Imunofluorescencija 1944. - Robert Coons protutijela se mogu označiti molekulama koje imaju sposobnost fluorescencije fluorokromi - apsorbiraju svjetlost jedna valne duljine (ekscitacija), a emitiraju svjetlost druge valne duljine (emisija) fluorescencijski mikroskop izvor UV svjetla vizualizacija molekula protutijela obilježenih fluorokromom vezanih za antigene na stanicama ili tkivnim preparatima 1
Imunofluorescencija Na koje regije protutijela se konjugiraju fluorokromi? 2
Imunofluorescencija Koje su prednosti indirektnog bojenja staničnih ili tkivnih preparata pomoću fluorescencijskih protutijela nad direktnim? 3
Detekcija IgM protutijela pomoću anti-igm protutijela s konjugiranim rodaminom Detekcija β stanica Langerhansovih otočića gušteraće pomoću protutijela specifičnih za enzim dekarboksilazu glutaminske kiseline (GAD) konjugirana na zelenu fluorescencijsku boju (npr. fluorescein) Detekcija α stanica pomoću protutijela specifičnih za hormon glukagon konjugirana na narančastu fluorescencijsku boju (npr. rodamin) 4
Imunofluorescencija Primjeri upotrebe -za identifikaciju subpopulacija limfocita (CD4 + i CD8 + subpopulacija T limfocita) -za identifikaciju pojedinih vrsta bakterija -za detekciju Ag-Ab kompleksa u autoimunim bolestima -za detekciju komponenti komplementa u tkivima -za lokalizaciju hormona i ostalih staničnih produkata, in situ (lokalizaciji antigena u tkivnim preparatima ili u subcelularnim odjeljcima) -može se koristiti za mapiranje lokacije ciljnih antigena Područje imunohistokemije, te fluorescencijske mikroskopije (izuzetno važne tehnike za istraživanje molekularne arhitektura tkiva ili organa) 5
Protočni citometar 6
Protočni citometar Fluorescence activated cell sorter (FACSCalibur, Becton-Dickinson) 7
8
Protočni citometar PRIMJENA (u klinici i istraživanju) određivanje vrste i broja leukocita u uzorku krvi (koliko stanica eksprimira ciljni antigen, distribucija stanica u uzorku, veličina stanica) -analiziranje populacija stanica koje su označene s 2 ili čak 3 različita protutijela (svako označeno različitom fluorescencijskom bojom) (postoje brojne varijacije takvih multikolornih analiza) -protočna citometrija je jedna od ključnih metoda u imunologiji i staničnoj biologiji -tipizacija leukemija protočnim citometrom, odn. imunofenotipizacija -mjerenje subpopulacija T stanica (važan prognostični indikator za AIDS) - itd... 9
Protočni citometar PRIMJENA U ISTRAŽIVANJU U PODRUČJU BIOLOGIJE MORA: uzorak fotosintetskog pikoplantona iz mora pokazuje 3 različite populacije 10
Alternative reakcijama antigena i protutijela protein A i G Protein A - Staphylococcus aureus Protein G - Streptococcus 11
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) biotin kompleks avidin glikoprotein iz bjelanjka jajeta streptavidin bakterijski protein (Streptomyces avidinii) biotin vitamin esencijalan za sintezu masti Ka: oko 10 15 12
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) biotin kompleks 13
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) biotin kompleks 14
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) biotin kompleks 15
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) biotin kompleks 16
Imunoelektronska mikroskopija vizualizacija specifičnih intracelularnih komponenti oznaka visoke elektronske gustoće feritin (globularni protein plazme, veže željezo) čestice koloidnog zlata konjugirana na Fc regiju specifičnog protutijela (direktno bojanje) ili na sekundarno protutijelo (indirektno bojanje) Površina B-staničnog limfoma: Veće točke protutijela specifična za MHC klasu II označena česticama zlata veličine 30 nm Manje točke protutijela specifična za MHC klasu I označena česticama zlata veličine 15 nm 17