buffer para amortecer as variacións de ph que puidesen producirse ao longo dun traballo experimental, do mesmo xeito que fai o plasma. 3. Disolucións e concentracións No laboratorio a concentración das disolucións exprésase de dúas formas: concentración molar ou concentración porcentual. Concentración molar, é o nº de moles dunha especie contida nun litro (1L) de disolución. Unidade de concentración molar = molaridade (M), dimensións mol.l -1 ou mmoles.ml -1 de disolución. 1 mmol = 10-3 mol. Concentración porcentual (partes por cen): tres formas de expresala; a) tanto por cento en peso (p/p): peso do soluto. peso da disolución b) tanto por cento en volume (v/v): volume do soluto. volume de disolución c) tanto por cento en peso/volume: peso do soluto (g). volume da disolución (ml) Exercicio 1. - Preparar 100 ml de NaCl 154 mm. - Preparar unha disolución de NaCl 0.9% (p/v). Qué observación destacaría? Disolucións nai e disolucións de traballo No laboratorio, é habitual preparar as disolucións de traballo a partir de disolucións concentradas, ás que se lles chama disolucións nai ou disolucións stock. As disolucións stock, ademais de proporcionar rapidez, diminúen os posibles erros que se producirían durante continuas pesadas dos compoñentes das disolucións de traballo. 15

20 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, Para preparar disolucións diluídas a partir das concentradas utilízase a seguinte ecuación, a cal baséase en que o nº de moles de soluto da disolución diluída é igual ao de moles no reactivo concentrado. V concentrada. Moles/L concentrada = V diluida. Moles/L diluida,, é dicir: V 1.C 1 = V 2.C 2 Volume en litros e concentración molar en moles/l. Ou volume en ml e concentración molar en mmoles/ml. Exercicio 2. Tomando como disolución stock a de NaCl 1 M, calcular o volume que habería que tomar para preparar 10 ml de NaCl 150 mm. 5. Disolucións tampón Sistemas tampón ou buffers son aquelas disolucións cuxa [H + ] apenas varía ao engadir ácidos ou bases fortes. Adoitan ser mesturas binarias dun ácido débil e un sal do mesmo ácido con base forte, ou ben unha base débil e o sal desa base cun ácido forte. A eficacia amortiguadora do sistema depende da proporción relativa das formas disociada e sen disociar, sendo máxima cando o cociente sal /ácido é próximo á unidade. Esta proporción está relacionada co ph pola ecuación de Henderson-Hasselbach. ph = pk + log sal / ácido O Tris-HCl é un tampón para medios biolóxicos de uso habitual no laboratorio. Está composto da base Tris-aminometano (Tris), e o seu sal cloruro de Tris. Con todo, non se adoita comprar o sal, senón só a base, que se disolve e leva ao ph requirido engadindo HCl. A cantidade de HCl non se adoita medir con precisión, senón que é a necesaria para levar a solución ao ph desexado. Exercicio 3. Preparar 100 ml de Tris-HCl 0.1M a ph = 8, medindo no phmetro a temperatura ambiente. 16

21 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 6. Disolución isotónica Unha disolución na que se poden introducir as células sen que se vexa alterado o seu volume celular denomínase isotónica. Son disolucións isotónicas (moleculares, electrolíticas ou mixtas) as que teñen a mesma osmolaridade que o plasma. Osmolaridade /L = M. M = concentración molar do soluto. = nº de partículas en que se disocia o soluto cando está en disolución. Osmolaridade/L dunha disolución constituida por un conxunto de solutos = suma de osmolaridades parciais. Osmolaridade O movemento pasivo de auga a través dunha membrana semipermeable, e a favor da súa gradiente de concentración, denomínase ósmosis. O grao de presión necesario para interromper completamente a ósmosis recibe o nome de presión osmótica. A presión osmótica é proporcional ao número de partículas disoltas / unidade de volume líquido. A concentración das disolucións osmóticas en base ao nº de partículas, exprésase en osmoles. Un osmol é a cantidade de soluto non disociado cuxa presión osmótica corresponde a un mol. Cando os non electrolitos disólvense nun litro de auga, as moléculas individuais entran en solución separadamente, e cada unha constitúe unha partícula disolta. Como un mol de soluto ten o mesmo número de moléculas (nº de Avogadro), unha disolución de glicosa 0.1M ten o mesmo nº de partículas que unha disolución de urea 0.1M. E ambas a mesma presión osmótica = 0.1 osmoles. Cando os electrolitos disólvense nun litro de auga, as moléculas individuais se disocian en dúas ou máis iones, cada un dos cales constitúe unha partícula disolta. Así 0.1 mol de NaCl, que se disocia en Cl - e Na +, dá lugar a dúas partículas e, polo tanto, exerce unha presión osmótica = 0.2 osmoles. Unha disolución que contén 1 osmol de soluto disolto por litro de auga dise que ten unha osmolaridade de 1 osmol/l. Exercicio 4. Se a osmolaridade plasmática é de 0.3 Osmoles/L, unha disolución de NaCl 0.15M é isotónica? E unha de Na 2 PO 4 1M? 17

22 MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, 18

23 2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS (código calendario de prácticas: MICRO)

24

25 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo e solucións. Esterilización Esterilización A esterilización é a eliminación de todos os organismos presentes nun material, incluídas as esporas e outros axentes infecciosos. A metodoloxía utilizada depende da natureza do material que se vai a esterilizar. Os principais métodos para destruír ou eliminar microorganismos son os seguintes: 1. Calor húmido. Esterilización por vapor É o método máis común, eficaz e cómodo de esterilización. O vapor de auga a elevadas temperaturas mata os microorganismos porque degrada os ácidos nucleicos e desnaturaliza as proteínas. O tempo e a temperatura necesarios para a esterilización dos medios de cultivo e do material dependen dos microorganismos que se pretenden destruír, da composición química dos medios, da cantidade de material e do volume de medio que se esteriliza. A esterilización por vapor realízase nun autoclave, aparello similar a unha pota a presión na que o aire presente inicialmente na cámara expúlsase quedando completamente chea de vapor de auga. A presión de vapor interna ascende ata que se alcanzan 121º C de temperatura e 1,1 Kg/cm 2 de presión. Nestas condicións todas as formas vexetativas e endosporas destrúense en minutos, aínda que o tempo estándar de esterilización é de 15 minutos. Polo xeral, o autoclave emprégase para esterilizar medios de cultivo e solucións acuosas non termolábiles, material de vidro, plástico e metal. 2. Calor seco É menos efectivo que a calor húmida, necesitándose temperaturas máis altas e tempos máis longos que coa calor húmida para matar aos microorganismos. A morte celular prodúcese debido á oxidación dos compoñentes celulares e a desnaturalización de proteínas. Este tipo de esterilización realízase en fornos especiais de esterilización e require un tempo de exposición longo do material (por exemplo, 2 horas a 160º C ou 1 hora a 180º C). Utilízase principalmente para a esterilización de material de vidro (placas de Petri non esgotábeis, pipetas, etc.) e metal, e nalgúns casos para esterilizar produtos en po, aceites e materiais similares. Unha alternativa de esterilización con calor seca é a incineración, que se utiliza para a destrución de material hospitalario contaminado, animais de experimentación, etc. No laboratorio, a incineración emprégase para a esterilización das asas de sementa metálicas antes e logo de polas en contacto cos cultivos. 21

26 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 3. Filtración È o método alternativo á esterilización por calor cando se esterilizan líquidos termosensibles ou gases. A filtración non destrúe os microorganismos, senón que os elimina mecanicamente, combinando un proceso de retención e absorción. A técnica consiste en facer pasar o líquido ou gas a través dun material poroso, o filtro, cun tamaño de poro demasiado pequeno para que pasen os microorganismos, pero suficientemente grandes para permitir o paso do líquido. Estes filtros reteñen as bacterias, pero deixan pasar os virus. Os filtros que se utilizan normalmente na esterilización de líquidos son o filtro de membrana de acetato de celulosa ou nitrato de celulosa cun tamaño de poro de 0,45 e 0,22 μm. Estes últimos son os que garanten a eliminación das bacterias, xa que as bacterias máis pequenas coñecidas miden ao redor de 0,3 μm. Para facilitar o paso das solucións a través dos filtros de membrana aplícase presión ou se fai baleiro, tendo presente que os recipientes de recollida das solucións filtradas deben estar estériles. Hai un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retención de partículas de aire (HEPA, highefficiency particulate air) que se utilizan nas cabinas de fluxo laminar e de seguridade biolóxica porque permiten eliminar o 99,9 % das partículas maiores de 0,3 μm presentes no aire. 4. Radiacións 4.1. Radiacións non ionizantes. Luz UV. A radiación ultravioleta non produce ionización ao incidir sobre unha molécula, pero si excitación dos seus electróns, facendo que reaccione de forma anómala. A acción bactericida máis efectiva da luz UV prodúcese a 260 nm, que é o máximo de absorción do DNA. A capacidade de penetración da luz UV é moi baixa, non podendo atravesar o vidro ou líquidos, polo que só se utiliza para a esterilización de superficies (as cámaras de fluxo laminar) ou a esterilización de aire en quirófanos ou salas asépticas. Nalgúns casos específicos tamén pode usarse para a esterilización de auga Radiacións ionizantes. Raios gamma e raios X. Debido á súa elevada enerxía, causan a ionización das moléculas e a aparición de radicais libres altamente reactivos que destrúen compoñentes celulares como o DNA e as proteínas. As radiacións ionizantes, ademais de ter un maior poder microbicida que a radiación ultravioleta, presentan un maior poder de penetración, podendo esterilizar o interior do material empaquetado. Aínda que son altamente efectivas contra formas vexetativas e endosporas, non sempre o son contra virus. Debido ao perigo do equipo de radiación, este tipo de esterilización limítase ás aplicacións industriais a gran escala, empregándose para esterilizar material plástico, material farmacéutico (antibióticos, hormonas), etc. 22

27 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 5. Esterilización con axentes químicos A maior parte dos axentes químicos antimicrobianos utilízanse na desinfección e non destrúen as esporas, polo tanto non son esterilizantes. Con todo, en condicións apropiadas, compostos como o óxido de etileno ou o glutaraldehido eliminan formas vexetativas e esporas, polo que deben clasificarse dentro dos axentes esterilizantes. Estes compostos se empregan na esterilización de instrumentos e material de plástico. Medios de cultivo e solucións Os medios de cultivo son as solucións nutritivas que se usan no laboratorio para o crecemento e mantemento dos microorganismos. Tamén se poden empregar para demostrar unha característica fisiolóxica ou bioquímica do microorganismo (utilización dunha fonte de carbono, produción de ácido, produción de gas, etc). Antes do seu emprego, tanto os medios de cultivo como as solucións e todo o material empregado para a manipulación dos microorganismos deben estar estériles para evitar a entrada de microorganismos contaminantes. Tipos de medios de cultivo En función da súa composición química pódense dividir en : Medios definidos: coñécense a composición química exacta do medio. Permite coñecer os compostos que metaboliza o microorganismo estudado. Medios complexos ou non definidos: conteñen algúns compoñentes cunha composición química descoñecida. Na súa preparación adóitanse empregar peptonas (hidrolizados parciais de proteínas do leite, carne, soia, fermentos), extractos de carne, de fermento ou outras sustancias moi nutritivas pero non definidas quimicamente. Resultan moi útiles e son os máis utilizados porque un único medio pode satisfacer as necesidades nutricionais de diversos microorganismos. Tanto se se trata de medios definidos como complexos, falamos de medios de cultivo líquidos ou caldos e medios sólidos. Para pasar un medio líquido a medio sólido tan só é necesario engadir un axente xelificante que permita ao medio líquido solidificar: a adición de agar ao 1,5 % ao medio líquido é o procedemento comunmente empregado. Existen unha serie de medios de cultivo cuxa composición axuda a establecer ou pór de manifesto determinadas propiedades dos microorganismos que poden servir para o seu illamento e ou clasificación. Neste caso falamos de: Medios xerais: permiten o crecemento da maioría dos microorganismos aerobios e anaerobios facultativos (exemplo: Triptona Soja Agar, Agar Nutritivo, etc). 23

28 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Medio de enriquecemento: favorecen o crecemento dun tipo de microorganismo en concreto pero sen inhibir o crecemento do resto da flora acompañante. Utilízanse para favorecer o crecemento de microorganismos esixentes. Medios selectivos: Incorporan na súa composición compostos químicos que inhiben o crecemento de determinados grupos de microorganismos mentres permiten o crecemento doutros, facilitando así o seu illamento. Utilízanse para illar grupos específicos de bacterias. Medios diferenciais: permiten distinguir tipos diferentes de microorganismos que se atopan xeralmente relacionadas ben morfolóxica ou bioquímicamente. Incorporan compostos químicos que tras a inoculación e incubación producen un cambio característico no aspecto do crecemento bacteriano e ou o medio que os rodea, o que permite a súa diferenciación (exemplo: Agar Citrato de Simons). En numerosos casos, un mesmo medio pode ser á vez selectivo e diferencial (exemplo: Agar Eosina- Azul de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), ou de enriquecemento e diferencial (exemplo: Agar Sangre). É importante ter en conta que distintos microorganismos poden ter requirimentos nutricionais moi diferentes. Xa que logo, para o cultivo correcto dun microorganismo determinado é necesario coñecer as súas esixencias nutritivas e fornecelas nos medios de cultivo cos nutrientes esenciais na forma e proporción adecuadas. Doutra banda, as solucións salinas non son medios de cultivo, posto que non permiten o crecemento dos microorganismos. A súa función consiste en manter os microorganismos en suspensión sen que se vexa afectada a súa viabilidade, debido a que son solucións isotónicas. Obxectivo Coñecer as técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo e solucións empregadas no crecemento, illamento e identificación de diversos microorganismos. Material e Procedementos Numerosas casas comerciais fornecen aos laboratorios os medios de cultivo deshidratados, que se reconstitúen coa adición de auga destilada. Para a súa preparación, séguense as indicacións realizadas polas propias casas comerciais sobre o medio de cultivo. Os medios líquidos se hidratan con auga destilada, distribúense nos recipientes adecuados (tubos de ensaio, matraces, botellas, etc) e tápanse cun tapón metálico, de PVC ou de algodón hidrófugo. A 24

29 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS maioría deles débense esterilizar e, unha vez esterilizados, mantéñense a temperatura ambiente para que arrefríen. Cando a temperatura do medio de cultivo é igual á temperatura ambiental, xa se poden utilizar. Os medios sólidos, unha vez hidratados, férvense para que o agar poida formar un xel homoxéneo co medio cando se arrefríe. A maioría dos medios se esterilizan en autoclave. Se se van a preparar tubos con medio sólido, o medio distribúese nos tubos antes de esterilizalo. Se a finalidade é a preparación de placas, o medio déixase enfriar nun baño ou a temperatura ambiente unha vez estéril. Cando a temperatura do medio alcanza aproximadamente os 50º C repártese asépticamente en placas de Petri estériles a razón de ml de medio por placa. O medio débese deixar solidificar antes do seu emprego. Algúns medios de cultivo conteñen compoñentes altamente selectivos e non é necesario esterilizalos. Polo xeral, os medios de cultivo que non se utilizan mantéñense a 4º C ata o seu emprego. Para a preparación das solucións salinas, disólvense os sales na auga destilada, distribúese nos recipientes adecuados e esterilízase no autoclave. A continuación indícanse os medios de cultivo e solucións que se van preparar así como o material necesario e o procedemento a seguir na súa preparación. Para esta práctica, os alumnos formarán 4 grupos. 25

30 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material GRUPO I - Rotulador. - Pipetas de vidro de 5-10 ml de capacidade. - Dispensador para pipetas de vidro. - Matraces ou botellas de vidro de 500 ml de capacidade. - Matraces ou botellas de vidro de 100 ml de capacidade. - Placas de Petri de 90 mm de diámetro baleiras e estériles. - Tubos de tapón de rosca de 5-10 ml de capacidade. 1. Triptona Soia Agar (TSA) - Medio de cultivo para verter en placa. - Cantidade a preparar: 250 ml. - Repartir en placas de Petri. - Compoñentes/L: - Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/l) - Agar 15 g - Auga destilada ml Procedimiento: Disolver a Triptona Soja Agar na auga destilada quentando ata ebulición. Esterilizar a 121 C/15 min. Verter en placas a razón duns 20 ml por placa. 2. Agar Citrato de Simons (Agar Citrato) - Medio de cultivo para preparar en tubos inclinados. - Cantidade a preparar: 50 ml. - Repartir en 10 tubos (5 ml/tubo). - Compoñentes/L: - Agar Citrato de Simons Cantidade fabricante (24,2 g/l) - Auga destilada ml Procedemento: Disolver o Agar Citrato de Simons na auga destilada quentando ata ebulición. Repartir en tubos e esterilizar a 121 C/15 min. Deixar solidificar en forma inclinada. 26

31 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material GRUPO II - Rotulador. - Pipetas de vidro de 5-10 ml de capacidade. - Dispensador para pipetas de vidro. - Matraces ou botellas de vidro de 500 ml de capacidade. - Matraces ou botellas de vidro de 100 ml de capacidade. - Placas de Petri de 90 mm de diámetro baleiras e estériles. - Tubos de tapón de rosca de 5-10 ml de capacidade. 1. Triptona Soja Agar (TSA) - Medio de cultivo para verter en placa. - Cantidade a preparar: 250 ml. - Repartir en placas de Petri. - Compoñentes/L: - Triptona Soja caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/l) - Agar 15 g - Auga destilada ml Procedemiento: Disolver a Triptona Soja Agar na auga destilada quentando ata ebulición. Esterilizar a 121 C/15 min. Verter en placas a razón duns 20 ml por placa. 2. Agar semisólido - Medio de cultivo para repartir en tubos. - Cantidade a preparar: 50 ml. - Repartir en 10 tubos (5 ml/tubo). - Compoñentes/L: - Caldo Nutritivo Cantidade fabricante (8 g/l) - Agar 7,5 g - Auga destilada ml Procedemento: Disolver os compoñentes en auga destilada quentando ata ebulición. Repartir en tubos e esterilizar a 121 C/15 min. Deixar solidificar os tubos en vertical. 27

32 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material GRUPO III - Rotulador. - Pipetas de vidro de 5-10 ml de capacidade. - Dispensador para pipetas de vidro. - Matraces ou botellas de vidro de 500 ml de capacidade. - Matraces ou botellas de vidro de 100 ml de capacidade. - Placas de Petri de 90 mm de diámetro baleiras e estériles. - Tubos de tapón de rosca de 5-10 ml de capacidade. 1. Medio Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD) - Medio de cultivo para verter en placa. - Cantidade a preparar: 250 ml. - Repartir en placas de Petri. - Compoñentes/L: - Medio XLD Cantidade fabricante (55 g/l) - Auga destilada ml Procedemento: Disolver o medio XLD na auga destilada quentando ata ebulición. NON ESTERILIZAR. Verter en placas a razón duns 20 ml por placa. 2. Triptona Soja Caldo (TSB) - Medio de cultivo para repartir en tubos. - Cantidade a preparar: 50 ml. - Repartir en 10 tubos (5 ml/tubo). - Compoñentes/L: - Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/l) - Auga destilada ml Procedemento: Disolver o TSB na auga destilada. Repartir en tubos. Esterilizar a 121 C/15 min. 28

33 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material GRUPO IV - Rotulador. - Pipetas de vidro de 10 ml de capacidade. - Dispensador para pipetas de vidro. - Matraces ou botellas de vidro de 500 ml de capacidade. - Matraces ou botellas de vidro de 250 ml de capacidade. - Placas de Petri de 90 mm de diámetro baleiras e estériles. - Tubos de tapón de rosca de 10 ml de capacidade. 1. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine (Agar EMB Levine) - Medio de cultivo para verter en placa. - Cantidade a preparar: 250 ml. - Repartir en placas de Petri. - Compoñentes/L: - EMB Levine Cantidade fabricante (37,4 g/l) - Auga destilada ml Procedemento: Disolver o medio EMB Levine na auga destilada quentando ata ebulición. Esterilizar a 121 C/15 min. Verter en placas a razón duns 20 ml por placa. 2. Solución Salina - Solución para repartir en tubos. - Cantidade a preparar: 200 ml. - Repartir en 20 tubos (9 ml/tubo). - Compoñentes/L: - NaCl 8,5 g - Auga destilada ml Procedemento: Disolver o NaCl na auga destilada. Repartir en tubos e esterilizar a 121 C/15 min. Cuestións A.- Indica os medios de cultivo asignados ao teu grupo de traballo e os cálculos realizados para a preparación da cantidade especificada. 29

34 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS PRÁCTICA 2. Cultivo de microorganismos no laboratorio. Reconto de microorganismos viables Primeira parte. Cultivo de microorganismos no laboratorio Unha vez preparado un medio de cultivo, pódese inocular (é dicir, engadir os microorganismos) e a continuación incubar nas condicións que favorezan o crecemento microbiano. Para a adecuada manipulación dos microorganismos é esencial o uso da técnica aséptica. Esta técnica consiste nunha serie de procedementos que evitan a entrada de organismos non desexados ou contaminantes durante a manipulación dos cultivos e dos medios de cultivo estériles (ver como exemplo Figura 1). O problema máis común no laboratorio de microbioloxía é a contaminación a través do aire. Así pois, cando as placas ou tubos ábrense deben manexarse de modo que os contaminantes do aire non penetren. En numerosas ocasións, a finalidade do cultivo é obter e manter un único tipo de microorganismo para Figura 1. Transferencia aséptica. Procedemento de toma de mostra a partir dun medio líquido. Imaxe tomada de Madigan et al., Brock, Biología de los Microorganismos. 30

35 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS poder estudalo en detalle. Cando o cultivo contén un único tipo de microorganismo denomínase cultivo axénico ou puro. Se, polo contrario, o cultivo contén varios tipos de microorganismos denomínase cultivo mixto. A pureza dos cultivos bacterianos pódese verificar mediante a observación das características das colonias sobre unha placa sementada porque as distintas especies forman a miúdo colonias cunha forma e aspecto característico. Obxectivos Coñecer diferentes métodos de sementa empregados para o illamento, identificación e mantemento dos microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros e cultivos mixtos. Coñecer e comprender as vantaxes que supón a utilización de distintos tipos de medio de cultivo para o illamento e identificación dos microorganismos. Nesta práctica empregaranse diferentes métodos de sementa para o cultivo de microorganismos: 1. Sementa en placa 1.1. Sementa en placa en estrías ou por esgotamento É un método cualitativo de illamento de microorganismos procedentes dunha mostra ou dun cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar co asa de sementa un número cada vez máis pequeno de células sobre a superficie dun medio de cultivo sólido en placa de Petri. As células illadas multiplicaranse formando colonias independentes. Unha colonia é unha formación ou agrupación macroscópicamente visible de microorganismos nun medio sólido. É importante indicar que cada colonia é un cultivo puro (poboación de células que procede dunha única célula). Material e medios de cultivo - Rotulador - Asa de sementa curva ou de bucle - 2 placas de medio TSA - 1 Placas de medio XLD - 1 placas de Agar EMB Levine Mostra - Cultivos líquidos: Nº 1 e Nº 2 Procedemento: Empregaranse 2 cultivos líquidos: 31

36 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS - Cultivo Nº 1: débese sementar para illamento en estría nunha placa de TSA e nunha placa de Agar EMB Levine. - Cultivo Nº 2: débese sementar nunha placa de TSA e nunha placa de XLD. Para realizar a sementa seguiranse os seguintes pasos: 1. Rotular a base das placas para poder identificalas. 2. Esterilizar o asa de sementa no chisqueiro Bunsen e deixala arrefriar. 3. Tomar una alícuota do cultivo líquido co asa de sementa e facer estrías paralelas, pero non superpostas, nun extremo da placa de Petri sobre unha parte do medio de cultivo sólido. 4. Esterilizar o asa de sementa e deixala arrefriar. 5. Realizar unha nova serie de estrías perpendiculares ás anteriores, de forma que se arrastren parte dos microorganismos sementados na serie anterior. 6. Esterilizar o asa de sementa e repetir o proceso indicado no punto 4 unha vez máis. Esta terceira serie de estrías non debe superpoñerse á primeira. 7. Esterilizar o asa de sementa antes de depositala na mesa de traballo. 8. Incubar as placas sementadas en estufa a 37 º C durante 24 horas. Cuestións B.- Observa e anota se nas placas de TSA, Agar EMB Levine e XLD sementadas para illamento en estría a partir dos cultivos líquidos fornecidos obtéñense cultivos puros ou mixtos. C.- Considerando que o medio TSA é un medio xeral e os medios Agar EMB Levine e XLD son medios selectivos e diferenciais, a obtención de cultivos puros ou mixtos nestes medios de cultivo a partir dos cultivos líquidos sementados é coherente co que cabería esperar e por que? 1.2. Sementa en placa por inclusión ou en profundidade Trátase dun método cuantitativo empregado para o reconto e illamento de microorganismos, polo que se explicará no apartado correspondente a reconto de microorganismos. 2. Sementa en tubo con medio sólido 2.1. Sementa en tubo en estría Método utilizado para o mantemento de cultivos puros, así como para a determinación dalgunhas características fisiolóxicas e bioquímicas dun cultivo puro de microorganismos. Consiste en arrastrar a suspensión microbiana procedente dun cultivo puro sobre a superficie inclinada do medio de cultivo, facendo unha estría en zig-zag desde a base á parte alta. 32

37 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material e medios de cultivo - Rotulador - Asa de sementa curva ou de bucle - 1 tubo de Agar Citrato de Simons (tubo con agar inclinado) - 1 tubo de TSA (tubo con agar inclinado) Mostra 1 cultivo puro no medio sólido Procedemento O cultivo puro presente na placa de TSA fornecida, débese sementar en estría nos 2 tubos con agar inclinado, tanto no que contén o medio TSA como no que contén Agar Citrato. Para iso, seguiranse os seguintes pasos: 1. Rotular os tubos para poder identificalos. 2. Esterilizar o asa de sementa de bucle e deixala arrefriar. 3. Cargar o asa de sementa estéril coa porción do cultivo que se vai a transferir. 4. Abrir o tubo que contén o medio de cultivo estéril. 5. Flamexar a boca do tubo e introducir o asa de sementa cargada co inoculo bacteriano dentro do tubo e realizar estrías en zig-zag sobre a superficie inclinada do medio de cultivo, dende a base á parte alta do tubo. 6. Flamexar a boca do tubo e tapalo. 7. Esterilizar o asa de sementa. 8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas. Cuestiones D.- Observa e anota se nos dous medios de cultivo sólidos en tubo sementados en estría hai crecemento continuo ou se distinguen colonias illadas. Obsérvase cambio de coloración nalgún deles? 2.2. Sementa en tubo en picadura Método utilizado para a determinación dalgunhas características fisiolóxicas e bioquímicas dun cultivo puro de microorganismos. Neste caso empréganse asas de sementa de picadura. Baséase en introducir un inoculo bacteriano procedente dun cultivo puro nun medio sólido ou semisólido. 33

38 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Material e medios de cultivo - Rotulador - Asa de sementa de picadura - 1 tubo de agar semisólido Mostra 1 cultivo puro no medio sólido Procedemento O cultivo puro presente na placa de TSA fornecida, débese sementar en picadura no tubo con agar semisólido. Para iso, seguiranse os seguintes pasos: 1. Rotular os tubos para poder identificalos. 2. Esterilizar o asa de picadura e deixala arrefriar. 3. Cargar a punta do asa co cultivo puro que se vai transferir. 4. Abrir o tubo que contén o medio de cultivo estéril e flamexar a boca do tubo. 5. Introducir todo o filamento do asa de picadura dentro do medio de cultivo, en dirección perpendicular á base do tubo pero sen chegar a tocar o fondo. 6. Flamexar a boca do tubo e tapalo. 7. Esterilizar o asa de picadura. 8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas. No medio de cultivo semisólido en tubo débese observar crecemento na zona de inoculación, zona pola que pasou o filamento do asa de picadura co cultivo bacteriano. Cuestións E.- No medio de cultivo semisólido en tubo sementado en picadura obsérvase desprazamento no crecemento con respecto á liña de sementa? Que indica o resultado obtido? 34

39 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Segunda parte. Reconto de microorganismos viables. Método de sementa en placa por inclusión ou en profundidade En ocasións, é necesario realizar recontos de microorganismos nunha mostra (por exemplo, en mostras de auga, alimentos, solos, orina, sangue, etc.) para estimar o número de células viables presentes. Unha célula viable defínese como aquela que é capaz de dividirse e dar lugar a unha descendencia. O método habitual para realizar unha determinación de células viables baséase en contar o número de células da mostra que é capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado. Por esta razón, o reconto de células viables tamén se chama reconto en placa ou reconto de colonias. Neste procedemento suponse que cada célula viable pode formar unha colonia. Hai dous métodos para realizar un reconto en placa de microorganismos viables: o método de sementa por extensión, no que un determinado volume da mostra diluída esténdese sobre a superficie dunha placa con medio sólido e o método de sementa por inclusión ou en profundidade, no que se pipetea un volume coñecido (normalmente 1 ml) do cultivo nunha placa de Petri estéril sobre a que se engade o medio con agar fundido (Figura 2). Figura 2. Métodos de sementa para realizar un reconto de células viables en placa: sementa por extensión e sementa por inclusión ou vertido en placa. Imaxe tomada de Madigan et al., Brock, Biología de los Microorganismos. Antes de proceder a sementa da mostra hai unha serie de consideracións importantes. Por unha banda, o reconto pódese realizar tanto en mostras líquidas como en sólidas, pero neste último caso será necesario preparar unha suspensión ou dilución inicial coa mostra empregando unha solución isotónica estéril. Adicionalmente, o número de colonias presentes nas placas non debe ser demasiado grande, pois algunhas colonias poderíanse fusionar e as estimacións obtidas serían erróneas. Tamén é importante non obter un número de colonias demasiado baixo, para que o cálculo sexa máis preciso e non se arrastren erros asociados coa preparación de excesivas dilucións. En xeral, considérase que o número de colonias por placa apropiado para o reconto oscila entre 30 e 300. Para conseguilo, case sempre se dilúe a mostra 35

40 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS (Figura 3). Tendo en conta que raramente se sabe de antemán o número de células viables, adóitanse facer varias dilucións decimais sucesivas da mostra. Tanto a preparación da suspensión inicial (mostras sólidas), como das dilucións decimais sucesivas, forman parte da preparación da mostra para a análise. Nesta práctica empregarase unha mostra líquida que contén unha concentración descoñecida de microorganismos. Por iso, antes de proceder a súa sementa, débense preparar unha serie de dilucións decimais sucesivas e posteriormente sementaranse en placa. Vaise a empregar un medio de cultivo xeral, polo tanto realizarase un reconto da totalidade dos microorganismos viables presentes na mostra líquida de partida. Figura 3. Procedemento para a determinación de células viables usando dilucións seriadas da mostra e o método de sementa por inclusión ou vertido en placa. Imaxe tomada de Madigan et al., Brock, Biología de los Microorganismos. 36

41 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Obxectivo Realizar o reconto de microorganismos viables presentes nunha mostra problema. Material, solucións, medios de cultivo e mostra a empregar 1. Preparación de dilucións decimais sucesivas Material e soluciones - Rotulador - Pipeta automática con capacidade para 1 ml - Puntas de pipeta estériles con capacidade para 1 ml - 3 tubos con 9 ml de solución salina estéril Mostra - Cultivo bacteriano líquido 2. Sementar en placa por inclusión ou en profundidade Material e medios de cultivo - Rotulador - Pipeta automática con capacidade para 1 ml - Puntas de pipeta estériles - 4 placas de Petri baleiras e estériles - 1 botella con 100 ml de TSA licuado e mantido nun baño a 45º C Mostras - As dilucións 1/100 e 1/1000 obtidas a partir da mostra de partida. Procedemento 1. Preparación de dilucións decimais sucesivas A partir da mostra líquida fornecida, prepararanse tres dilucións da mostra: dilucións 1/10, 1/100 e 1/1000. Para iso, seguiranse os seguintes pasos: 1. Rotular os tubos coas distintas dilucións que se van a realizar. 2. Preparación de dilución 1/10: usando unha punta de pipeta estéril, tómase 1 ml da mostra e transfírese a un tubo con 9 ml de solución salina estéril. A continuación, axítase o tubo por rotación (nunca por investimento) para unha homoxenización completa do inoculo incorporado co diluínte. 37

42 TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 3. Para facer dilucións sucesivas (dilucións 1/100 e 1/1000), úsase unha nova punta de pipeta estéril en cada paso da dilución, tómase 1 ml da dilución precedente e se leva a un tubo con 9 ml de solución salina estéril, recordando que se debe axitar sempre o tubo unha vez incorporado o inoculo. 2. Sementa en placa por inclusión ou en profundidade 1. Coller as dúas placas de Petri baleiras e rotulalas na base para poder identificalas. Indicar tamén a dilución que se vai sementar. 2. Tomar unha alícuota de 1 ml da dilución 1/100, utilizar para iso unha punta de pipeta estéril. 3. Depositar a alícuota sobre o fondo das placas de Petri. 4. Verter sobre as placas inoculadas uns 20 ml de TSA fundido e mantido a 45 C. 5. Axitar as placas suavemente mediante movementos circulares e de translación. 6. Deixar solidificar, invertir as placas e incubar en estufa a 37 C durante 24 horas. 7. Proceder da mesma forma para a dilución 1/1000 empregando unha nova punta de pipeta estéril. Conta as dúas placas da dilución que conteñan entre 30 e 300 unidades formadoras de colonias (UFC) e calcula a media aritmética. O resultado obtido multiplicarase polo inverso da dilución e referirase como UFC/mL de mostra. Cuestións F.- Indica os cálculos realizados para obter o reconto de microorganismos viables presentes na mostra fornecida, especificando o reconto obtido en placa e a dilución empregada. Anota tamén o resultado final. 38

43 3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA (código calendario de prácticas: FV)

44

45 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS Obxectivos: a) Coñecer e comprender as variacións de cor dunha sustancia dependendo do ph. b) Coñecer e comprender as variacións de cor dunha sustancia dependendo da concentración. A espectrofotometría é o método de análise óptica máis usado nas investigacións químicas e biolóxicas. A maioría dos problemas analíticos reais comezan cunha complexa mestura a partir da cal é necesario illar, identificar e cuantificar un ou máis compoñentes da mesma. Pódense expor as seguintes cuestións: unha, de carácter cualitativo (de que compoñente trátase?), e outra de carácter cuantitativo (canto hai dese compoñente?). Para iso, pódese utilizar o método instrumental de análise, como é a espectrofotometría para medir a absorción de radiación ultravioleta e visible que interactúa coa materia (átomos e moléculas), a mesma é considerada unha técnica cualitativa e cuantitativa baseándose na medición da cor ou da lonxitude de onda dunha radiación e intensidade da mesma. Fundamento da espectrofotometría Todas as sustancias poden absorber enerxía radiante, ata o vidro que parece ser completamente transparente absorbe radiación de lonxitudes de ondas que non pertencen ao espectro visible e a auga que absorbe fortemente na rexión do infravermello. A absorción das radiacións ultravioletas, visibles e infravermellas depende da estrutura das moléculas e é característica para cada sustancia química. Cando a luz atravesa unha sustancia, parte da enerxía é absorbida e a enerxía radiante non pode producir ningún efecto sen ser absorbida. A cor das sustancias débese a que estas absorben certas lonxitudes de onda da luz branca que incide sobre elas e só as lonxitudes de onda non absorbidas poden ser visualizadas. Denomínase espectro electromagnético á distribución enerxética do conxunto de ondas electromagnéticas 41

46 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA A espectrofotometría ultravioleta-visible usa feixes de radiación do espectro electromagnético, no rango UV de 80 a 400 nm, principalmente o comprendido entre 200 e 400 nm e no da luz visible de 400 a 800 nm, polo que é de gran utilidade para caracterizar os materiais na rexión ultravioleta e visible do espectro. Ao campo de luz UV comprendido entre 200 e 400 nm coñéceselle tamén, como rango de UV próximo, a espectrofotometría visible soamente usa o rango do campo electromagnético da luz visible, de 400 a 800 nm. O espectrofotómetro é un instrumento que permite comparar a radiación absorbida ou transmitida por unha solución que contén unha cantidade descoñecida de soluto e unha que contén unha cantidade coñecida da mesma sustancia. As técnicas espectrofotométricas permiten determinar a identidade e a concentración de compoñentes disoltos nunha mostra incógnita. O espectro de absorción dun material mostra a fracción 42

47 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA da radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro dun rango de lonxitudes de onda, achegando información sobre a molécula, posto que está relacionado coa súa estrutura molecular. Practica 1. Efecto do ph sobre o espectro de absorción Os cambios nas condicións ambientais dunha molécula poden provocar cambios na súa estrutura molecular. Así, un cambio no ph pode provocar alteracións no seu espectro de absorción. O composto que se usará na práctica será o laranxa de metilo, que é un colorante que se utiliza como indicador de ph. Realizarase o espectro de absorción entre 350 e 650 nm de distintas solucións de laranxa de metilo á mesma concentración pero con distintos phs no medio. Naranja de metilo Procedemento En primeiro lugar prepáranse as seguintes solucións de traballo, a partir das cales prepararemos as solucións a analizar: 1) Solución de laranxa de metilo. Para iso pésase na balanza de precisión 1 mg de laranxa de metilo empregando para iso unha espátula e un tubo de centrífuga. Posteriormente disólvese en 5 ml de H2O. 43

48 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA 2) Solución de ácido cítrico 0.1 M. Determinarase a cantidade a pesar para preparar 30 ml de solución. 3) Solución de ortofosfato bisódico 0.2 M. Determinarase a cantidade a pesar para preparar 15 ml de solución. Este sal tarda máis en disolverse que o ácido cítrico, é recomendable comezar por ela e axudarse de axitación mecánica. Unha vez preparadas as tres soluciones nai, procederase a mesturar as solucións 2 e 3 seguindo a táboa seguinte, para preparar as solucións tampón: ph aproximado Sol. Na 2 HPO 4 (ml) Sol. Ácido cítrico (ml) Neste punto teremos 5 tubos de ensaio que formarán un gradiente de ph. A continuación engádense cunha micropipeta 0.1 ml da solución stock de laranxa de metilo a cada unha das solucións tampón e axítanse as solucións. Unha vez comprobado que se xera un gradiente de cor, realízanse os espectros de absorción entre 350 e 650 nm das distintas mostras. Cuestións: 1. Comentar os resultados. Describir a gráfica obtida, observando as variacións nos espectros de absorción e comentando como aumenta ou diminúe a absorbancia en función da lonxitude de onda e o ph do medio. 2. Obsérvase un punto isosbéstico cando nunha solución coinciden dúas especies absorbentes en equilibrio. Observa a gráfica. Podes localizar algún punto isosbéstico? Existe algún punto no que a absorbancia non dependa do ph do medio? 3. En cada un dos tubos o ph é distinto. Por qué varía o espectro de absorción do laranxa de metilo ao variar o ph? 44

49 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA Practica 2. Efecto da concentración sobre o espectro de absorción. Introdución: A lei de Beer-Bougher-Lambert predicir que para unha molécula en disolución, un cambio na súa concentración provocará un cambio proporcional na absorbancia. O aumento na concentración dos compostos aumenta as interaccións entre as súas moléculas, cambiando o seu espectro de absorción. Aínda que na maior parte dos casos este efecto pode desprezarse, non ocorre así no caso do azul de metileno. 45

50 TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA As condicións nas que se atopa unha molécula poden determinar cambios estruturais que afecten ás súas propiedades. Nesta práctica observaremos como un aumento na concentración dunha sustancia pode desencadear un cambio estrutural que cambie notablemente as súas propiedades de absorción de luz. Procedemento Prepáranse 10 ml dunha solución stock de azul de metileno 1 mm (1x10-3 M) en auga destilada. A partir da solución stock prepáranse 10 ml das seguintes diluciones: 1x10-4, 1x10-5, e 1x10-6 M. Realízase un espectro de absorción entre 400 e 700 nm das solucións 1x10-4 e 1x10-6 M. A continuación mídese a absorbancia das tres solucións a 610 e a 663 nm. Cuestións: 1. Representar gráficamente a absorbancia ás dúas lonxitudes de onda fronte á concentración, calculando o coeficiente de correlación lineal para cada unha das lonxitudes de onda. 2. Calcular a cociente entre a absorbancia a 610 e a absorbancia a 663 das tres solucións. 3. Comentar os resultados obtidos tanto para os espectros de absorción realizados no laboratorio como para as gráficas do apartado 1. Obsérvase algunha desviación da Lei de Beer-Bougher-Lambert? Cal podería ser a explicación destes resultados? 46

51 4. TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA (código calendario de prácticas: BC)

52

53 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA INTRODUCIÓN O procesado dunha mostra histolóxica (animal ou vexetal) para o seu estudo ao microscopio comporta a realización dunha serie de pasos e protocolos coa fin de poñer de manifesto as estruturas tisulares dunha forma o máis parecido posible a como se atopan en estado vivo. Cada un destes pasos pode presentar variacións particulares dependendo das características da mostra biolóxica obxecto de estudo, das estruturas tisulares e celulares que se van observar e do tipo de microscopio no que se queiran observar (óptico (MO) ou electrónico (ME)). Os pasos xerais que se seguen neste procesado son: 1.- Fixación. O obxectivo da fixación é preservar o tecido coas características estruturais e de composición química que presentaba no estado vivo. A fixación evita a alteración da morfoloxía do tecido detendo os procesos de degradación que teñen lugar trala morte celular, como a autólise ou a putrefacción. Ademais, endurece o material, conferíndolle protección fronte ao dano que puidese ocasionar a manipulación do tecido nos pasos seguintes á fixación, e fai insolubles os constituíntes celulares que se pretenden estudar que, sen a fixación, se disolverían durante o manexo posterior. Non existe ningún fixador que faga insolubles todos os compoñentes tisulares, polo que a elección do fixador é importante dependendo do ou dos compoñentes obxecto de estudo. Os lípidos son os compoñentes tisulares máis difíciles de fixar, xa que a maioría dos fixadores os disolven. Normalmente empréganse fixadores líquidos que poden utilizarse sós (fixador simple) ou mesturados (mestura fixadora). O fixador simple máis utilizado é o formaldehido (ou formol), pero outros exemplos son o etanol, ácido pícrico, ácido acético, paraformaldehido, glutaraldehido, tetróxido de osmio, etc A mestura fixadora máis utilizada é o líquido de Bouin [ácido pícrico, formol e ácido acético], que é considerado como o fixador universal porque conserva moi ben a estrutura tisular. Para fixar o tecido introdúcese a peza nun bote con fixador durante un tempo limitado (fixación por inmersión) ou aprovéitase o sistema circulatorio do animal para facer pasar o fixador (fixación por perfusión). Na fixación por inmersión hai que ter en conta o tempo de fixación, xa que unha fixación excesiva pode provocar, ademais dun excesivo endurecemento, a aparición de aspectos citolóxicos que non existían in vivo observándose imaxes artificiais ou artefactos debidos a distorsións, alteracións morfolóxicas, cristalización de compostos amorfos, desprazamentos de substancias, etc O tempo de fixación dependerá do tamaño da peza de tecido e do fixador empregado. Hai moitos tipos de fixadores e a súa elección depende dunha serie de propiedades que posúen: velocidade de penetración, velocidade de fixación, grao de endurecemento e variacións de volume que producen, etc Tamén hai que ter en conta as características químicas do tecido que imos estudar, o método de seccionado que imos utilizar e a técnica que imos aplicar sobre as seccións obtidas. 49

54 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA Se a mostra se procesa para a súa observación ao ME, realízase unha dobre fixación, de forma que primeiro se fixa con paraformaldehido ou glutaraldehido (ou cunha mestura de ambos), e a continuación con tetróxido de osmio. 2.- Inclusión. Permite darlle consistencia aos tecidos e facilitar o seu seccionado cunha coitela. Consiste en rodear a peza dun material, chamado medio de inclusión, que sexa o suficientemente ríxido que permita o seu seccionado. Tras levar a cabo a inclusión, obteremos un bloque compacto da peza de tecido rodeada polo medio de inclusión. No procesado para a observación no MO utilízanse medios de inclusión hidrófobos (por exemplo, a parafina), que requiren a deshidratación previa do tecido, ou medios de inclusión hidrófilos (por exemplo, a xelatina), que son mesturables coa auga. O uso de medios de inclusión hidrófilos permite un procesado máis rápido e menos danoso para o tecido. En ocasións, a inclusión non é un paso imprescindible, xa que a consistencia se acada coa fixación ou coa conxelación do tecido, sen necesidade de utilizar un medio de inclusión. Na inclusión para a observación ao ME úsanse plásticos especiais (resinas) que proporcionan unha maior dureza que os medios de inclusión para microscopia óptica, o que permite a obtención de seccións moi finas. Neste caso a inclusión é imprescindible para lograr a consistencia da mostra. 3.- Seccionado. Para a maioría dos procedementos e estudos histolóxicos, requírense seccións de tecidos o suficientemente delgados para que pase a luz e poidan observarse ao MO, ou para que penetren os electróns e poidan observarse ao ME. Os micrótomos son instrumentos que coa axuda dunha navalla ou coitela permiten obter cortes finos dos materiais a estudar. Os micrótomos constan dun portabloques onde se coloca a mostra, unha coitela e un sistema de avance regulado do bloque (ou da coitela) que permite controlar o grosor dos cortes. En microscopia óptica as coitelas utilizadas son de aceiro e obtéñense seccións de varios micrómetros ( m) de grosor, mentres que en microscopia electrónica as coitelas son de vidro ou de diamante e obtéñense seccións de varios nanómetros (nm) de grosor, é dicir, mil veces máis finos que para o MO, debido a que o poder de penetración dos electróns é moi inferior ao dos fotóns. Hai moitos tipos de micrótomos e o uso dun ou doutro tipo depende de se o material se ten incluído ou non, e, no seu caso, do medio de inclusión que se utilizou. Os micrótomos máis utilizados hoxe en día son os seguintes: * Micrótomo de rotación ou de tipo Minot. Utilízase para seccionar pezas de tecido incluídas en parafina e obtéñense seccións de entre 5 e 30 m de grosor. Neste micrótomo a coitela permanece fixa e perpendicular ao portabloques, en posición vertical. O movemento rotatorio dunha manivela fai que o bloque coa mostra se desprace cara á coitela unha distancia fixa que determina o grosor do corte. * Crióstato ou criótomo. Require a conxelación previa da peza de tecido. Utilízase para seccionar material non incluído, ou incluído nun medio de inclusión especial para crióstato (medio de inclusión hidrófilo). Obtéñense seccións de entre 5 e 60 m de grosor. O funcionamento é semellante ao micrótomo de rotación pero neste caso o portabloques e a coitela atópanse nunha cámara na que podemos controlar a temperatura do bloque e da coitela (adoita estar entre -20 e -25ºC). 50

55 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA * Vibroslice ou Vibrátomo. Utilízase para seccionar pezas de tecido fresco, de tecido fixado sen incluír (a fixación xa proporciona a dureza necesaria para o seu seccionado), ou de tecido incluído nun medio brando como, por exemplo, a xelatina. Iso comporta a vantaxe de que o procesado é máis curto e evítase o proceso de inclusión en parafina (longo e danoso para o tecido) ou a conxelación (implica que a peza de tecido sofra cambios de temperatura), polo que se conservan mellor as características estruturais e funcionais do tecido. A desvantaxe é que non permite obter seccións finas, xa que o grosor mínimo obtido é de 25 m. O funcionamento baséase en que a coitela vibra mentres avanza sobre a peza de tecido e iso facilita o seccionado do material. * Ultramicrótomo. É o micrótomo que se utiliza en microscopia electrónica. Pódense realizar cortes semifinos (1 m) que se usan para microscopia óptica ou para seleccionar a zona da que queremos obter cortes ultrafinos ( nm) para o seu estudo ao ME. O funcionamento é semellante ao micrótomo de rotación pero neste caso as coitelas son de vidro ou de diamante para poder obter seccións moi finas de material incluído en medios de inclusión moi duros (resinas). 4.- Procesado das seccións. Sobre as seccións obtidas podemos aplicar moitas técnicas dependendo do que se queira estudar (tinguidura, técnica histoquímica, técnica inmunohistoquímica, hibridación in situ, ). Previamente a calquera técnica que vaiamos realizar sobre as seccións dun tecido que temos incluído e seccionado debemos extraer o medio de inclusión, coa fin de que devandito medio non interfira cos reactivos utilizados en cada caso. Como exemplo de procesado das seccións veremos como se leva a cabo unha tinguidura para a observación das seccións nun MO. Normalmente os tecidos son incoloros e, debido a que o índice de refracción da luz dos distintos compoñentes celulares é similar, é necesario colorealos para aumentar o contraste entre as distintas estruturas e poder así diferencialos ao observalos no MO. Os métodos de tinguidura son moi numerosos e reciben o nome do ou dos colorantes que se utilizan. Utilízase un ou outro método dependendo do tecido ou orgánulo que se queira tinguir, xa que, cada colorante ten a capacidade de unirse de forma selectiva a unhas estruturas do tecido e non a outras. Os colorantes clasifícanse en colorantes básicos que teñen afinidade polos compoñentes ácidos da célula (núcleos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos), colorantes ácidos que teñen afinidade por compoñentes básicos da célula (citoplasma, coláxeno); e colorantes neutros, que adoitan ser mesturas de varios colorantes. No caso do procesado do material para a súa observación no ME non se realizan tinguiduras con colorantes, senón que se levan a cabo técnicas de contraste que agregan átomos de metais pesados (osmio, uranilo, chumbo) que farán as estruturas celulares máis ou menos densas aos electróns permitindo así a obtención dunha imaxe. No ME obtéñense imaxes en branco e negro. 5.- Montaxe. Consiste en colocar un cubreobxectos sobre as seccións para protexelas durante a observación no MO. Cando non queremos conservar a preparación podemos engadir, entre o cubreobxectos e as seccións, unha pinga de auga, de tampón (auga cunha mestura de sales) ou de glicerina. Neste caso, trala observación desbótase a preparación. Cando nos interesa conservar a preparación, é necesario utilizar un medio entre as seccións e o cubreobxectos, chamado medio de 51

56 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA montaxe, que debe ser transparente, asegurar o máximo posible a conservación das preparacións e asegurar a adherencia entre o portaobxectos e o cubreobxectos. Hai medios de montaxe hidrófilos e medios de montaxe hidrófobos. A montaxe só se leva a cabo no procesado para o MO, xa que, no caso do procesado para o ME as seccións sitúanse sobre pequenas reixas metálicas especiais e non necesitan esa protección. 6.- Observación ao microscopio óptico ou electrónico. As mostras biolóxicas ou as células, en xeral, son difíciles de observar a primeira ollada debido ao seu reducido tamaño e a súa transparencia á luz visible, polo que para a súa observación, necesitamos os microscopios, que son instrumentos de óptica que nos permiten ver obxectos moi pequenos ou detalles estruturais imposibles de distinguir a simple vista. A) O microscopio óptico utiliza a luz común (luz branca, emitida por unha fonte de luz situada na base do microscopio) que atravesa a mostra biolóxica e ilumina o campo de observación. Conta con tres sistemas de lentes: a) o condensador, que concentra a luz emitida sobre a mostra; b) os obxectivos que aumentan a imaxe X veces, normalmente nos microscopios utilizados en prácticas hai catro obxectivos de 4, 10, 40 e 100 aumentos; e c) os oculares que aumentan a imaxe 10 veces (hainos de maior aumento) e permiten a visualización directa da mostra. Os aumentos finais obtéñense multiplicando os aumentos do obxectivo polos do ocular (por exemplo, nun microscopio de prácticas o maior aumento que obteriamos sería: [obxectivo 100X] x [ocular de 10X] = 1000 aumentos). Con todo, nun microscopio óptico o importante non son os aumentos senón o seu poder de resolución (PR), é dicir, a capacidade de distinguir como separados dous puntos que se atopan moi próximos. E o PR depende do límite de resolución (LR, distancia mínima á que dous obxectos poden ser diferenciados ) e, de feito, o PR é inversamente proporcional ao límite de resolución (PR =1/LR). O límite de resolución dun microscopio calcúlase mediante a fórmula de Abbe: Limite de resolución (LR) = 0 61 x / n x sen Nesta fórmula: 0 61 é unha constante, é a lonxitude de onda da luz utilizada (luz branca, 550 nm), e n x sen é a apertura numérica (AN) da lente obxectivo. A AN depende do índice de refracción do medio situado entre a mostra e o obxectivo (n) e do ángulo de apertura do obxectivo utilizado ( ). Normalmente o medio situado entre a mostra e o obxectivo é aire (n=1), aceite de inmersión (n=1,5) ou auga (n=1,3). O uso do aceite de inmersión (impide a desviación dos raios máis oblicuos) aumenta o PR porque aumenta a AN. O ángulo é a metade do ángulo formado polo cono de raios recolleitos pola lente obxectivo sobre un punto da mostra. Como a máxima anchura é de 180º, o valor de sen (90º) é como máximo 1 (0,93 nos microscopios actuais). Polo tanto, o PR do microscopio depende da da luz utilizada e da AN, de forma que, canto menor sexa e maior sexa a AN, máis pequeno é o LR e maior o PR. Os obxectivos de maior aumento teñen maior AN debido a que o ángulo aumenta ao diminuír a distancia da mostra á lente, polo tanto, ao subir o aumento aumentamos o PR. 52

57 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA O límite de resolución dun MO, nas condicións máis óptimas, é dicir, utilizando o obxectivo de 100 aumentos con aceite de inmersión é LR = 0,61 x 550 nm/1,5 x 0,93= 240 nm = 0,24 m. É dicir, que nun MO podemos observar como separadas estruturas que teñen como mínimo ese diámetro, ou que están separadas como mínimo por esa distancia (bacterias, mitocondrias, núcleo, plastos,...). Co MO distinguiriamos a forma destas estruturas pero non os seus detalles internos. Estruturas celulares de menor tamaño (ácidos nucleicos, ribosomas, ) teriamos que observalas ao ME, cuxo LR é mil veces menor que o do MO (LR=2-5A=0,2 nm=0,0002 m) debido a que a dos electróns é moi pequena ( = 0,004 nm). Polo tanto, o PR dun ME mil veces maior que o do MO e permítenos observar a ultraestrutura celular. Tendo en conta que o LR do ollo humano é de m (0,1-0,2 mm), o MO aumentou unhas mil veces o LR do noso ollo e o ME aumentouno un millón de veces. O diafragma do condensador (ou de apertura) é outro dispositivo importante que se atopa situado debaixo do condensador e con el podemos graduar a cantidade de luz que chega á mostra. Cando pechamos o diafragma a mostra recibe menos luz, de forma que aumentamos o contraste e a profundidade de campo pero diminuímos a resolución. O MO que se usa habitualmente é o MO de campo claro ou fotónico, utilizado para a observación de preparacións tinguidas de células ou de seccións de órganos ou tecidos. Existen outros tipos de MO, como o MO de campo escuro, o MO de contraste de fases e o MO de contraste diferencial de interferencia (DIC) ou de Nomarski, que presentan dispositivos especiais (condensadores, obxectivos, prismas) que permiten a observación de seccións de tecidos sen tinguir e de células vivas e móbiles (bacterias, espermatozoides, protozoos, cultivos celulares, células en mitose ou en migración, ). O MO de fluorescencia e o MO de varrido confocal presentan dispositivos especiais que permiten a observación de mostras fluorescentes. O MO invertido utilízase para a observación de mostras que se atopan en frascos ou placas de fondo plano, por exemplo, os cultivos celulares, ou na manipulación de gametos e embrións vivos in vitro en técnicas de fecundación asistida. O seu nome débese a que a fonte de luz está na parte superior do microscopio e os obxectivos na parte inferior, baixo a platina. O feito de que estea invertido permite achegar os obxectivos ás células, xa que nun MO convencional a distancia entre os obxectivos e o fondo da placa sería moi grande. Independentemente de que o microscopio sexa convencional ou invertido pode presentar os distintos dispositivos das distintas ópticas. B) O microscopio electrónico non utiliza a luz visible (fotóns), senón electróns acelerados. Hai dous tipos de ME: B1.- O microscopio electrónico de transmisión (MET) consta dunha columna oca onde se fai o baleiro para que os electróns, emitidos por un canón de electróns situado no alto da columna, non se dispersen. Consta, ademais, de distintas lentes electromagnéticas (condensadora, obxectivo e proxectora) e distintos diafragmas. A mostra sitúase entre a lente condensadora e a lente obxectivo. É importante destacar que no MET as seccións ultrafinas non se colocan sobre portaobxectos, xa que os 53

58 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA electróns non son capaces de atravesar o vidro, senón sobre pequenas reixas de cobre ou níquel que non impiden o paso dos electróns. Os electróns pasan pola lente condensadora, que concentra o feixe de electróns procedente do canón sobre a mostra, chegan á lente obxectivo que orixina e enfoca a imaxe, e para rematar a lente proxectora magnifica a imaxe obtida. A imaxe obsérvase directamente nunha pantalla fluorescente, ou indirectamente mediante a obtención dunha imaxe fotográfica ou dixitalizada. Para visualizar a imaxe debe ter lugar a dispersión dos electróns ao atravesar a mostra e deben producirse interaccións deses electróns cos átomos desa mostra. Na imaxe final veremos zonas claras (estruturas claras ou transparentes aos electróns), polas que os electróns atravesaron a mostra, e zonas escuras (estruturas densas aos electróns ou electrondensas) que corresponden ás rexións onde os electróns foron desviados. B2.- O microscopio electrónico de varrido (MEB) utilízase para observar a superficie dunha mostra que non foi seccionada (órganos ou partes de órganos, pequenos organismos, grans de polen, células enteiras, orgánulos, ). Neste caso o feixe de electróns non está fixo, senón que se move e vai rastrexando a superficie da mostra, que está recuberta dunha capa dun material metálico con gran capacidade de transmisión de enerxía eléctrica (xeralmente utilízase ouro). A presenza dese material fai que a superficie da mostra, ao ser varrida polo feixe de electróns, emita á súa vez outros electróns que son recolleitos por un detector e orixinan unha imaxe en relevo da superficie da mostra que se observa nun monitor de televisión. Do mesmo xeito que no MET, neste microscopio as imaxes obtéñense en branco e negro. OBXECTIVO Que o alumno se familiarice coa metodoloxía que se leva a cabo no procesado de tecidos para a súa observación no microscopio óptico. Para iso, nestas prácticas faremos seccións de tecidos animais, previamente fixados, utilizando dous tipos de micrótomos: un vibroslice (ou vibrátomo) para seccionar pezas de tecido sen incluír; e un micrótomo de rotación para seccionar pezas de tecido incluído en parafina. A continuación, tinguiremos as seccións obtidas, montarémolas, e observarémolas ao microscopio óptico de campo claro. Ademais, observaremos preparacións sen tinguir noutros tipos de microscopios ópticos (campo escuro e contraste diferencial de interferencia (DIC) ou de Nomarski). MATERIAL Micrótomo de rotación, bloques de tecidos incluídos en parafina, vibroslice, placas Petri, pinceis, placas con pocillos, cristalizadores con ponte, cubetas de vidro verticais, portaobxectos e cubreobxectos, colorantes, auga destilada, etanol (70º, 96º, 100º), líquido intermediario ( histo-clear ), medio de montaxe (Eukitt), microscopio óptico. 54

59 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA MÉTODOS: Práctica 1: Seccionado, tinguidura e montaxe. A.- Seccionado (microtomia). Manexo dun vibroslice e obtención de cortes de tecido animal previamente fixado e sen incluír. Manexo dun micrótomo de rotación e obtención de cortes de tecido animal previamente fixado e incluído en parafina. B.- Tinguidura. B1.- Trala obtención de seccións dun tecido animal no vibroslice procédese a realizar a tinguidura. Estas seccións flotantes (chamadas así porque debido ao seu grosor (50-80 m) non se colocan nun portaobxectos para o seu procesado) tínguense en placas con pocillos. Cada pocillo énchese cun reactivo e as seccións flotantes vanse cambiando coidadosamente de pocillo en pocillo coa axuda dun pincel. Con estas seccións levaremos a cabo a tinguidura con Tionina de Laskey, que é un colorante que tingue de azul os compoñentes celulares que conteñen ácido ribonucleico (ARN). O protocolo desta tinguidura é o seguinte: 1.- Lavar en auga destilada, 2 minutos. 2.- Etanol de 70º, 5 minutos. 3.- Lavar en auga destilada, 2 minutos. 4.- Tinguir con tionina de Laskey durante 10 segundos. COIDADO!! hai que manter co pincel as seccións para non perdelas de vista, xa que o colorante é moi escuro e tingue moi rápido. 5.- Paso rápido por auga destilada para eliminar o exceso de colorante. 6.- Lavar en auga destilada, 2 minutos. 7.- Etanol de 96º, tres baños de 1 minuto ata que deixe de eliminar colorante. 8.- Etanol 100º, 2 minutos. 9.- Histo-clear, 2 minutos Montaxe. Colócanse as seccións nun portaobxectos, estíranse ben co pincel, cóbrense cunha pinga de medio de montaxe (Eukitt) e ponse o cubreobxectos enriba evitando que se formen burbullas de aire. Práctica 2: Tinguidura, montaxe e observación. B.- Tinguidura. B.2.- Trala obtención de seccións dun tecido animal no micrótomo de rotación procédese a realizar a tinguidura. Previamente debemos proceder á eliminación da parafina que impregna o tecido (desparafinado) e hidratar de novo o tecido (hidratación) que se tiña deshidratado no proceso de inclusión. Para desparafinar e hidratar as seccións temos que pasalas polos seguintes líquidos: histo-clear (10 min); etanol 100º (5 min); etanol 96º (5 min); etanol 70º (5 min) e auga destilada (5 min). 55

60 TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA Unha vez rehidratado o tecido procedemos a realizar a tinguidura, neste caso sobre o cristalizador. Para iso, colócanse os portaobxectos sobre a ponte e vanse botando os diferentes líquidos cunha pipeta Pasteur de plástico (cada reactivo coa súa pipeta correspondente) ata cubrir as seccións. Unha vez transcorrido o tempo de tinguidura baléirase cada líquido no cristalizador e escórrese cada porta sobre un papel de filtro antes de engadir o seguinte reactivo. Con estas seccións levaremos a cabo a tinguidura con hematoxilina-eosina que é unha tinguidura clásica e xeral moi utilizada en estudos de morfoloxía tisular e en anatomía patolóxica. Utilízanse dous colorantes: a hematoxilina de Mayer, que é un colorante básico e tinguirá de azul os compoñentes ácidos das células (ácidos nucleicos: núcleo), e a eosina é un colorante ácido e tinguirá de vermello ou de rosa os compoñentes básicos (proteínas: citoplasma, matriz extracelular). O protocolo desta tinguidura é o seguinte: 1.- Tinguir con hematoxilina de Mayer, 10 minutos. 2.- Lavar con auga corrente (cubeta debaixo da billa), 4 minutos. 3.- Tinguir con eosina, 35 segundos. 4.- Lavar con etanol de 96º ata eliminar o exceso de colorante. Para iso, botaremos o etanol sobre os cortes cunha pipeta inclinando un pouco o portaobxectos para que o etanol caia ao cristalizador. A continuación, pasamos o portaobxectos coas seccións tinguidas á batería de deshidratación. 5.- Cubeta de etanol 100º, 5 minutos. 6.- Cubeta de histo-clear, 3 minutos. 7.- Montaxe. Engádense unhas pingas de medio de montaxe (Eukitt) sobre as seccións e ponse o cubreobxectos enriba evitando que se formen burbullas de aire. C.- Observación. Observación das preparacións obtidas no microscopio óptico de campo claro. Observación de preparacións sen tinguir no microscopio óptico de campo escuro e no microscopio óptico de contraste diferencial de interferencia (DIC) ou de Nomarski. CUESTIÓNS 1.- No noso laboratorio de técnicas histolóxicas pretendemos estudar a estrutura do músculo esquelético de rato mediante a realización dunha tinguidura hematoxilina-eosina sobre seccións de 10 micrómetros de grosor. a.- Describe con detalle os diferentes pasos do proceso que vai dende que extraemos o tecido do animal ata que o observamos ao microscopio óptico. b.- Tras realizar a tinguidura sobre as seccións de músculo esquelético, que compoñentes celulares se tinguirán e por que? c.- En que tipo de microscopio poderiamos observar as preparacións obtidas? 56

61 5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE (código calendario de prácticas: BQ)

62

63 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Introdución Centrifugación e fraccionamento subcelular A maioría dos laboratorios de Bioloxía dispoñen de centrífugas, das cales existen varios tipos. Así, en función do rotor temos centrífugas con rotores basculantes ou con rotores de ángulo fixo, e en base a velocidade que alcanzan teremos centrífugas (hasta ~3,000 xg), centrífugas de alta velocidade (2,000-20,000 xg) e ultracentrífugas (15, ,000xg). Todas elas se empregan para separar sustancias de masas ou densidades distintas, como por exemplo partículas sólidas (células, orgánulos, etc) dun líquido ou ben líquidos con diferentes densidades. Os rotores basculantes manteñen os tubos en posición vertical cando o rotor está en repouso, pero dita posición vólvese horizontal durante a centrifugación, de xeito cas partículas sedimentan uniformemente no fondo do tubo. Nos rotores de ángulo fixo, en cambio, os tubos están situados en ángulo (25º-52º), e as partículas van sedimentando tanto no fondo como nos laterais dos tubos. Debido o seu deseño máis aerodinámico, este último tipo de rotores alcanzan maiores velocidades. As microcentrífugas que imos empregar nesta práctica terán rotores en ángulo fixo, e nos permitirán operar a 11,000-15,000 revolucións por minuto (rpm). Finalmente, as ultracentrífugas caracterízanse por ser capaces de acadar altas velocidades (por exemplo, 100,000 rpm), tanto con rotores de ángulo fixo como basculantes. Todas as centrífugas dispoñen dun motor eléctrico e dun rotor conectado a este a través dun eixo. Tanto o eixo como o rotor están colocados dentro dunha cámara de seguridade; dita cámara está pechada mediante unha tapa. No panel de control aparecen botóns de prendido/apagado, de selección de velocidade, de nivel de freado, e nalgunhas de temperatura de traballo (entre -15ºC e 25ºC). O control da temperatura evita incrementos debido á fricción que podería desnaturalizar as proteínas ou lisar as células. As centrífugas dispoñen de tacómetros para coñecer a velocidade (rpm) de funcionamento, e no caso das de alta capacidade e ultracentrífugas, de alarmas de aviso de posibles desequilibrios. Nas ultracentrífugas, a velocidade extrema (máis de rpm) fai necesaria a existencia de sistemas de baleiro na cámara para evitar o quecemento do rotor e mostras. Os tubos empregados en centrifugación poden ser de vidro ou de plástico (poliestireno, polipropileno), sendo máis resistentes os últimos. Os tubos poden ter formas (fondo cónico, fondo redondo; sen tapa ou con tapa, etc) e capacidades diversas. O equilibrado e colocación dos tubos no rotor é crucial, xa que se este proceso se realiza incorrectamente o proceso de centrifugación pode pararse ou xerar sedimentos pouco compactados. Aparte da velocidade de xiro, expresada en rpm, tamén emprégase como unidade de medida a forza de aceleración, forza centrífuga relativa (RCF) ou número de veces que a forza de gravidade, expresada en x g, estase a aplicar a mostra. Existe unha relación directa entre RPM e RCF: RCF= 1.12 x10-5 x r x (rpm) 2, onde r é o radio do rotor (cm). Os valores en velocidade expresados en x g son constantes entre as distintas centrífugas, pero non así os valores de rpm para un valor fixado de RCF, pois é dependente do radio do rotor. No obstante, a maioría das centrífugas actuais permiten especificar 59

64 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE tanto RPM como RCF. Ademais, nos libros de instruccións das centrífugas aparecen táboas ou nomogramas para determinar as rpm que debemos seleccionar para un valor fixo de RCF cando rotor e radio son coñecidos. O fraccionamento subcelular é un conxunto de métodos que permiten obter fraccións enriquecidas en orgánulos (ex., mitocondrias, núcleos), fraccións de membrana (ex., membrana total, membrana plasmática) ou complexos multiproteicos (ex., citoesqueleto) mediante dous etapas. Na primeira ten lugar a rotura celular (lisado) mediante procedementos mecánicos suaves que poden empregar ou non deterxentes (sonicación, homoxenizadores, etc). Nesta práctica realizaremos unha lise hipotónica sen deterxentes, ao empregar unha solución cunha osmolalidade moi inferior o citoplasma das células; isto xera a entrada de auga e a lise celular. Na segunda etapa sepárase a fracción desexada mediante diversos criterios, como por exemplo diferencias en densidade (ex., centrifugación diferencial). A centrifugación diferencial baséase na existencia de diferentes partículas na suspensión que difiren, entre si e co medio, en canto a súa densidade. Se centrifúgase en condicións suaves (pouco tempo, baixa velocidade) sedimentarán as partículas maiores e/ou máis densas. Cando o sobrenadante da primeira centrifugación é centrifugado de novo en condicións máis intensas sedimentarán as partículas máis densas; o proceso pódese continuar indefinidamente. Na práctica de hoxe imos empregar un protocolo de centrifugación diferencial cun modelo celular moi sinxelo: o eritrocito humano. Os eritrocitos perderon o seu núcleo, membranas internas e mitocondrias no proceso de maduración, de xeito que poden ser empregados para a producción de pantasmas, vesículas obtidas despois de liberar o contido citoplasmático mediante hemolise e que constitúen un preparado case puro de membrana plasmática. Dentro desta membrana plasmática existen tanto proteínas integrais como periféricas; as primeiras, embebidas na membrana plasmática, e as segundas, unidas a súa cara interna formando un entramado de proteínas periféricas denominado citoesqueleto. Dentro das integrais temos a proteína transportadora de anións, o transportador de glucosa e as glicoforinas, e dentro das citoesqueléticas a espectrina, a actina e a proteína da banda 4.1 (Figura 1). FIGURA 1: Patrón electroforético das proteínas presentes nos pantasmas de membrana de eritrocitos (Tomado de B.W. Shen e cols, 1986): Bandas 1 e 2: Cadeas e da Espectrina. Bandas 2.1, 2.2 e 2.3: Ankirina. Banda 3: proteína transportadora de anións. Banda 4.1: Proteína do citoesqueleto. Banda 4.2: Paladina. Banda 4.9: Demantina. Banda 5: Actina. Banda 6: Gliceraldehido-3-fosfato deshidroxenasa. 60

65 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Electroforese A electroforese baséase no movemento que provoca o establecemento dun campo eléctrico sobre unha molécula con carga e que permite a separación, por exemplo, de proteínas, ADN ou ARN. Según a expresión v= Ez/f, a velocidade de migración (V) destas moléculas dentro dun campo eléctrico depende da forza do campo (E), da carga da proteína (z) e do coeficiente de fricción (f). Este último, á súa vez, varía ca forma da molécula, o seu tamaño e a viscosidade do medio. Esto fai cunha sustancia anfotérica como as proteínas, nun tampón de ph determinado (que non se corresponda co punto isoeléctrico desta), presente unha carga eléctrica neta. Deste xeito, diferentes proteínas cunha relación carga/masa distinta e en estado nativo (non desnaturalizado) poidan ser separadas o establecerse un campo eléctrico mediante a electroforese nativa. Sen embargo, nas electroforeses desnaturalizantes como a da práctica, a carga da proteína non vai ser a endóxena, senón que ven dada polo dodecil sulfato sódico (SDS) do tampón de mostra. O SDS é un deterxente aniónico que únese cunha estequiometría de aproximadamente unha molécula de SDS por cada dous aminoácidos. Isto lle confire á proteína unha carga negativa proporcional a súa masa; é dicir, iguala a relación carga/masa das proteínas a separar na electroforese. Ademáis, a repulsión das cargas do SDS destrúe as interaccións non covalentes o que, xunto co calor, produce o despregamento proteico. Deste xeito, o aplicar un campo eléctrico a mostra, os complexos proteína:sds migrarán cara ó polo positivo e separaranse dacordo co peso molecular (as proteínas máis pequenas migrarán máis rápidamente cas grandes). Aparte do SDS, o tampón de mostra tamén contén -ME ou DTT, moléculas que rompen os pontes disulfuro das proteínas, glicerol ou sacarosa, para que a mostra teña unha maior densidade co tampón de electroforese e caia dentro dos pocillos do xel, e azul de bromofenol, un colorante con carga negativa ca movilidade electroforética dun pequeno polipéptido e cuxa función é a de ir por diante das proteínas (fronte da electroforese). As separacións electroforéticas realízanse habitualmente sobre distintos medios de soporte, que evitan as correntes de convección e serven como tamices moleculares. Estos son habitualmente de tipo continuo, como os xeles de almidón, agarosa ou os polímeros químicos (poliacrilamida). Os xeles de poliacrilamida son producidos mediante a polimerización de acrilamida e o seu derivado bifuncional, a bisacrilamida. Esta última molécula establece os enlaces cruzados que permiten xerar poros cun tamaño controlado. Empréganse como catalizadores da reacción persulfato de amonio e TEMED. Os geles de poliacrilamida son descritos en función de dous parámetros, que son a concentración total de monómero ou %T [(gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida/volume total en ml) x 100], e a porcentaxe en peso de crosslinker ou %C [(gramos de bisacrilamida/gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida) x 100]. Valores de %C do 2.6% (proporción 37.5:1), como nesta práctica, ou 3.3% (proporción 29:1) son axeitados para separacións de proteínas, namentres que %C do 5% (proporción 19:1) o son para a secuenciación do DNA. 61

66 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE A SDS-PAGE pode realizarse horizontalmente ou verticalmente, e pode ser continua ou discontinua; a máis empregada, e usada na práctica, é a discontinua. Nesta modalidade prepáranse 2 xeles: o xel separador (ph 8,8), onde se resolven as proteínas e que ten un %T elexido en función do peso molecular das proteínas a separar (menor canto maior sexa o peso da proteína), e o xel concentrador (%T = 4%, ph 6,8), situado sobre o primeiro. Baixo a acción do campo eléctrico aplicado á solución a través dos electrodos con distinta carga (positiva/ánodo & negativa/cátodo), os ións (neste caso, a mistura proteica con carga negativa -e polo tanto anións- colocada sobre o xel concentrador) migran cara o electrodo de carga oposta (o ánodo). Cando as proteínas chegan o xel separador concéntranse, de xeito que todas inician a separación no mesmo intre; isto mellora sensiblemente a resolución da electroforese. En calquera sistema eléctrico, a intensidade da corrente producida é directamente proporcional a voltaxe aplicada e inversamente proporcional a resistencia (Lei de Ohm, V=IR). A electroforese pode ser levada a cabo fixando un valor de voltaxe (por exemplo, V, como nesta práctica) ou de intensidade, pero en calquera caso débese de levar a cabo o máis rapidamente posible para evitar a difusión e maximizar a resolución. Se ben moitas electroforeses realízanse a temperatura ambiente (RT), como a da práctica, de cando en vez as elevadas voltaxes implican moita xeración de calor, o que fai necesario o uso de xeles moi delgados e sistemas de enfriamento. Unha vez a electroforese remata e as bandas de proteínas foron resoltas no xel separador estas deben de ser visualizadas. Para elo empréganse diversos métodos de tinguido con moléculas afíns as proteínas, tales como o azul de Coomassie (como o R-250, ou o G-250 da práctica), co que se poden visualizar μg de proteína/banda. Outro método de tinguido son as sales de prata, con elevada sensibilidade (hasta 0.1 ng proteína/banda) pero baixa reproducibilidade. Métodos de tinguido con sensibilidades comparables a da prata, pero máis reproducibles, son os compostos fluorescentes, como o SYPRO Ruby, Flamingo Ruby, Deep Purple, Pro-Q Emerald. Finalmente, varias son as aplicaciones da SDS-PAGE, como por exemplo analizar o grao de pureza dunha proteína, determinar o seu peso molecular (ou cambios neste por proteolise), ou coñecer a concentración dunha proteína na mostra. Obxectivos: Empregar un protocolo sinxelo de fraccionamento diferencial para purificar membranas plasmáticas de eritrocitos humanos para que os/as alumnos/as se familiaricen cas técnicas de centrifugación. Que o/a alumno/a poña en práctica os fundamentos teóricos adquiridos no seminario sobre electroforese e que coñeza unha das suas posibles aplicacións: a análise de misturas complexas de proteínas e os datos que se poden extraer de dita análise. 62

67 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Instrumental: Equipo de electroforese MiniProtean da casa comercial BioRad (ver foto superior), que traballa cun sistema de mini xeles que require pouca mostra, é máis rápido e mantén unha alta resolución na separación das proteínas. Inclúe un xogo de vidros (pequenos e grandes), separadores, peites de 10 pocillos, marcos para suxeitar os vidros e casting stands para xerar 8 xeles de SDS-PAGE. Tanque e tapa. Microfuga Bata e guantes (medianos e Fonte de alimentación (capacidade pequenos) 200V, 500 ma) Contedor de residuos biolóxicos e Axitador magnético con capacidade químicos para ferver mostras. Bandexa de vidro para o tinguido Microondas dos xeles Micropipetas: p1000, p200 e p20 8 kitasatos Puntas azuis e amarelas + caixas 8 pipetas vidro 10 ml +chupóns 10 Tubos eppendorf de 1.5 ml, ml brancos Reactivos Cloruro sódico Solución de tinguido baseada en Cloruro potásico azul de coomassie G-250 Biosafe Fosfato de sodio monobásico Marcadores de peso molecular Fosfato de sodio dibásico Acrilamida Bisacrilamida 63

68 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Tris Glicerol SDS (sodio dodecil sulfato) Azul de bromofenol TEMED Glicina Persulfato de amonio EDTA 2-mercaptoetanol ( -ME) Ácido clorhídrico (HCl) Solucións Solución 1: Tris/HCl 1,5 M ph 8,8, 100 ml. Pesar 18,15 g de Tris. Disolver o Tris en 50 ml de auga destilada. Engadir gota a gota HCl concentrado ata que o ph baixe a 8,8. Compretar con auga destilada ata o volume final (100 ml). Estable por meses a 4ºC. Solución 2: Tris/HCl 1 M ph 6,8, 100 ml. Pesar 12,1 g de Tris. Disolver o Tris en 50 ml de auga destilada. Engadir gota a gota HCl concentrado ata que o ph baixe a 6,8. Compretar con auga destilada ata o volume final (100 ml). Estable por meses a 4ºC. Solución 3: SDS 10% (w/v), 100 ml. Pesar 10 g de SDS. Engadir auga destilada ata compretar o volumen de 100 ml. O SDS é un po fino neurotóxico, polo tanto débese usar máscara, luvas e lentes de protección. Almacenar a RT. Solución 4: Glicerol 50% (v/v), 100 ml. Misturar un volume de 50 ml de glicerol o 100% con 50 ml de auga destilada. Almacenar a RT. Solución 5: Azul de Bromofenol 1% (w/v), 10 ml. Pesar 100 mg de azul de bromofenol. Compretar con auga destilada ata 10 ml e misturar ata disolver. Filtrar a solución en papel Whatman No 1 para eliminar o colorante non disolto. Almacenar a RT. Solución 6: Acrilamida 30% (100 ml). A solución de acrilamida o 30% (w/v) é unha mistura de acrilamida (29,2 g) e bisacrilamida (0,8 g). Pesar ámbolos dous reactivos e engadir auga destilada ata 100 ml. Filtrar en papel de filtro Whatman Nº1 A acrilamida en po e en solución é neurotóxica, polo tanto débese usar máscara, luvas e lentes de protección para a súa manipulación, ou mellor mercala xa feita. Estable por meses a 4ºC. Solución 7: Persulfato de amonio o 10% (w/v), 5 ml. Pesar 0,5 g de persulfato de amonio. Disolver en 5 ml de auga destilada. Almacenar a -20ºC. Solución 8: Tampón de electroforese 1X, 1 L. Pesar 3 g de Tris (25 mm), 14,4 g de glicina (192 mm) e 1 g de SDS (0,1%). Engadir auga destilada ata completar 1 L. O ph debería de ser aproximadamente 8,3. Pódese preparar unha solución 10 veces concentrada e diluir o volumen necesario no momento da electroforese. Esta solución pode almacenarse indefinidamente a RT. 64

69 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Solución 9: Tampón de mostra 5X, 10 ml. Misturar 0,6 ml de Tris/HCl 1M ph 6,8 (solución 2; 60 mm), 5 ml de Glicerol 50% (solución 4; 25%), 2 ml de SDS 10% (solución 3; 2%), 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (14,4 mm), 1 ml de azul de bromofenol (solución 5; 0,1%) e 0,9 ml de agua destilada. Almacenar a -20 ºC. Solución 10: Tampón fosfato salino ou PBS, 1L. Pesar 8 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,24 g de fosfato de potasio monobásico (KH 2 PO 4 ) e 1,44 g de fosfato de sodio dibásico (Na 2 HPO 4 ). Levar ata 1L con auga destilada. Non axustar o ph. Almacenar a 4ºC. Solución 11: 1 M tampón fosfato ph 7.0, 200 ml. Preparamos primeiro as soluciones nai: solución A: 2 M fosfato de sodio monobásico (2,76 g NaH 2 PO 4 H 2 O en 10 ml de auga destilada); solución B: 2 M fosfato sodico dibásico (2,84 g de Na 2 HPO 4 en 10 ml de auga destilada). Misturar 3,9 ml de solución A e 6,1 ml de solución B. Diluir ata 20 ml con auga destilada para xerar unha solución 1M. Solución 12: 0.5M EDTA ph 8.0. Pesar 18,612 g de EDTA disódico 2 H 2 O e disolver en 70 ml de auga destilada. Axustar a ph 8.0 con 10 N NaOH (o EDTA non se disolverá a menos que teñamos un ph 8.0) e completar ata 100 ml con auga destilada. Gardar a 4ºC. Solución 13: Tampón de lise hipotónico, 100 ml. 5 mm fosfato sódico ph 7.0, 0.5 mm EDTA. Misturar 0,5 ml de 1M tampón fosfato ph 7.0 (solución 11) con 0,1 ml de 0.5M EDTA ph 8.0 (solución 12). Compretar con auga destilada ata 100 ml. Gardar a 4ºC. Protocolo: 1 er día, 2h 30 min Obtención dos eritrocitos: 1. Coller 500 l sangue humana tratada con EDTA e a depositamos nun tubo eppendorf de 1.5 ml. Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). 2. Eliminar o plasma sanguíneo e a primeira capa de leucocitos (que está sobre os eritrocitos empaquetados). Lavar con 500 l de PBS ph 7.4, que é isotónico co citoplasma das células vermellas. 3. A suspensión centrifúgase a 1,000 xg durante 10 min a RT. 4. Descartar o sobrenadante e repetir o lavado con 500 l de PBS ph 7.4 dous veces máis para eliminar todas as proteínas do soro. 65

70 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Lise hipotónica dos eritrocitos: 5. Empregamos un protocolo de lise hipotónica descrito por G. Fairbanks e colaboradores en As células rómpense tomando unha fracción do volumen empaquetado (por exemplo, 150 l) e engadindo aproximadamente 10 volúmenes (1,35 ml) de tampón hipotónico frío (5 mm fosfato sódico ph 7.0, 0.5 mm EDTA). 6. Deixar lisar durante 15 minutos en xeo. Fraccionamiento del lisado mediante centrifugación: 7. A suspensión centrifúgase a 12,000 xg durante 10 minutos. Tede coidado ca colocación dos tubos!!!!! 8. O sobrenadante retírase por aspiración e gárdase etiquetado como citosol. 9. O precipitado, que contén as pantasmas de membrana, resuspéndese en 5 mm fosfato sódico ph 7.0 frío para a realización de varios lavados máis (~3), ata que as pantasmas de membrana sexan brancos (é dicir, ata que non conteñan hemoglobina). 10. As proteínas de membrana disólvense incubando as pantasmas con 25 l de tampón de mostra de electroforese 1X. 11. Do sobrenadante citosólico (paso 8) tómanse 20 l, os que se lle engaden 5 l de tampón de mostra de electroforese 5X. 12. As tapas dos eppendorf que conteñen os dous tipos de mostras son perforadas cunha agulla. As mostras férvense durante 15 minutos, centrifúganse a 12,000 xg durante 5 minutos a RT para eliminar as proteínas precipitadas e os sobrenadantes gárdanse en tubos eppendorf novos etiquetados (tubo 1: citosol; tubo 2: proteína de membrana) a - 20 ºC ata o día seguinte. 2º día. 2h 30 min. SDS-PAGE y tinción. 1. Ensamblar o molde formado polos soportes, vidros e separadores. 2. Preparación dos xeles: Cada grupo vai preparar un minixel, aínda que o final sóamente dous deles serán empregados para cargar as mostras de tódolos grupos. 3. Prepárase o xel separador cunha porcentaxe de acrilamida do 12% misturando nun kitasato e na mesma orde 4 ml de auga, 2,5 ml de Tris HCL 1.5 M ph 8,8, 100 l de 10% SDS e 2.5 ml de 30% acrilamida/0.8 % bisacrilamida. Engádense 100 l de persulfato amónico o 10% e 4 l de TEMED. 4. Empregando unha micropipeta p1000 énchese o sandwich formado polos vidros e os separadores con dita solución; non se deben formar burbullas. Deixar 66

71 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE aproximadamente 1,5 cm entre a solución de acrilamida e o vidro pequeno. Se completa con auga con moito coidado para evitar que o borde do xel polimerice de xeito irregular, e se deixa polimerizar durante 30 minutos a RT. 5. Unha vez polimerizado o xel separador, descartar a auga da superficie do mesmo e preparar 4 ml de solución do xel concentrador (4%) misturando 2,7 ml de auga destilada, 0,67 ml de solución 30%Acrilamida/0.8%bisacrilamida, 0,5 ml de Tris/HCl 1 M ph 6,8, 40 μl de 10%SDS, 40 l de 10% persulfato amónico e 4 μl de TEMED. Empregando unha micropipeta p1000, depositade a solución sobre o xel separador xa polimerizado e insertar finalmente o peite con coidado de non formar burbullas. Deixar polimerizar durante 30 minutos a RT. 6. Durante o transcurso desta última polimerización se desconxelan as mostras de proteína tanto do tubo 1 (citosol) como do tubo 2 (proteína de membrana) para ser cargadas no xel (20 l de cada unha; 4 grupos por xel). Se preparan tamén os marcadores de peso molecular. 7. Electroforese: colocar dous dos xeles (os que quedaran mellor) no tanque de electroforese con aproximadamente 500 ml de tampón de electroforese 1X (solución 8). Quitar coidadosamente o peite para que queden preparados os pocillos do xel. Os pocillos deben de ser limpados con tampón de electroforese con micropipeta para eliminar o monómero de acrilamida non polimerizado. 8. As mostras de todos os grupos e os marcadores de peso molecular son cargados nos dous xeles. A unidade de electroforese conéctase a fonte de alimentación, e se aplica unha voltaxe constante de V. 9. Tinguido: Finalizada a electroforese extraénse os xeles da unidade de electroforese e deposítanse nunha cubeta de cristal. Os xeles se fixan e lavan duas veces con 50 ml por xel de 20% etanol en auga destilada no microondas (de 45 segundos a 1 minuto; 50-70ºC). Axitar 5 minutos. 10. Lavar unha vez con 100 ml de auga destilada/xel a ~80ºC no microondas, axitar durante 2 minutos e repetir o lavado. 11. Tinguir con 25 ml de solución de tinguido Biosafe por gel, suficiente como para cubrir os xeles. Tapar con parafilm a cubeta e meter no microondas. Quecer a 70-80ºC a máxima potencia (dous pulsos de 20 segundos; parar se comeza a ferver). Sacar e deixar en axitación suave durante 10 minutos. 12. Eliminar a solución de tinguido. Lavar con 100 ml de 10% etanol en auga destilada por xel en microondas a 50-70ºC. Sacar do microondas e poñer papel adsorbente. Axitar 15 minutos (o ata que se faga o destinguido correctamente). 67

72 TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE EXERCICIOS DA PRÁCTICA DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE Pregunta 1: Representar o logaritmo do peso molecular dos marcadores no eixo Y fronte a movilidade relativa de ditos marcadores (distancia migrada polo marcador/distancia migrada pola fronte de azul de bromofenol) no eixo X. Calcular o peso molecular das bandas 1, 2, 3, 4.1 e 4.2. Empregando o Atlas Proteico Humano ( obter os pesos moleculares das devanditas proteínas e comparar os resultados obtidos na práctica cos da base de datos. Pregunta 2 A proteína representada a continuación é a proteína transportadora de anións de eritrocitos (banda 3). Imaxine que purificou dita proteína en estado oxidado e que as cisteínas 317 y 201 están implicadas na formación de pontes disulfuro intra- e intermoleculares (entre diferentes monómeros). Dibuxe un esquema do patrón de bandas, cos seus pesos moleculares correspondentes, que esperaría tras unha SDS- PAGE desta proteína en presencia e ausencia de beta-me. 68

73 6. MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA (código calendario de prácticas: EDAFO)

74

75 MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA PRÁCTICA Realizarase unha saída a unha zona próxima á cidade para facer o estudo do medio físico dun emprazamento, mediante a caracterización dos distintos factores do medio e das súas interrelacións Para cubrir polo alumnado: Data da saída Área de estudo Cartografía utilizada Datos do emprazamento Posición fisiográfica Coordenadas xeográficas Pendente altitude Estudo do relevo. Corte topográfico Materiais xeolóxicos Morfoloxía dos solos Estudo do clima. Diagrama de Thornthwaite Vexetación e uso do solo Interpretación conxunta dos factores do medio físico nese emprazamento 71

76 MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA 72

77 7. MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE (código calendario de prácticas: ECO)

78

79 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 1. INTRODUCIÓN 1.1. DESENVOLVEMENTO DA PRÁCTICA. O sistema de posicionamento global mediante satélites (GPS: Global Positioning System) supón un dos máis importantes avances tecnolóxicos das últimas décadas. Deseñado inicialmente como ferramenta militar para a estimación precisa de posición, velocidade e tempo (para determinar por triangulación, a altitude, lonxitude e latitude de calquera obxecto na superficie terrestre), utilizouse tamén en múltiples aplicacións civís, incluíndo o traballo de campo en disciplinas tales como a botánica, a zooloxía, a ecoloxía, as ciencias da terra, etc. Nesta práctica adquiriredes unhas nocións mínimas sobre o uso destes equipos, así como das limitacións dos equipos que de modo máis frecuente empréganse no noso campo. A práctica consistirá en tres fases ben diferenciadas que se realizarán en tres sesións consecutivas. Na primeira sesión realizarase no campo (neste caso no Campus Sur da USC). A sesión efectuarase en parellas ás que a cada unha corresponderalles o seu respectivo receptor GPS. O lugar no que se iniciará a práctica será a porta principal da Facultade de Bioloxía. É posible que durante as horas da práctica existan precipitacións ou condicións atmosféricas adversas, que en principio non suporán suspensión da práctica a non ser que sexan extremas. Recomendámosvos a lectura do apartado recomendacións xerais para o traballo no campo para que acudades convenientemente preparados. Do mesmo xeito é necesario que previamente se leu o documento sobre os Sistemas Satelitales de Navegación Global, que se poderá descargar da páxina da USC Virtual, correspondente a esta materia. Durante, esta práctica primeiramente realizarase unha breve introdución a preto das recomendacións xerais para o traballo no campo. Posteriormente explicarase o emprego dos diferentes modelos de GPS que se van a utilizar durante o desenvolvemento da mesma, proseguindo coa asignación do GPS correspondente a cada parella. A continuación procederase á captura de datos, tal e como se especifica no correspondente apartado desta memoria (Sección 2.2). A segunda sesión realizarase na sala de informática. Comezarase cun tempo para a aclaración de dúbidas sobre o documento de Sistemas Satelitales de Navegación Global. A continuación explicarállevos como configurar un porto USB como un porto COM, e como importar os datos dun GPS a un PC, a través dun software específico da casa dos GPS empregados. Realizardes unha importación de datos desde o GPS que se vos asignou na sesión anterior. A continuación aprenderedes a exportar (a un arquivo de texto sen formato) desde o devandito software os arquivos de datos que previamente importastes. Estudaremos o contido do arquivo exportado e modificarémolo para que poida ser empregado nun Sistema de Información Xeográfica (GIS). A continuación desde un GIS (ArcMap 9.2 Esri ) importarase devandito arquivo e aprenderemos unhas mínimas nocións de edición de datos que nos permitan crear arquivos de puntos, liñas, polilíneas e polígonos a partir de puntos, así como a modificar arquivos de puntos. Por último aprenderemos a deseñar mostraxes desde un GIS mediante 75

80 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE Hawth's Analysis Tools for ArcGIS, creando arquivos de puntos. Unha vez creado estes arquivos aprenderemos a exportalos desde o ArcMap e a importalos ao GPS. A última sesión realizarase no campo (de novo no Campus Sur da USC). A práctica efectuarase en parellas ás que a cada unha corresponderalles o seu respectivo receptor GPS. O lugar no que se iniciará a práctica será a porta principal da Facultade de Bioloxía. As recomendacións climatolóxicas da primeira sesión volven ser aplicables. Comezarase coa expiación do uso do GPS en navegación, tras o cal procederedes a buscar neste modo as coordenadas das mostraxes xeradas na sesión anterior. Unha vez cheguedes a estas coordenadas procederedes á adquisición de datos inmediatos (i.e. orientación, pendente, altitude, pedregosidade, estima da cobertura vexetal por estratos), para proseguir á mostraxe de árbores en parcelas de radio de 20 metros. 76

81 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 1.2. RECOMENDACIÓNS XERAIS PARA O TRABALLO NO CAMPO Aínda que para a práctica que imos realizar non abandonaremos o Campus Sur da USC, é conveniente que coñezades algúns aspectos e medidas de seguridade importantes á hora de realizar o traballo de campo. Non desdeñes estes consellos, si traballas no campo co paso do tempo acabarás, desgraciadamente, coñecendo a persoas que o pasaron moi mal por desatendelos Recomendacións xerais Non saiades nunca sós ao campo. Por cuestións de seguridade, é necesario saír como mínimo en parellas. Non te tomes esta recomendación a treo. Informade sempre a unha persoa próxima das vosas intencións sobre a ruta que ides seguir. Cando vaiamos con persoas con diferente forma física, o que ten a peor forma marca o ritmo do grupo ao que nos adecuaremos con paciencia. Dosificade os esforzos e descansade cando o necesitedes. Si suades, non esquezades abrigarvos ao descansar. Non esquezades nunca o teléfono móbil coa batería cargada (aínda que en moitas zonas non teredes cobertura) nin o GPS (cando o teñades). Si non coñeces perfectamente a zona consulta antes cartografía e leva sempre un mapa. Non comades froitos ou fungos que non saibades con seguridade que son comestibles. Non bebades auga que non sexa potable de forma verificada. Ollo coas augas de alta montaña; en ocasións as altas concentracións minerais poden causar problemas gástricos Condicións meteorolóxicas Consultade sempre unha predición meteorolóxica fiable (i.e. antes de saír ao campo. Si as condicións son adversas ou hai risco das mesmas, sempre que sexa posible aprazade a saída. De non ser así tomade as maiores precaucións posibles. Nos días calorosos, empezade a actividade co tempo necesario para acabala antes da hora de máis calor. Coidado coa caída da noite, consultade previamente a hora do ocaso e tede en conta que dentro de cubertas vexetais e/ou en vaguadas e/ou en pendentes con orientación este e/ou co ceo encapotado a luz extínguese antes. Calculade cunha ampla marxe de seguridade - sempre pode haber imprevistos - o tempo do camiño de retorno Recomendacións sobre a roupa e calzado Hai que levar a roupa e o calzado adecuado e dependendo da época do ano. Selecciona sempre roupa cómoda. Para unha saída sinxela (p.e. camiños, pistas, etc.) é suficiente un chándal e uns deportivos. Si trátase dun traballo en campo xa teremos que levar boa roupa e calzado. 77

82 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE A roupa debe de ser lixeira, que permita o traballo físico e que transpire. Que a roupa se poida quitar por capas é unha boa opción cando fai frío e imos realizar traballo físico. En canto á protección da choiva no mercado hai unha gama moi ampla de tecidos impermeables. Si non ides traballar con asiduidade no campo un impermeable e un pantalón plástico son unha opción óptima (véndeno en calquera ferraxaría a un prezo moi razoable). O problema do plástico é a falta de transpiración, por iso si pensades saír con frecuencia ao campo ou traballar en alí no futuro é posible que vos compense realizar un investimento noutras opcións. Como dixemos existe unha gama amplísima de tecidos onde elixir, ademais das características previamente comentadas (lixeiras, cómodas e que transpiren) tede en conta a resistencia á abrasión e ás posibles roturas ocasionadas pola vexetación. Tanto o plástico como algunhas pezas de alta montaña non están deseñadas para traballar entre vexetación que posúa petiscos ou espiñas (o que é habitual na nosa xeografía, p.e. Ulex sp. ou Rubus, sp.), que se rasgarán rapidamente perdendo a súa impermeabilidade. Os cortaventos encerados reúnen todas estas características e resultan moi difíciles de rasgar (podendo ser reparados cando isto ocorre), no mercado existen multitude de marcas e prezos tanto de chaquetas como de cubrepantalóns. É interesante que as chaquetas teñan petos externos de rápido acceso así como petos carpeteros, etc. Cando hai choiva ou risco da mesma levade sempre unha muda completa. En canto ao calzado levádeo resistente e cómodo. Comprade botas que se axusten ás vosas necesidades, prestando atención aos diferentes tipos de solas, que son a parte máis importante da bota, deben dar agarre á vez que ser duradeiras. A selección dunha bota de calquera marca que teña sola Vibram é acertada. Si optades por botas con membrana de Goretex, sede conscientes que si se vos chega a romper a membrana, ao ter que impermeabilizar externamente a bota, os tecidos interiores dan peores resultados que en botas sen membrana. Independentemente da opción escollida, as polainas de cordura son moi aconsellables cando chove, protexen tanto a bota como a parte baixa do pantalón, que en ocasións queda ao descuberto do cubrepantalón. Non uses nunca calzado novo para unha saída ao campo. Coidádevos os pés, prestade atención a que non teñades engurras nos calcetíns para evitar as bochas. Os calcetíns con teflón son unha correcta solución ao problema das bochas. Leva sempre uns calcetíns de reposto. Unha solución de emerxencia, ou para aforrar investimentos, que serve tanto para tecidos de algodón (p.e. un pantalón vaqueiro) como para calquera calzado de pel (p.e. uns deportivos) é o uso de sprays impermeabilizantes que poderedes atopar en calquera tenda de deportes ou armería. Aínda que faga bo tempo é sempre aconsellable levar un chubasquero. Nos días de sol non esquezas unha gorra ou chapeu e as lentes de sol. Nos días de frío un pescozo de tecido polar é un bo aliado, e con frío extremo un pasamontañas Recomendacións sobre o equipamento 78

83 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE Levade unha pequena mochila impermeable cunha navalla, un cordón, unha lanterna ou frontal, mistos, unha bolsa de plástico e papel hixiénico. Si tedes cámara de fotos levádea convosco. É conveniente levar unha botella de auga, froitos secos, galletas e froita. Durante a xornada bebe auga e toma algún alimento de cando en vez. Levade convosco un pequeno botiquín con desinfectante, gasas, esparadrapo, apósitos adhesivos, tesoiras, pinzas, analxésicos, pomada antiestamínica, pomada para as queimaduras, vaselina, protección solar e repelente de insectos Recomendacións no caso de que nos perdamos Procura non afastarche nunca do grupo ou parella. Si por calquera razón debes apartarche, avisa ao resto para que espérenche. Si algunha vez pérdesche, espera, en canto alguén observe que faltas volverá a por ti. É máis fácil atoparche por onde xa se pasou, así que é mellor esperar e non empezar a andar sen saber onde ir. Cando alguén se perde os equipos de procura adoitan facer sinais cun chifre (óuvese máis lonxe que a voz), procura contestar gritando Recomendacións en caso de accidente O número de emerxencias internacional é o 112. No entanto en ocasións atopárdesvos en zonas sen cobertura ou nas que a asistencia médica pode tardar moito en chegar por iso é conveniente que teñades formación en primeiros auxilios (atragantamiento, corpos estraños, escordaduras, luxaciones, fracturas, transporte de accidentados, feridas, hemorraxias, mareo, lipotimia, picaduras e mordeduras e RCP básica). De non ser así busca onde facer un curso (consultade no Servizo de Vixilancia dá Saúde dá USC) Recomendacións para como tomar notas no campo É conveniente que levedes sempre un cartafol ou un portafolios duro (de plástico ou metal) que vos sirva de soporte á hora de escribir. Tomade notas sempre con lapis e sobre papel de alto gramaxe, xa que no caso de que a folla se molle a impresión non se borra, a diferenza da tinta dun bolígrafo ou un rotulador. Canto maior sexa o gramaxe menor será a posibilidade de que rompa ou desfaga si móllase. Para previr a choiva no mercado existen protectores plásticos para papel normal ou papel plastificado con calco Recomendacións para os desprazamentos Cumpre sempre as recomendacións xerais sobre seguridade ao volante. Polo menos un dos acompañantes debe conducir. Os desprazamentos no campo realízanse usualmente en todoterreo. Adquirir coñecementos en condución off-road, emprego de cabestrantes (i.e. winch ) seravos 79

84 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE necesario si pensades traballar no campo no futuro. Cando empreguedes un todoterreo non esquezades equipalo cunha pa, luvas, ferros e cabestrante manual, cando o coche non o teña eléctrico. 80

85 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. SESIÓN PRIMEIRA O profesor asignarache unha das zonas do esbozo adxunto para que comeces a práctica. Debes dirixirche a esa zona e buscar nas páxinas seguintes o código correspondente á devandita zona para realizar a captura de datos que se sinala na correspondente tarefa para esa zona. Posteriormente diríxeche á seguinte zona (da zona 1 á 26 en bucle pechado) e realiza a correspondente tarefa e así sucesivamente ata esgotar o tempo da práctica. Os mapas individuais de cada zona non están orientados nin teñen norte, así que utiliza o adxunto para orientar cada un. 81

86 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 01 Facultade de Química TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 20 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 01) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 01_01. NOTAS: Guíache para establecer os vértices polas esquinas do edificio Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 82

87 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 02 Entrada Principal Campus Sur TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta principalmente por varias especies diferentes cedros, tullas, criptomerias, magnolios, adelfas, etc. (Cedrus deodara, Euonymus japonicus, Magnolia grandiflora, Prunus cerasifera var. Pisardii, Nerium oleander, Criptomeria japonica, Cedrus atlantica, Camellia japonica, Thuja orientalis e Salix babilonica) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 02_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 02_F. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas as árbores da beirarrúa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 83

88 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 03 Facultade de Dereito TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por cedros, álamos e un ciprés (Cedrus deodara, Cedrus atlantica, Populus alba e Cupressus lusitanica) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 03_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 03_F. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo.. NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas os tejos nin o piñeiro. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 84

89 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 04 CESGA, CSIC, Biblioteca C.A. y Guardería TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 10 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 04) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 10), p.e. 04_01. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 85

90 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 05 Viviendas de funcionarios e antigas casas de catedráticos TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 16 platanos (Platanus orientalis) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 05) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 16), p.e. 05_01. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 86

91 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 06 Pistas de deportes TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 18 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do estanque que están marcados no plano adxunto (todos os vértices e 3 puntos por cada circunferencia). Identifícaos co código da zona (i.e. 06) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 06_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Camiña e toma as coordenadas polo bordo de pedra do estanque. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 87

92 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 07 Facultade de Políticas TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada unha das 12 camelias (Camellia japonica) que están marcadas no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 07) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 12), p.e. 07_01. NOTAS: Toma a coordenada no centro dos pés de cada unha das cepas de camelia Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 88

93 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 08 Xardín entre Fac. de Farmacia e Fac. Políticas TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 19 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 08) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 19), p.e. 08_01. Para os 5 primeiros nodos (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada nodo, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 89

94 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 09 Facultade de Farmacia TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 9 carballos americanos (Quercus rubra) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 09) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 09), p.e. 09_01. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e manteaa no resto das árbores. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 90

95 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 10 Auditorio e Observatorio Astronómico TAREFA: Polígonos múltiples de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 28 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do sebe de aligustre (Ligustrum ovalifolium) que están marcados en en a ampliación do plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 10) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 10_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Toma as coordenadas sobre os sebes no seu punto medio. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 91

96 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 11 Colexios Maiores TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 19 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 11) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 19), p.e. 11_01. Para os 7 primeiros nodos (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada nodo, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 92

97 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 12 Capela Universitaria e campo de hockey herba TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 14 castiñeiros de indias (Aesculus hippocastanum) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 12) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 14), p.e. 14_01. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 93

98 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 13 Piscina TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 8 carballos (Quercus robur) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 13) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 08), p.e. 13_01. Para as 8 árbores (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntanse tres árbores que xa non existen. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 94

99 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 14 Campo de fútbol e CIBUS TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 bidueiros (Betula alba) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 14) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 13), p.e. 14_01. Para os 5 primeiras árbores (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 95

100 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 15 Pavillón Estidiantil, Facultades de Bioloxía e de Matemáticas TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 16 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 15) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 15_01. NOTAS: Guíache para establecer os vértices pola proxección das terrazas máis saíntes. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 96

101 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 16 Casa Gradín e Pavillón de Servicios TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 20 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 16) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 16_01. NOTAS: Guíache para establecer os vértices polas esquinas do edificio Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 97

102 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 17 Estadio de atletismo TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 14 perales chineses (Pyrus callery var. Cume nevado) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 17) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 14), p.e. 17_01. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntase unha árbore que xa non existe Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 98

103 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 18 FEUGA TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 13 plátanos (Platanus orientalis) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 18) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 13), p.e. 18_01. NOTAS: Coidado cos coches, traballa sempre sobre o illote. Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 99

104 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 19 Fac. de Enxeñería Química e Informática TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 11 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 19) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 19_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Guíache para establecer os vértices pola proxección das terrazas. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 100

105 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 20 Invernadoiros, CACTUS e Institutos de Investigacións TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta principalmente por arces, plátanos e carballos americanos (Acer saccharinum, Acer platinoides e Quercus rubra) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 20_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 20_F. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas as árbores da beirarrúa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 101

106 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 21 Animalario de Bioloxía e Ampliación de Psicoloxía TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un das 25 camelias (Camellia japonica) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 21) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 25), p.e. 21_01. Para os 5 primeiras árbores (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Ao rexistrar as coordenadas, localiza o GPS sobre o centro da parte superior de cada unha das camelias Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) ZONA: 22 Residencia Monte da Condesa 102

107 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE TAREFA: Polilíneas. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 nodos que están marcados na ampliación do plano adxunto que corresponden a unha escultura. A escultura ten tres partes, correspóndenlle 5 a cada parte (dous extremos, o centro e dous intermedio). Identifícaos co código da zona (i.e. 22) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 5), p.e. 22_01. Para os 5 primeiros nodos (i.e ) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto. NOTAS: Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 103

108 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 23 Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 16 nodos do camiño marcado no plano adxunto(de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 23) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 23), p.e. 23_01. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 104

109 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 23B Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por acacias (Acacia melanoxylon) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 23B_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 23B_F. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 105

110 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 24 Facultade de Físicas TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 madroños (Arbutus unedo) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 24) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 15), p.e. 24_01. NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntanse dúas árbores que xa non existen. Non confundas os madroños cos teixos. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 106

111 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 25 Facultades de Filosofía, Psicoloxía e CC. Da Educación TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 10 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 25) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano, p.e. 25_01. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 107

112 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE ZONA: 26 Almacén, Servicios e Animalario TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por acacias, piñeiros e carballos (Acacia melanoxylon, Pinus pinaster e Quercus robur) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 26_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla mark ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 26_F. Realiza o mesmo tempo un track ou análogo. NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Fuente de la cartografía: http// PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.) 108

113 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 2.2. SESIÓN SEGUNDA: Segue as indicacións do profesor na aula de informática SESIÓN TERCEIRA: Diríxeche mediante o emprego do GPS en navegación a cada unha das coordenadas do arquivo que se cargou previamente. Dicha coordenada será o centro dunha circunferencia de radio 20m na que se establecerá como parcela de traballo. Sinala a localización de dicha coordenada no plano do apartado 3.3. Si a coordenada coincide cun edificio ou zona non practicable unicamente localízaa no mapa da sección 3.3 e busca a seguinte coordenada. Cando sexa posible, na parcela procederás a tomas os datos inmediatos, e contarás o número de árbores cun DBH (diámetro do tronco da árbore á altura do peito, i.e. 130cm) maior de 7 cm (22 cm de diámetro). Cando unha cepa bifúrquese a unha altura inferior á do DBH contaranse todos os pés superiores a 7 cm de DBH. 109

114 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 3. RESULTADOS 3.1. SESIÓN PRIMEIRA: Os resultados da primeira parte da práctica serán os arquivos obtidos ao descargar o GPS tras realizar as tarefas sinaladas na sección 2.1 deste documento. Valorarase tanto a súa adecuada obtención como o número de sectores realizado SESIÓN SEGUNDA: Os resultados da segunda parte da práctica serán os arquivos requiridos tras editar os arquivos obtidos co GPS na primeira parte da práctica. Devanditos arquivos enviaranse como un traballo á USC Virtual, e consistirán en temas de ArcGis (.shp) correspondentes os diferentes tipos de elementos empregados: polígono de lados regulares, polígonos de lados irregulares, polígonos múltiples, liñas, polilíneas e puntos. Do mesmo Os resultados da primeira parte da práctica serán os arquivos obtidos ao descargar o GPS tras realizar as tarefas sinaladas na sección 2.1 deste documento. Valorarase tanto a súa adecuada obtención como o número de sectores realizado. modo crearase un arquivo de puntos que será utilizado na última sesión da práctica, que será igualmente enviado como un traballo á USC Virtual. Ademais na páxina da USC Virtual colgaranse dous traballos referidos aos erros dos GPS, que serán explicados durante esta sesión. Para iso o alumno deberá de consultar a información que se lle proporcione na devandita páxina. Posteriormente deberá de contestar ás seguintes preguntas: a) Como afecto ás medicións efectuadas a xeometría da constelación de satélites. Adxunta unha gráfica da disposición dos satélites durante a realización da práctica. Que conclusións poderías extraer sobre os erros cometidos durante a práctica? b) Empregando os datos que se deixarán como segundo traballo na USV Virtual para os datos fornecidos calcula para cada conxunto de coordenadas capturadas para unha mesma posición: a) a coordenada media; b) o erro da media do 95%; c) as coordenadas X e E, máximas e mínimas e o correspondente rango; e d) o erro relativo do rango calculado en referencia á distancia entre as medias previamente calculadas. Que conclusións poderías extraer para os diferentes sectores estudados? 110

115 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 3.3. SESIÓN TERCEIRA: Cando sexa posible, de acordo co especificado no documento do manual de prácticas que se poderá atopar na páxina correspondente da USC Virtual, enche un dos estadillos adxuntos para cada parcela. Marca aproximadamente a posición de cada pardela no mapa adxunto. Ademais na páxina da USC Virtual colgarase un traballo referido a estímaa do número de árbores do campus, calculado de acordo á mostraxe realizada (para iso na segunda sesión necesitarás calcular a extensión do campus). Contesta á seguinte pregunta: Cantas árbores estimas que hai no Campus Sur? 111

116 MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE 112