Mikrobiologia Medikoa.

Transcript

1 Mikrobiologia Medikoa. Laborategiko praktiken gidaliburua Miren Basaras eta Adelaida Umaran EUSKARA ETA ELEANIZTASUNEKO ERREKTOREORDETZAREN SARE ARGITALPENA 1

2 Aurkibidea or. 1. atala. Oinarrizko teknologia 3 1. Identifikazio fenotipikoa Mikroskopia Mikroorganismo baten bakartzea eta kultura purua Kultura puruen identifikazioa 6 2. Genomaren detekzioa 6 3. Antigenoen detekzioa antigorputz espezifikoaren bidez 7 4. Zeharkako diagnostikoa: serologia edo immunodiagnostikoa 7 Mikrobiologia-laborategiko arauak 8 Erabiliko diren materialak 9 2. atala. Mikrobiologiako praktiken fitxak fitxa. Mikrobiologiarako eskaera-orrien erabilera fitxa. Hazkuntza-inguruen prestakuntza fitxa. Esterilizazio-probak fitxa. Laginaren ereintza fitxa. Bakterioen mugikortasunaren behaketa fitxa. Bakterioen tindaketak fitxa. Lagin orofaringeoaren azterketa mikrobiologikoa fitxa. Gernu-laginaren azterketa mikrobiologikoa fitxa. Koko patogenoen identifikazioa fitxa. Bazilo gram-negatibo patogenoen identifikazioa fitxa. Antibiograma agarrean (bauer-kirby froga) fitxa. Onddo patogenoen identifikazioa fitxa. Protozoo patogenoen identifikazioa fitxa. Helminto patogenoen identifikazioa 59 Fitxa guztien emaitza-orriak atala. Mikrobiologiako atlasa 78 Laborategiko tresnak: 26 irudi Bakteriologia: o Tindaketak: 11 irudi o Identifikazio-frogak 33 irudi Mikologia: 9 irudi Protozooak: 14 irudi Helmintoak: 19 irudi Prozedurak azaltzeko 11 bideo eta 16 eskema 2

3 1. atala. Oinarrizko teknologia Diagnostiko mikrobiologikoaren helburua da gaixotasuna eragin duen mikroorganismoa identifikatzea. Baliagarria da, alde batetik, tratamendua ahal den azkarren hasteko, eta, bestetik, posible balitz, transmisio-bidea identifikatzeko eta mozteko. Medikuek, datu klinikoetan oinarritutako behin-behineko diagnostikoa kontuan harturik, erabakitzen dute zer lagin hartu eta mikrobiologia-laborategian zer mikrobio bilatu behar duten, eta mikrobiologialaborategirako eskaera zehatza betetzen dute. Odolean eta barruko likidoetan izan ezik, infekzioa egon ala ez, lagin guztietan ehunka mikroorganismo egongo dira beti, giza mikrobiotakoak edo inguruko kutsatzaileak direnak. Gainera, infekzioak ez du beti gaixotasun infekziosoa eragiten, zeren eta infekzio azpiklinikoak edo sintomarik gabeko eramaileak egon baitaitezke. Mikrobiologoak aurretik jakin behar du zer mikroorganismo patogeno bilatzen ari den, diagnostikorako estrategia eta metodologia egokia hautatzeko. Eskarmentu handia behar da hazkuntzainguruetan hazten diren kolonien artean infekzioaren eragilea izan daitekeena hautatzeko eta bakartzeko. Edonola ere, pazientea tratatzen duen medikuak interpretatu beharko ditu mikrobiologian lortutako emaitzak (mikrobiologiako txostena), beste datu batzuekin batera. Zalantzak egotekotan funtsezkoa da klinikoen eta mikrobiologoen arteko komunikazioa egotea. Pazienteen laginak modu egokian lortzea ezinbestekoa da mikrobiologia-laborategian diagnostiko zuzena egiteko: gaixotasunaren fase akutuan eta, ahal izanez gero, gaixoak mikrobioen kontrako botikak hartu baino lehen, infekzio-lekutik laginaren kantitate nahikoa hartu behar da, material esterila eta teknika aseptikoa erabiliz. Lagina hartu ostean ahal bezain laster aztertu behar da, eta laborategirako bidean garraio-inguru eta -baldintza egokiak erabili behar dira, mikroorganismoen bideragarritasuna gordetzeko baina, aldi berean, ugalketa eragozteko. 1. taula. Hainbat infekzio-mota diagnostikatzeko hartu beharreko laginak. INFEKZIO MOTA INFEKZIO-LEKUA LAGINA Zistitisa, nefritisa Gernubidea Gernua Beherakoa, disenteria Digestio-aparatua Gorozkiak Pneumonia, tuberkulosia, faringitisa, otitisa Arnasbidea Orofaringeko torunda Karkaxa Albeoloen garbiketa Meningitisa, entzefalitisa Nerbio-sistema zentrala Likido zerebroespinala Odola Uretritisa, zerbizitisa Bide genitala Torunda genitourinarioa Traumatismoak, ebakuntzak Larruazala Zaurietako torunda Osteomielitisa Artritisa Hezurra Giltzadurak Biopsia Zornea Aspiratua Septizemia Odola Odola Endokarditisa Endokardioa Odola Behin lagin egokia lorturik mikrobiologia-laborategian, identifikazioa lortuko dugu infekzioaren mikroorganismo eragilea bera edo haren osagaiak detektatuz (diagnostiko zuzena), edo haren kontrako erantzun immune espezifikoa detektatuz (zeharkako diagnostikoa). Diagnostiko zuzena egiteko hiru metodologia erabiltzen dira kasuen arabera: 1) mikroskopia eta kulturen bidezko identifikazio fenotipikoa, 2) diagnostiko genetikoa, eta 3) antigenoen detekzioa. 3

4 Laginen bilketa Odola Infekzio-lekutik: odola, karkaxa, gernua, gorotzak, biopsiak, Patogenoaren GENOMAren detekzioa 1. Identifikazio fenotipikoa 1.2 Kultura puruan gaixotasunaren eragilea bakartzea 1.1 MIKROSKOPIO mikroorganismoaren behaketa Plasma 3. Patogenoaren ANTIGENOaren IDENTIFIKAZIOA IMMUNO DIAGNOSTIKOA 4. Patogenoaren kontrako ANTIGORPUTZ espezifikoen IDENTIFIKAZIOA 1.3 Hazkuntzaren araberako MIKROORGANISMOAREN IDENTIFIKAZIOA Antimikrobianoen aurreko sentikortasunaren azterketa 1. irudia. Mikrobiologia diagnostikoaren prozedurak. 1. Identifikazio fenotipikoa 1.1. Mikroskopia Mikroorganismoaren tamaina txikiegia da begi hutsez ikusteko. Birusak dira txikienak eta mikroskopio elektronikoan baino ez dira ikusten. Bakterio patogenoen ohiko tamaina mikroi baten ingurukoa da. Beraz, ikusi ahal izateko mikroskopio optikoa 100 handipeneko objektiboarekin erabili behar da. Onddoak, protozoo patogenoak eta helminto parasitoen arrautzak ondo ikusten dira mikroskopio optikoan 40 handipeneko objektiboarekin. Mikroskopioak eta hainbat tindaketa bereizgarri erabiliz mikroorganismoak itxuraren arabera taldekatzen dira. Irizpide morfologikoak nahikoak dira helminto, protozoo eta lizunen espezie patogenoak identifikatzeko. Legamiak eta bakterio patogenoen kasuetan, datu morfologikoez gain, metabolismoaren ezaugarriak aztertu behar dira, eta, horretarako, mikroorganismoak kultura puruan bakartu eta hazi behar dira. 2. irudia. Mikroskopio optikoa. 4

5 1.2. Mikroorganismo baten bakartzea eta kultura purua Koch-en postulatuetan oinarriturik, teknika klasikoa da gaixoaren laginetatik gaixotasunaren mikroorganismo eragilea bakartzea eta identifikatzea. Bakterio patogenoen kasuan erabiliena da, behin kultura lortuta antibiotikoekiko sentikortasuna aztertzeko erabil daitekeelako. Lagina hazkuntza-inguru solidoen azalean (agarretan) ondo barreiatuz mikrobio-zelulak elkarrengandik aldenduta geratzen dira, eta, ugaldu ahala, zelula bakar batetik sortutako zelula-masa homogeneoak edo koloniak agertzen dira agarrean. Itxura bateko eta besteko kolonietatik bakar bat har daiteke, eta, beste hazkuntza-inguru batean barreiatuz, kultura purua lortzen da. 3. irudia. Koloniak agarrean. Gure inguruan edonon topatzen dira mikroorganismoak: airean, mahaian, esterilizatu gabeko edozein tresnatan eta gure eskuetan. Horregatik, mikrobio-kulturak puru mantentzeko teknika aseptiko zorrotzak aintzat hartu behar dira, inguruko mikroorganismoen kutsadura galarazteko. Hazkuntza-inguruak eta ontzi mota guztiak erabili aurretik esterilizatu behar dira, eta mikroorganismoak inguru batetik bestera eramateko sutan esterilizatutako ereite-uztai edo ereite-orratz metalikoak erabiltzen dira. Kulturak metxeroaren sugarraren inguruan erabiltzen dira beti, berotutako aireak mikroorganismo kutsatzaileak kanpora eraman ditzan. 4. irudia. Lan-eremua, metxeroa, ereite-uztaia, agarra duten kutxak eta saiodiak. Eragile fisiko eta kimiko gehienak, aplikaziointentsitatearen eta denboraren arabera, erabil daitezke esterilizatzeko (mikroorganismo guztiak suntsitzeko) edo desinfektatzeko (infekzio-arriskua desagerrarazteko mikroorganismo-karga zeharo gutxituz). 2. taula. Esterilizazio- eta desinfekzio-prozeduretan erabilitako eragileak. Eragile fisikoak - Bero hezea: Autoklabea Tindalizazioa - Bero lehorra: Flanbeatzea Erretzea Pasteur labea - Iragaztea - Izpi ultramoreak - Erradiazio ionizatzaileak Eragile kimikoak - Etileno oxidoa - Formaldehidoa - Glutaraldehidoa - Hidrogeno peroxidoa - Azido paraazetikoa - Kloroaren eratorriak - Iodoaren eratorriak Autoklabea da dudarik gabe esterilizatzeko metodorik erabiliena. Autoklabea ontzi bat da, lurruna presiopean jartzen duena. Ohiko baldintza hauetan erabiltzen da: 1 atm, 121 ºC eta minutu. Baldintza horietan, mikroorganismo guztiak suntsitzea lortzen da, esporak barne. Hazkuntza-inguruak prestatu, eta berehala autoklabean esterilizatzen dira. Erabilitako kulturak eta lagin infekzioso guztiak autoklabeko poltsan uzten dira, bota aurretik esterilizatu behar direlako. Gaur egun berehalako daude, 5

6 ebakuntza-gelatan erabiltzen direnak, eta horietan tenperatura altuagoa erabiltzen da, denbora laburtzeko (134 ºC, 3-7 minutu). 5. irudia. Autoklabeak Kultura puruen identifikazioa Kultura puruak beste hazkuntza-inguru selektibo eta bereizgarrietara aldatzen dira, eta, inkubagailu batean gordetzen dira gehienetan 37 ºC-an eta gutxienez 18 orduz (espezie batzuek astebete behar dute ikusteko moduko koloniak eratzeko). Kulturak, bakartu nahi dugun espeziearen arabera, aerobiosian edo anaerobiosian inkubatzen dira, eta, hazkuntzen emaitzak kontuan harturik, identifikazioa egiten da. Ohiko mikroorganismo patogenoak identifikatzeko erabiltzen diren kulturak txikitu eta automatiza daitezke diagnostikoa arinago lortzeko. Birusak eta hainbat bakterio talde (klamidiak eta errickettsiak) zelulen barruko parasito hertsiak dira, eta ugaldu nahi baditugu, zelula-kulturetan txertatu beharko ditugu. Erabilienak zelula-lerro hilezkorrak dira, kulturak egiteko material amaiezina eskaintzen baitute. Birus mota bakoitzak, zelulen barruan ugaldu ahala, eragin bereizgarri batzuk sortzen ditu zelula-kulturetan birusa identifikatzeko balio dutenak (eragin zitopatikoak). Dena dela, birusak identifikatzeko prozedura ohikoena antigenoak edo antigorputzak detektatzea da. 6. irudia. Kutxak eta hodiak inkubagailuan. Mikroorganismoak haztea ezinezkoa edo zaila denean eta, tratamendua lehenbailehen aukeratzeko, berehalako diagnostikoa beharrezkoa denean (meningitisaren kasuetan, esaterako), zuzenean patogenoaren genoma edo patogenoaren antigenoak bilatzen dira laginean. Baina kulturak baliagarriak dira antibiotikoekiko sentikortasuna neurtzeko eta geroko ikerketa epidemiologikoak egiteko, eta, horregatik, ahal denean, egin behar dira. 7. irudia. Agarosazko gelean ikus daitezkeen azido nukleikoen zatiak. 2. Genomaren detekzioa Kulturen identifikazioa baino azkarragoa da, eta sentikortasun, espezifikotasun eta segurtasun handiagokoa. Mikroorganismoaren genoma hainbat modutan detekta daiteke. Esate baterako, murrizte-zatien luzerapolimorfismoari esker. Murrizte-endonukleasek mikroorganismoen genoma espezifikoki mozten dute, eta hainbat tamainatako zatiak ematen espeziearen arabera. Lagina, endonukleasekin apurtu ondoren, agarosazko gelean migratzen da, eta, tindatu ostean, zatiak azter daitezke. Beste aukera bat da DNA edo RNA zunda espezifikoen bidezko hibridazioa. Mikroorganismo bakoitzaren genoman bereizgarriak diren DNA edo RNA zatiak identifikatu ondoren, zati bereizgarriarekin elkartzen den zunda osagarria sintetizatzen eta markatzen da (molekula fluoreszente batekin adibidez). Lagina, euskarri fisiko batean jarrita, bilatzen ari 6

7 garen mikroorganismoaren zundarekin inkubatzen da, azido nukleikoak hibridatu ahal izateko. Garbitu ostean zundaren presentzia aztertzen da. Hibridazio positiboak mikroorganismoaren genomaren adierazlea da. Polimerasaren kate-erreakzioaren bitartez laginean dagoen genoma milioika aldiz anplifikatu egiten da abiarazle espezifiko batzuk erabiliz. Horrela, genoma detektatzeko frogen sentikortasuna nabarmen handitzen da. Teknika genetikoen erabilera oso garrantzitsua da GIBarekin infektatutako pazientearen plasman birus-karga kalkulatzeko (GIBaren RNA harizpien kopurua neurtuz). Birus-karga gaixotasunaren pronostikoaren eta tratamenduaren eraginkortasunaren adierazle ona da. 3. Antigenoen detekzioa antigorputz espezifikoaren bidez Eskuarki, hazkuntzaren araberako identifikazioa baino azkarragoa da, baina teknika immunodiagnostiko guztiek ez dute behar besteko sentikortasunik eta espezifikotasunik. Gehienak, antigenoak zein antigorputzak bilatzeko molda daitezke. Hainbat bakterioren kapsula-antigenoak arin bilatzeko latex bidezko aglutinazioa nahikoa da (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae). Immunofluoreszentzia zuzenaren edo entzimoimmunoanalisiaren bidez birus patogenoak detektatzen dira (esate baterako, B hepatitisarena edo errubeolarena). 4. Zeharkako diagnostikoa: serologia edo immunodiagnostikoa Mota honetako diagnostikoan, gizakiak sortu dituen antigorputzak detektatuko ditugu pazientearen plasma laginean. Beraz, odolaren lagina hartu beharra dago. Laborategian, odol-zelulak kentzeko odola zentrifugatu ondoren, plasman antigorputz espezifikoaren agerpena eta kantitatea aztertzen da, hainbat froga immunodiagnostiko erabiliz: hemaglutinazioa, osagarriaren finkapena, immunofluoreszentzia edo immunoentzimoanalisi ez-zuzenak. Infekzioaren lehenengo 7-10 egunetan IgM motako antigorputzak detektatzen dira, infekzio akutuaren adierazleak direnak. Geroago, IgG motakoak izango dira detektagarriak 2-4 asteren ondoren, infekzioaren amaieraren adierazleak. Patogeno baten kontrako IgG antigorputz espezifikoen maila fase akututik gaixondora lau aldiz igo dela frogatzeak patogeno hori infekzioaren eragilea dela diagnostikatzeko balio du. 7

8 Mikrobiologia ia-laborategiko arauak Mikrobiologia-laborategian patogeno infekziosoekin lan egiten da suaren inguruan. Horregatik, ezinbestekoa da ikasleek jarrera arduratsua izatea. Hasi baino lehen, praktika bakoitzaren prozedura gidan irakurri, eta behar diren materialak lan-eremuan daudela egiaztatu. Fitxa bukatu ondoren, dagokion emaitza-orria bete eta irakasleari eman. Norberaren arau higienikoak bete: Ikaslearen gauza guztiak armairu batean gorde, eta mahaian laborategiko gida eta marrazteko tresnak besterik ez utzi. Bata jantzi eta ilea aurpegitik erretiratu. Laborategi barruan ezin da jan, edan, txiklea murtxikatu, edo sakelako telefonoa erabili. Kulturak soilik metxero piztuaren inguruan zabaldu (metxeroa piztea eta amatatzea ikaslearen ardura da). Alde egin baino lehen lan-eremua txukundu eta eskuak garbitu. Ezustekoren bat gertatuz gero (kulturak erortzea edo gasarekin arazoak izatea, besteak beste), lasai egon eta irakasleari abisatu. Baztertzeko materialak eta hondakinak dagokien ontzira bota: 1. Infekziosoak autoklabe-poltsara: laginak hartzeko erabilitako material zikina, erabilitako hazkuntza-inguruak eta bakterio-kulturak. 2. Zorrotzak direnak berariazko edukiontzi batera: xiringak, orratzak, Pasteur pipetak eta erabilitako portak. (Beteta daudenean, ontzi horiek itxi eta autoklabean esterilizatzen dira, bota aurretik). Orratzak ez dira tolestu behar, ez eta berriro estali behar ere! 3. Ingurumenerako kutsatzaileak: egunero tindatzeko erabilitako tindagaiak ontzi batean biltzen dira. (Ontziak bete ondoren baimendun enpresa batek jasoko ditu birziklatzeko). 4. Bestelako hondakinak zakarrontzira: pospoloak, paperak eta abar. 8

9 irudia. Laborategiko hondakinen ontziak. Erabiliko diren materialak Tresnak Matrazeak Saiodi hutsak Petri kutxa hutsak Imana Probeta Xiringa Esterilizatzeko zinta Berotzeko aparatua Autoklabea Metxeroa Ereite-uztaia 1 µl-ko ereite-uztaiak 10 µl-ko ereite-uztaiak Ereite-orratza Torunda esterilak Mihia zapaltzeko depresoreak Pasteur pipetak Pintzak Erregela Inkubagailua Tindatzeko ontziak Eskularruak (soilik tindaketak egiteko) Portak Porta zokodunak Estalkiak Tanta-kontagailua Mikroskopioa Murgiltze-olioa Tindagaiak Kristal-morea Lugola Alkohol-azetona Safranina Metileno-urdina 9

10 Erreaktiboak Oxidasa-erreaktiboa Katalasa-erreaktiboa (ur oxigenatua) Kovacs erreaktiboa Metilo-gorriaren erreaktiboa Voges-Proskauer erreaktiboa Iragazki-paperezko diskoetan jarritako antibiotikoak Hazkuntza-inguruak Müller-Hinton salda duten hodiak Müller-Hinton agardun kutxak MacConkey agardun kutxak Odol-agardun kutxak Manitol gazidun agarreko kutxak DNAsadun agarreko kutxak TSI agardun hodiak Triptofano-saldadun hodiak MR-VP saldadun hodiak Zitrato-agardun kutxak NaCl soluziodun hodiak Sabouraud agardun kutxak Giza plasmadun hodiak Kultura puruak Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus viridans Neisseria (edo Branhamella) sp. Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Proteus mirabilis Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Aspergillus sp. Microsporum sp. Aurretik egindako prestakinak Bakterioen aukerako egiturak: Kapsulak Flagelo peritrikoak Flagelo polarrak Endosporak Onddoak: Aspergillus spp. Microsporum spp. Epidermophyton spp. Trichophyton spp. Protozooak: Entamoeba histolyticaren kisteak Entamoeba histolyticaren trofozoitoak Giardia lambliaren kisteak Giardia lambliaren trofozoitoak Toxoplasmaa gondii Trypanosoma spp. Plasmodium spp. Trematodoak edo duelak: Fasciola hepaticaren arrautza Fasciola hepaticaren larba mirazidioa Fasciola hepaticaren larba errediak esporozistoan Fasciola hepaticaren larba zerkarioa Fasciola hepaticaren har heldua Zestodoak edo teniak: Taenia saginataren proglotideak eta eskolexak Taenia soliumaren proglotideak eta eskolexak Taenia generoaren arrautzak Echinococcus granulosusaren har heldua Echinococcus granulosusaren larba hidatidea Nematodoak: Enterobius vermicularisaren har heldua Enterobius vermicularisaren arrautza Ascaris lumbricoidesaren har helduak Ascaris lumbricoidesaren arrautzak Trichinella spiralisaren har helduak Trichinella spiralisaren larbak Nahasitako giza helmintoen arrautzak 10

11 2. atala. Mikrobiologiako praktiken fitxak 0. FITXA. MIKROBIOLOGIARAKO ESKAERA-ORRIEN ERABILERA 1. FITXA. HAZKUNTZA-INGURUEN PRESTAKUNTZA 2. FITXA. ESTERILIZAZIO-PROBAK 3. FITXA. LAGINAREN EREINTZA 4. FITXA. BAKTERIOEN MUGIKORTASUNAREN BEHAKETA 5. FITXA. BAKTERIOEN TINDAKETAK 6. FITXA. LAGIN OROFARINGEOAREN AZTERKETA MIKROBIOLOGIKOA 7. FITXA. GERNU-LAGINAREN AZTERKETA MIKROBIOLOGIKOA 8. FITXA. KOKO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA 9. FITXA. BAZILO GRAM-NEGATIBO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA 10. FITXA. ANTIBIOGRAMA AGARREAN (BAUER-KIRBY FROGA) 11. FITXA. ONDDO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA 12. FITXA. PROTOZOO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA 13. FITXA. HELMINTO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA FITXA GUZTIEN EMAITZA-ORRIAK 11

12 0. FITXA. MIKROBIOLOGIARAKO ESKAERA-ORRIEN ERABILERA Helburuak: Mikrobiologia-diagnostikoaren funtzioa eta mugak ulertzea. o Datu klinikoetan oinarritutako behin-behineko diagnostikoak planteatzea. o Behin-behineko diagnostikoa berresteko behar diren laginak eta azterketa mikrobiologikoak eskatzea. o Mikrobiologia-laborategiko emaitzen txostena interpretatzea. Materialak Tresnak Mikrobiologia-laborategirako eskaera-orriak Mikrobiologia-laborategian sortutako emaitzen txostenak Kasu klinikoak a) 67 urteko gizon bat ospitaleko larrialdietara heltzen da sukar altua, hotzikarak eta toraxaren eskuinaldean mina dituela. Bezperan, egun osoan, disnea eta eztula izan ditu, eta herdoildu itxurako karkaxak bota ditu. Pazientea erretzaile amorratua da eta diabetesa du. Azken 20 urteetan ez du txertorik hartu. b) 18 urteko mutil bat da pazientea. Ikaskide batzuekin inauteriko oporraldia Jacan igaro ondoren, etxera itzuli, eta 12 orduan sukar oso altua, buruko min handia eta hotzikarak izan ditu. Berehala ospitalera eraman dute, eta heltzean buru-nahasmena du. Bi ordu geroago mutilaren larruazalean odol-isuri txikiak (petekiak) agertu dira. c) Familia bereko 6 kide 2 egunetan zehar agertzen dira ospitaleko Larrialdietarako Zerbitzuan. Kasu guztietan, sukar pixka bat, koliko abdominala, gorakoak eta beherakoa dira sintomak. 24 ordu lehenago batera afaldu dute, eta seiek etxean prestatutako entsaladilla jan. d) 21 urteko neska bat familia-medikuarenera doa, baginan azkura eta jario zuri eta lodia dituela esanez. Sexu-harremanik ez duela izan dio. Sinusitis-prozesu bat sendatzeko antibakterianoak hartu ditu aurreko bi astetan. Prozedura 1. Lau ikaslek, taldean lan eginda, aurreko kasuetatik bat aukeratu, irakurri eta eztabaidatu. 2. Behin-behineko diagnostikoak planteatu, inplikatuta egon daitezkeen mikroorganismo guztiak aipatuz. 3. Diagnostikoak argitzeko mikrobiologiarako eskaera-orri bat bete, hartu beharreko laginak eta egin behar diren azterketa mikrobiologikoak aipatuz, eta irakasleari eman. Irakasleak eskatutako frogen emaitza-txostena taldeari itzuliko dio. 4. Taldekideek emaitza-txostena interpretatuz gaixotasunaren behin betiko diagnostikoa egin. 12

13 13

14 0.1 irudia. Mikrobiologia-laborategirako eskaera-orria eta ohiko azterketa mikrobiologikoak. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 7. gaia: Diagnostiko mikrobiologikoaren oinarriak. Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 7. kapitulua: «Diagnostiko mikrobiologikoa». 14

15 1. FITXA. HAZKUNTZA-INGURUEN PRESTAKUNTZA Helburuak: Bakterio eta onddoak hazteko eta bakartzeko zenbait hazkuntza-inguru prestatzea. o Hazkuntza-inguru minimoak eta aberatsak, likidoak eta solidoak, selektiboak eta bereizgarriak ezberdintzea. Materialak Tresnak Matrazeak Saiodi hutsak Petri kutxa hutsak Imana Probeta Xiringa Esterilizatzeko zinta Berotzeko aparatua Autoklabea Hazkuntza-inguruak Merkatuko hazkuntza-inguruak Prozedura - 1. Merkatuko hazkuntza-inguru bakoitzetik prestatu beharreko kantitatea pisatu eta ur destilatuan nahasi matraze bat erabiliz. Hazkuntza-inguru minimo batek ura, glukosa, nitrogenoa, fosfatoa, sufre eta gatz mineralak ditu. Hazkuntza-faktoreak gehitzen dizkiogunean (bitaminak edo aminoazidoak, esate baterako), hazkuntza-inguru horri inguru aberats deritzo. 2. Matraze horretan imana jarri eta, kotoiarekin tapatu ondoren, irakin berotzeko aparatu batean. 15

16 3A. Salda erako hazkuntza-inguruak saiodietan banatu, bakoitzean dagokion kantitatea jarriz, eta ondoren saiodi bakoitza tapatu. Prestatutako saiodi guztiak gradila batean jarri, aluminiozko paperarekin tapatu guztiak, eta hazkuntza-inguruaren izena idatzi esterilizatzeko zinta batean. 3B. Aldez aurretik irakin duten agarrak aluminiozko paperarekin tapatu, eta esterilizatzeko zinta batean hazkuntza-inguruaren izena idatzi. Azken horiek eta prestatuak dauden saiodiak autoklabean sartu esterilizatzeko. Hazkuntza-inguruei likidoak direnean salda deritze; batzuetan, substantzia gogortzaile bat dute agar-agar deiturikoa, eta, orduan, hazkuntza-inguru solido horiei agar deritze. Saldak saiodietan banatu ondoren esterilizatzen dira; agarrak, aldiz, esterilizatu eta gero Petri kutxetan banatzen dira. 4. Esterilizatuak dauden agarrak Petri kutxetan banatu, metxeroaren inguruan. Solidotzen direnean, hozkailuan gorde ondorengo praktiketan erabili ahal izateko. 1.1 irudia. Ezkerrean, saldak saiodietan banatzen dira; eskuinean, hazkuntza-inguruak prestatzen berotzeko aparatuan. 16

17 1.2 irudia. Ezkerrean, zenbait hazkuntza-inguru solido: odol-agarra, zitrato-agarra, Müller-Hinton agarra eta MacConkey agarra; eskuinean, MacConkey agarra Petri kutxetan banatzen da esterilizatu ondoren. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 3. gaia: «Bakterio patogenoen ezaugarri orokorrak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 8. kapitulua: «Bakterio patogenoen metabolismoa eta hazkundea». 17

18 2. FITXA. ESTERILIZAZIO-PROBAK Helburuak: Mikrobiologia-laborategian lan egiteko teknika aseptikoa ikastea. o Airez hedatzen diren kutsatzaileak ekiditeko metxeroa erabiltzea. o Mikroorganismoak hartzeko eta transferitzeko ereite-uztaia esterilizatzea. o Hazkuntza-inguruak nahitaez esterilizatu behar direla nabarmentzea. o Inguruko eta gure mikrobiotako mikroorganismoen presentziaz jabetzea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Metxeroa Inkubagailua Hazkuntza-inguruak Müller-Hinton agar esterilizatuaren kutxa Müller-Hinton agar esterilizatugabea Petri kutxa Prozedura 37 ºC-an 18 orduz 37 ºC-an 18 orduz 1. Metxeroa piztu ingurune aseptikoa lortzeko. Ereite-uztaia suaren gainetik pasatu gori-gori jarri arte BIDEOA: 1. eta, gero, atera eta suaren alboan itxaron segundo gutxi batzuk edozein lagin hartu aurretik. Ereite-uztaia esterilizatzeko sugarrean sartzen da gori-gori egon arte, eta erabili aurretik,sugarraren ondoan hozten da. 2. Aldez aurretik matrazean prestatu duzun hazkuntza-inguru bat hartu (1. fitxako Müller-Hinton agarra, esate baterako), eta zuzenean Petri kutxan banatu. Solidotu ondoren, 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 3. Müller-Hinton agar esterilizatu batean, listu pixka bat, eskuekin ukitu, ile bat jarri, ur tantak bota edo gure gorputzeko zein inguruko edozein jariakin jarri. Ondoren, 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Mikroorganismoak edonon aurki daitezke. 18

19 Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 8. gaia: «Mikroorganismoen kontrola, esterilizazioa, asepsia eta desinfekzioa». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 4. kapitulua: «Mikroorganismoen kontrola». 19

20 3. FITXA. LAGINAREN EREINTZA Helburuak: Mikroorganismoen laginak hartu eta ereiten ikastea hainbat hazkuntza-ingurutan. o Hazkuntza-inguru likidoan (salda batean) ereintza egin eta haren irakurketa interpretatzea. o Hazkuntza-inguru solidoan (agar batean) bakartzeko ereintza egitea. o Hainbat patogeno hazteko hainbat hazkuntza-ingururen egokitasuna frogatzea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Metxeroa Inkubagailua Hazkuntza-inguruak Müller-Hinton saldadun saiodia Müller-Hinton agardun kutxa MacConkey agardun kutxa Odol-agardun kutxa Kultura puruak Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa eta Bacillus subtilis bakterio-kultura puruak Prozedura 1. Kultura puru batetik lagina hartu ereite-uztaia erabiliz, baldintza aseptikoetan. Hazkuntza-inguru likidoan ereintza egin. Ikus 2 BIDEOA: 2. Horretarako Müller- Hinton salda duen saiodia hartu eta flanbeatu; hau da, tapoia kenduta suaren gainetik muturra pasatu bizpahiru aldiz. Tapoia kentzeko, ereite-uztaiari eusten dion eskuko atzamar txikia erabiliko dugu. Tapoia atzamar horrekin atxikiko dugu; saiodia, aldiz, beste eskuarekin atxikiko dugu. Saiodien muturrak sugarretik pasarazteko metodoa erabiltzen da, aireko mikroorganismoekin hazkuntza-inguruak kutsa ez daitezen 20

21 1A. Lagina duen ereite-uztaia saiodian sartu eta nahasi. 1B. Ereite-uztaia atera eta berriro esterilizatu, eta saiodia berriro flanbeatu. 1C. Saiodia tapoiarekin itxi eta 37 ºC-an 18 orduz inkubatu, eta hurrengo egunean irakurri. 2. Kultura puru beretik lagina hartu berriro, eta hazkuntza-inguru solidoan ereintza egin. Ikus.3. BIDEOA: Erabiliko den agarra Müller-Hinton, odola edo MacConkey izango da. Ikasle bakoitzak bat erabiliko du. Lagina duen ereite-uztaia esku batekin hartu, eta bestearekin agardun kutxa. Aurretik kutxa buruz behera jarrita dago, eta, horrela, kutxaren tapa mahai gainean geratuko da, agarra duen aldea bakarrik eskuan hartuz. Agarrean laginaren deskarga egin. Hau da, mutur batean 4-5 aldiz ereite-uztaiarekin marrak egin (oso hurbil bat bestearengandik). 2A. Ereite-uztaia esterilizatu. Egindako deskarga gurutzatu eta, berriro ukitu gabe, ereite-uztaiarekin marrak egin, sigi-saga, norabide batean. 2B. Ereite-uztaia berriro esterilizatu. Azken sigi-saga gurutzatu eta, berriro ukitu gabe, beste sigi-saga bat egin beste norabide batean. Deskarga egitea lagina agar kutxaren alde batean jartzea da 2C. Ondoren, agardun kutxa 37 ºC-an 18 orduz inkubatu, hazkuntza gerta dadin eta hurrengo egunean kultura hori interpretatu. Sigi-saga horien bidez mikroorganismo mota bakoitza bakartzea lortzen dugu. Mikroorganismoen koloniak gero eta banatuago agertuko dira sigi-sagan zehar. 3.1 irudia. Ereite-uztaia erabiliz, odol-agarrean ereintza egiten. 21

22 3.2 irudia. Ezkerrean, saldan dauden bi hazkuntza mota: bata, mikroorganismo anaerobio fakultatibo batena, eta bestea, mikroorganismo anaerobioa batena; eskuinean, MacConkey agarrean hazi den bakterioa. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 3. gaia: «Bakterio patogenoen ezaugarri orokorrak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 8. kapitulua: «Bakterio patogenoen metabolismoa eta hazkundea». 22

23 4. FITXA. BAKTERIOEN MUGIKORTASUNAREN BEHAKETA Helburuak: Bakterio bizien mugikortasuna freskoan aztertzea, tanta eseki deituriko frogaren bidez. o Flagelo motaren araberako mugitzeko moduak bereiztea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Pasteur pipeta Porta zokoduna Estalkia Mikroskopioa Murgiltze-olioa Hazkuntza-inguruak Müller-Hinton saldadun saiodia Kultura puruak Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Prozedura 1. Ereite-uztaia metxeroaren gainean esterilizatu ondoren, kultura puru batetik lagina hartu behar da, eta Müller-Hinton saldan nahasi teknika aseptikoak erabiliz (ikus 3. fitxa). Hurrengo egunean hazkuntza gertatu dela ziurtatu ondoren, prozedura hau egin. Mugikortasuna aztertzeko tanta eseki bat prestatu (ikus 4.BIDEOA: ). 2. Ereite-uztaiarekin hazitako saldatik tanta bat hartu. 3. Tanta estalki baten erdian jarri. 4. Horri guztiari buelta eman, eta porta zokodun batean ipini, tanta esekia jarriz. Tanta eseki deituriko teknikak bakterioak nola mugitzen diren ikustea ahalbidetzen digu, inolako tindagairik erabili gabe. 23

24 5. Mikroskopioan behatu, diafragman argi gutxi jarrita. Lehenengo, x10eko objektiboa erabiliz; ondoren x40koa, eta, azkenik, x100eko murgiltze-objektiboa erabiliz, olioa gehiturik. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 3. gaia: «Bakterio patogenoen ezaugarri orokorrak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 8. kapitulua: «Bakterio patogenoen metabolismoa eta hazkundea». 24

25 5. FITXA. BAKTERIOEN TINDAKETAK Helburuak: Mikroorganismoak behatzeko erabiltzen diren tindaketa batzuk egitea eta interpretatzea. o Gram tindaketa bereizgarria egitea eta interpretatzea. o Metileno-urdinarekin tindaketa sinplea egitea eta interpretatzea. o Tindaketaren bidez bakterioen aukerako egitura batzuk bereiztea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Metxeroa Portak Tindatzeko ontzia Eskularruak (soilik tindaketak egiteko) Mikroskopioa Murgiltze-olioa Tindagaiak Kristal-morea Lugola Alkohol-azetona Safranina Metileno-urdina Kultura puruak Bakterio patogenoen kultura puruak (Pseudomonas, Escherichia, Staphylococcus,...) Aurretik egindako prestakinak Bakterioen aukerako egiturak: Kapsulak Flagelo peritrikoak Flagelo polarrak Endosporak Prozedura 25

26 o Lehenengo helburua: Gram tindaketa bereizgarria egitea eta interpretatzea. 1. Teknika aseptikoa erabiliz, bakterio-kultura puru batetik kolonia bakartu bat hartu, eta ur tanta txikia duen porta baten gainean jarri. Beste bakterio-kultura puru bat hartu, eta, berriro ereite-uztaiarekin lagina hartu ondoren, lehenengoaren gainean jarri. Horrela bi bakterio mota izango dituzu. 2. Ur tanta horrekin lagina ondo nahasi eta zabaldu. 3. Lehortzen utzi metxeroaren inguruan. 4. Lehortu ondoren, portari buelta eman eta, lagina buruz behera jarri ondoren, bizpahiru aldiz suaren gainetik mugitu. Pauso hori oso arin egin behar da, lagina ez kiskaltzeko. Lagina portan finkatzea ezinbestekoa da tindaketak ondo egiteko. 5. Porta tindatzeko ontzian jarri, eta Gram tindaketa egiten hasi. Lehenengo kristal-morearekin tindatu minutu batez. Tindagai kationiko hori oso ondo lotzen zaio bakterioen egituran dagoen peptidoglikano-geruzari, zeinak karga negatiboa baitu, eta, horrela, urrats honetan bakterio guztiak morez tindatzen dira. 6. Bigarren urratsean, lugol-soluzioa gehitu portari eta minutu bat itxaron. Urrats honetan, bakterioek indar handiagoz bereganatzen dute kolore morea, iodo-soluzioari esker. 7. Porta urarekin garbitu eta sobran dagoena ontzira bota (dekantatu). 8. Ondoren, alkohol-azetonaren soluzioarekin koloregabetu minutu batez. Peptidoglikano-geruza lodia duten bakterioek kolore morea mantentzen dute, zeren eta, alkoholak deshidratatzen dituenez, hormako poroak itxi egiten baititu; peptidoglikano-geruza mehea dutenak, aldiz, koloregabetu egiten dira alkohol-azetona gehitzean, alkoholak kristal-morea berehala kentzen duelako. 9. Porta urarekin garbitu eta sobran dagoena ontzira bota (dekantatu). 10. Safranina tindagaia gehitu eta minutu bat itxaron. Kolorea galdu duten bakterioek safranina tindagaiaren kolore gorri-arrosa 11. Porta urarekin garbitu. bereganatuko dute. 12. Ondoren, porta paper baten gainean lehortu, behatu ahal izateko. 13. Bakterio-prestakin lehor horri mikroskopioan behatu, lehenengo x10eko objektiboa erabiliz, ondoren x40koa, eta, azkenik, x100eko murgiltze-objektiboa erabiliz, olioa gehiturik. Gram-tindaketa bereizgarrian, bakterio gram-positiboak more ikusten dira, eta, aldiz, gram-negatiboak, gorri. 26

27 5.1 irudia. Ezkerrean, zabalpena egiten porta baten gainean; eskuinean, portari kristal-more tindagaia gehitzen tindatzeko ontzian. 5.2 irudia. Gram tindaketa ondoren mikroskopioan ikusten diren prestakinak: ezkerrean, bazilo gram-negatiboak, eta, eskuinean, koko gram-positiboak. o Bigarren helburua: Metileno-urdinarekin tindaketa sinplea egitea eta interpretatzea. 1. Teknika aseptikoa erabiliz, bakterio-kultura puru batetik kolonia bakartu bat hartu, eta ur tanta txikia duen porta baten gainean jarri. Beste bakterio-kultura puru bat hartu, eta, berriro ereite-uztaiarekin lagina hartu ondoren, lehenengoaren gainean jarri. Horrela, bi bakterio mota lortuko dituzu. 2. Ur tanta horrekin lagina ondo nahasi eta zabalpena egin. 3. Lehortzen utzi metxeroaren inguruan. 4. Lehortu ondoren, portari buelta eman, eta, lagina buruz behera jarri ondoren, bizpahiru aldiz suaren gainetik mugitu. Pauso hori oso arin egin behar da, lagina ez kiskaltzeko. 5. Porta tindatzeko ontzian jarri, eta metileno-urdin tindagaia gehitu bi minutuz. Metileno-urdina ere tindagai kationikoa da, eta, horregatik, bakterioen hormari oso ondo lotzen zaio. 6. Ondoren, portari ura gehitu garbitzeko, eta paperean lehortu. 27

28 7. Bakterio-prestakin lehor horri mikroskopioan behatu, lehenengo x10eko objektiboa erabiliz, ondoren x40koa eta, azkenik, x100eko murgiltze-objektiboa erabiliz, olioa gehiturik. Metileno-urdina tindaketa sinplean, bakterio guztiak urdinez ikusten dira, baina askotariko formak izan ditzakete. o Hirugarren helburua: Bakterioen aukerako egitura batzuk bereiztea. 1. Bakterioen flageloak proteinazko luzakin handiak dira, eta kopurua eta kokapena alda daitezke espeziearen arabera. Mikroskopioan dauden prestakinetan flagelo polarrak eta peritrikoak ikusi eta bereizi. 2. Bakterio batzuek horma zelularraren gainetik geruza polisakarido lodi eta zurruna dute, kapsula alegia. Mikroskopioan dagoen prestakinean kapsulak bereizi. 3. Bakterio batzuek erresistentzia-egiturak sortzen dituzte, endospora izenekoak. Gram tindaketa egitean, endosporak ez dira tindatzen, nahiz eta bakterioa tindatu. Mikroskopioan dagoen prestakinean endosporak identifikatu. 5.3 irudia. Ezkerrean, endosporak bazilo gram-positiboen barruan; eskuinean, bakterioen kapsulak nabarmentzeko tindaketa negatiboa. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 2. gaia: «Mikroorganismoen sailkapena». o 3. gaia: «Bakterio patogenoen ezaugarri orokorrak». o 12. gaia: «Bazilo gram-positiboak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 7. kapitulua: «Bakterio patogenoen egitura». o 14. kapitulua: «Bazilo gram-positiboak». 28

29 6. FITXA. LAGIN OROFARINGEOAREN AZTERKETA MIKROBIOLOGIKOA Helburuak: Orofaringeko lagin bateko estreptokoko patogenoak identifikatzea. o Orofaringeko lagina tindatzea. o Laginetik koloniak bakartzea. o Estreptokoko-kultura puru bat lortzea. o Kultura purua identifikatzea (8. fitxa) Materialak Tresnak Ereite-uztaia Torunda esterila Mihia zapaltzeko depresorea Inkubagailua Portak Tindatzeko ontziak Eskularruak (soilik tindaketak egiteko) Tindagaiak Kristal-morea Lugola Alkohol-azetona Safranina Hazkuntza-inguruak Odol-agarra duten bi kutxa Prozedura Lagin orofaringeoa bildu Odol-agarrean lagina utzi 1. Ikasle bakoitzak ikaskidearen orofaringeko lagina hartu, mihia depresorearekin zapalduz eta torunda esterila erabiliz. 5. BIDEOA: 2A. Odol-agarra duen kutxaren ertz batean torunda igurtzi (laginaren deskarga). 2B. Torundan geratzen den lagina porta garbi baten gainean zabaldu. 3A. Lagineko bakterioak bakartzeko, ereite-uztai esterila erabiliz, inokuluaren deskarga gurutzatu eta zabaldu, agarraren gainetik marrak eginez kutxa erdia bete arte. Uztaia esterilizatu. 4A. Aurretik eginiko marrak behin bakarrik gurutzatuz zeharkako norabidean marrak egin, kutxa bete arte. Uztaia esterilizatu. Odol-agarra duen kutxa 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 29

30 3B. Portako lagina sugarraren erditik bi aldiz pasatuz finkatu. 4B. Prestakina tindatzeko ontzira eraman eta Gram tindaketa egin. 37 ºC-an Laginaren tindaketa. Ostalariaren zelula eukariotoen gainean, barruan edo zelulen artean hainbat itxura eta koloretako bakterioak ikusten dira: koko eta bazilo gram-positiboak eta gram-negatiboak; difteroideak, eta batzuetan legamiak. Laginaren tindaketa zuzenaren irakurketa. Mikrobiota ugari duten laginen kasuan, orofaringean gertatzen den bezala, laginaren tindaketa zuzenak ez du informazio handirik ematen diagnostikorako. Hala eta guztiz ere, laginean bakterio mota bakar baten kopurua handia izatea infekzioaren seinale izan daiteke. Lagin kliniko batzuen tindaketa zuzenak diagnostikoa bideratzeko baliagarriak dira, batez ere esterilak izan ohi diren lekuetatik hartutakoak (odola, likido zerebroespinala). 30

31 6.1 irudia. Laginaren tindaketa zuzena: jariakin genitaletako laginaren tindaketa (diplokoko gramnegatiboak ikusten dira); lagin orofaringeoaren tindaketa zuzena. Estreptokokoen koloniak bakartzeko ereintzaren irakurketa. Inokuluaren deskargaren aldean bakterioen hazkuntza etengabea eta nahasia izango da. Lagina zabaldu ahala bakterio koloniak bereiziko dira; bakoitza bakterio zelula bakar batetik sortutako populazio homogeneo bat da. Hainbat tamaina eta itxuratako koloniak agertu ohi dira odol-agarraren gainean. Estreptokoko patogenoek kanporatutako hemolisinek agarrean dauden eritrozito guztiak suntsitzen dituzte (beta hemolisia) edo, gutxienez, kalte egiten diete (alfa hemolisia). Ondorioz, estreptokoko beta-hemolitikoen inguruan agarra garden geratzen da, eta alfa-hemolitikoen inguruan berdetuta. Patogenoak ez diren estreptokoko espezieek ez dute hemolisirik egiten odolagarrean. 6.2 irudia. Orofaringeko laginaren bakartzeko ereintza odol-agarrean. Kolonia beta-hemolitikoak. Kolonia alfa-hemolitikoak. Estreptokokoen koloniak oso txikiak dira, kolore gabekoak eta distiratsuak; ur tanta txikiak ematen dute. Giza patogenoak direnak odolagarrean bereizten dira, hemolitikoak direlako. Beraz, ikasleak beta-hemolitikoa edo alfa-hemolitikoa den estreptokoko itxura duen kolonia bat aukeratuko du, kultura purua egiteko. 5A. Ereite-uztai esterila erabiliz, estreptokoko itxura duen kolonia bat hartu, eta odol-agarra duen beste kutxa baten ertzean inokulua utzi. 31

32 6A. Ereite-uztai esterila erabiliz, inokuluaren deskarga gurutzatu eta zabaldu, agarraren gainetik marrak eginez kutxaren erdia bete arte. Uztaia esterilizatu. 7A. Aurretik eginiko marrak behin bakarrik gurutzatuz zeharkako norabidean marrak egin, kutxa bete arte. Uztaia esterilizatu. Odol-agar kutxa hori 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Kultura puruaren hazkuntza osoa itxura berekoa da: kolonia orok berdinak izan behar ditu tamaina, kolorea, hemolisi mota eta beste ezaugarri makroskopiko guztiak. Estreptokoko-kultura puruaren irakurketa. Ikasleak aukeratutako koloniaren antzeko ezaugarriak dituen hazkuntza uniforme batek agertu behar du. Hainbat itxuratako koloniak agertuz gero, ikasleak bakartzeko ereintza errepikatuko du, kultura purua lortu arte. 6.3 irudia. Estreptokoko beta-hemolitiko baten kultura purua. Diagnostiko bakteriologikoaren teknika klasikoek kultura purua behar dute, ondorengo bereizketa biokimikoak baliagarriak izateko. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 7. gaia: «Diagnostiko mikrobiologikoaren oinarriak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 7. kapitulua: «Diagnostiko mikrobiologikoa». 32

33 7. FITXA. GERNU-LAGINAREN AZTERKETA MIKROBIOLOGIKOA Helburuak: Gernu-infekzioaren diagnostiko mikrobiologikoa egitea. o Gernuko bakterioen kontzentrazioa neurtzea, eta horren arabera infekziorik dagoen erabakitzea. o Laginetik koloniak bakartzea. o Gernu-infekzioa eragiten duen bakterioa identifikatzea (9. eta 10. fitxan). Materialak Tresnak Ereite-uztaia 1 µl-ko ereite-uztaia 10 µl-ko ereite-uztaia Inkubagailua Hazkuntza-inguruak Müller-Hinton agardun bi kutxa MacConkey agardun kutxa bat Odol-agardun kutxa bat Prozedura Gernu-laginaren ereintza. Ikus 6. BIDEOA: A. 1µl-ko ereite-uztai bat gernu-laginean sartu, gernu tanta bat hartu, eta Müller-Hinton agarraren gainetik goitik behera pasatu. 2A. Kutxa mahai gainean utzi, 90º biratu, eta gero berriro eskuan hartu. Gero, egindako ereite-marra behin eta berriz gurutzatuz, marra oso estuak egin kutxaren alde batetik besteraino. 3A. Kutxa mahai gainean utzi, 90º biratu, eta, gero, berriro eskuan hartu. Ostera ere, aurretik egindako ereite-marrak behin eta berriz gurutzatuz marra oso estuak egin (aurrekoekiko zutak). 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 33

34 7.1 irudia. 10 µl-ko ereite-uztaiarekin gernu-laginak hartzen. 1B. 10µl-ko ereite-uztai bat gernuaren lagin berean sartu, eta hartutako gernu tanta Müller-Hinton agarra duen beste kutxa baten gainetik pasatu goitik behera. 2B. Kutxa mahai gainean utzi, 90º biratu, eta, gero, berriro eskuan hartu. Gero, egindako ereite-marrak behin eta berriz gurutzatuz marra oso estuak egin kutxaren alde batetik besteraino. 3B. Kutxa mahai gainean utzi, 90º biratu, eta, gero, berriro eskuan hartu. Ostera ere, aurretik egindako ereite-marrak behin eta berriz gurutzatuz marra oso estuak egin (aurrekoekiko zutak). 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Gernu-infekzioaren irizpideak. Gernuaren lagina 10 3 bakterio/ml baino gutxiago duenean negatiboa dela esaten da (ez dago infekziorik) bakterio/ml baino gehiago duten laginak positiboak dira (infekzioa dute), eta tarteko balioak datu klinikoen arabera interpretatzen dira. Zalantzazko kasuetan lagin berriak eskatzen eta prozesatzen dira. Gernu-laginaren ereintzaren irakurketa. Kutxa bateko koloniak zenbatzea. Horretarako, lehenengo, zenbatzeko kutxarik egokiena aukeratu ( kolonia dituztenak), eta, erabilitako inokulua kontuan harturik, gernuaren lagineko bakterio kopurua mililitroko kalkulatu: Adibidez, 87 kolonia 10 µl-ko inokuluan.87 x 100 = bakterio/ml gernuan. 34

35 7.2 irudia. Kolonien zenbaketarako 1µl eta 10 µl gernurekin ereindako Müller-Hinton agar kutxak. 4. Infektatuta dauden laginen kasuetan soilik, infekzioaren eragilea identifikatzeko, Müller-Hinton kutxatik ereite-uztaiarekin kolonia bana transferitzen dira MacConkey agarra duen kutxa batera eta odola duen beste kutxa batera, bakartzeko ereintza erabiliz (3. fitxa). Kutxak 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Gernu-infekzioen ohiko eragileak Escherichia coli edo beste bazilo gram-negatibo batzuk izaten dira, baina estafilokokoek eta enterokokoek ere eragiten dituzte hainbat gernu-infekzio; patogeno horiek ez galtzeko odol-agarrean ereiten dira laginak. 5. Infekzioaren eragilea bi kutxatan hazten bada, MacConkey agarretik kolonia bat hartu, eta 9. fitxaren prozedurari jarraitu, bazilo gram-negatibo patogenoa identifikatzeko. Infekzioaren eragilea soilik odol-agarrean hazten bada, hortik kolonia bat hartu, eta 8. fitxaren prozedurari jarraitu, koko patogenoa identifikatzeko. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 7. gaia: «Diagnostiko mikrobiologikoaren oinarriak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 6. kapitulua: «Diagnostiko mikrobiologikoa». 35

36 8. FITXA. KOKO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA Helburuak: Koko itxura duten bakterio patogeno garrantzitsuenak bereiztea. o Staphylococcus, Streptococcus eta Neisseria generoak identifikatzea. o Estafilokoko eta estreptokoko espezie patogenoak identifikatzea: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Inkubagailua Porta Tindatzeko ontziak Eskularruak (soilik tindaketak egiteko) Tindagaiak Kristal-morea Lugola Alkohol-azetona Safranina Erreaktiboak Oxidasa-erreaktiboa Katalasa-erreaktiboa (ur oxigenatua) Hazkuntza-inguruak Odol-agardun kutxak Manitol gazidun agarreko kutxak DNAsadun agarreko kutxak Kultura puruak Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus viridans Neisseria (edo Branhamella) sp. Ikasleak orofaringetik bakartutako kultura purua Prozedura 36

37 1. Teknika aseptikoa erabiliz kultura puru bakoitzetik lagin bat hartu, eta Gram tindaketa egin. 2.A. Gram tindaketaren irakurketa: koko gram-negatiboak (arrosak) ikusiz gero, oxidasa-froga egin. Horretarako, koko gram-negatiboen kultura puru guztietatik beste lagin bat hartu, eta oxidasa-erreaktiboa duen paper batean igurtzi (laginak hartzeko teknika aseptikoa erabili behar da beti). Ikus 7. BIDEOA: 7. Oxidasa-frogak oxidasa entzimaren edo C zitokromoaren presentzia hautematen du: p-fenilendiamina erabiltzen da erreaktibo gisa, bakterioen oxidasa entzimarekin berehala oxidatzen delako eta indofenol bihurtu (urdina da). Oxidasa-frogaren irakurketa: papera berehala urdin jartzean positiboa da (bakterioek oxidasa entzima dute). 2.B. Gram tindaketaren irakurketa: koko gram-positiboak (moreak) ikusiz gero, katalasa-froga egin. Horretarako, koko gram-positiboen kultura puru guztietatik beste lagin bat hartu, porta garbi batean zabaldu, eta gainetik ur oxigenatu tanta bat bota. Ikus 8. BIDEOA: Katalasa-frogak «katalasa» edo ur-peroxidasa entzimaren presentzia nabarmentzen du. Entzima horrekin ur-peroxidoa ur eta oxigeno bilakatzen da. 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (burbuilak) Katalasa-frogaren irakurketa: berehala oxigenozko burbuilak ateratzen badira, positiboa da (bakterioek katalasa entzima dute). Lagin klinikoetako koko gram-positibo katalasa-positiboak Staphylococcus generokoak izan ohi dira, eta koko gram-positibo katalasa-negatiboak Streptococcus generokoak. 37

38 8.1 irudia. Ezkerrean koko gram-positiboak eta katalasa-froga positiboa; eskuinean koko gram-negatiboak eta oxidasa-froga positiboa. HEMOLISIA ALFA ANTIBIOTIKOEKIKO SENTIKORTASUNA BETA Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus viridans 3.A. Streptococcus pyogenes eta Streptococcus pneumoniae espezie patogenoak bereizteko odol-agarrean hemolisia eta antibiotikoekiko sentikortasuna aztertu. Horretarako, koko gram-positibo katalasa-negatiboen kultura puruak odol-agarrez beteriko kutxa batean erein, marra oso estuak eginez, eta, ereintzaren gainean bazitrazina-diskoa eta optokina-diskoa jarri ondoren, 37 ºC-an 18 orduz inkubatu CO 2 asko duen atmosfera batean (kandela-ontzian). 38

39 Hemolisia aztertzeko odol-agarra erabiltzen da. Hazkuntza-inguru hori eratzeko, agar elikagarriari, ia hotz dagoenean, odola gehitzen zaio, eritrozitoak oso-osorik gordetzeko. Bakterioek hemolisinak kanporatzen dituztenean, inguruko zelulei kalte egin edo guztiz suntsitzen dituzte, eta agarraren gorritasuna galtzen da. Hemolisiaren irakurketa. Bakterio batzuen hazkuntzak guztiz apurtzen ditu odol-agarraren eritrozitoak, hemolisina oso ahaltsuak kanporatzen dituztelako (beta-hemolisinak), eta ereintza dagoen inguruan agarra garden geratzen da. Hori da beta hemolisia edo hemolisi osoa. Beste bakterioek kanporatutako hemolisinek eritrozitoei kalte egiten diete, eta barruko pigmentuak oxidatzen dira. Ereintzaren ingurua berdetu egiten da, baina ez da guztiz gardena. Hori da alfa hemolisia edo hemolisi ez-osoa. Antibiotikoekiko sentikortasuna. Sarritan antibiotikoak erabiltzen dira diagnostikoa egiteko. Bakterioen ereintzaren gainean (inkubatu baino lehen) espezie patogenoaren hazkuntza inhibi dezakeen antibiotiko bat duen disko bat jarriz beste espezieetatik bereiziko da. Diskoaren inguruan hazkuntzaren inhibiziogunea nabarituko da inkubatu ostean. Estreptokoko patogenoen espezieak bereizteko bazitrazina eta optokina (etilhidrokupreina) bakterioen kontrako substantziak erabiltzen dira. Antibiotikoekiko sentikortasunaren irakurketa. Antibiotiko-diskoaren inguruan bakterioak ez dira hazten sentikorrak direnean, eta hazkuntzaren inhibiziogunea nabarmentzen da. Orduan esaten da kultura purua antibiotiko horrekiko sentikorra dela. Streptococcus pyogenes beta-hemolitikoa da, eta bazitrazinarekiko sentikorra. Streptococcus pneumoniae eta beste estreptokoko asko alfa-hemolitikoak dira; baina Streptococcus pneumoniae, ahoko mikrobioetako estreptokokoak ez bezala, optokinarekiko sentikorra da. 39

40 8.2 irudia. Odol-agarrean estreptokoko-kultura puruak: goian Streptococcus pyogenes, behean ezkerrean, Streptococcus pneumoniae eta eskuinean Streptococcus viridans (ahoko mikrobioak). 3.B. Staphylococcus aureus espezie patogenoa bereizi. Hori lortzeko koagulasa entzimaren presentzia nabarmendu ohi da. Guk, ordea, estafilokokoen manitola hartzitzeko gaitasuna eta DNAsa entzimaren presentzia nabarmenduko ditugu. Horretarako, Staphylococcus-kultura puru guztiak manitol gazidun agarra duen kutxa batean erein, marrak eginez; DNAsadun agarra duen kutxa batean inokulua zabaldu barik erein, eta 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Manitolaren hartzidura aztertzeko manitol gazidun agarra erabiltzen da. Inguru horren karbono-iturria manitola da. Inguruak ph-aren adierazle bat dauka; adierazlea gorria da ph neutroan, eta horitu egiten da, ingurua azidotzen bada. 40

41 Manitol gazidun agarraren irakurketa. Staphylococcus generoko bakterioak soilik haziko dira agar horretan, gatz-kontzentrazioa dela eta. Manitola hartzitzen duten bakterioek inguruaren kolorea horitzen dute (manitol positiboa), hartziduraren produktu azidoengatik. Manitola hartzitzen ez dutenek, aldiz, ez dute inguruaren kolorea aldatzen (manitola negatiboa). DNAsa entzimaren presentzia ikertzeko, DNAsadun agarra erabiltzen da. Inguru horrek DNA dauka, baita ph-aren adierazle bat ere; adierazlea urdina da ph neutroan, eta arrosa bihurtzen da ph basikoan. DNAsadun agarraren irakurketa. DNAsa entzima kanporatzen duten bakterioek agarrean dauden azido nukleikoak suntsitzen dituzte. Ondorioz, baseak agertzen dira, eta inguruko ph-a jaisten da; ph-aren adierazlea arrosa bihurtzen da ereite-puntuaren inguruan (DNAsa positiboa). DNAsa ez dutenak kolore-aldaketarik gabe hazten dira (DNAsa negatiboa). Beste estafilokoko espezieak ez bezala, Staphylococcus aureus espezieak manitola hartzitzen du. Staphylococcus aureus espezieak DNAsa entzima kanporatzen du. 8.3 irudia. Ezkerrean, manitolaren hartzidura positiboa (Staphylococcus aureus), eta, eskuinean, manitolaren hartzidura negatiboa. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 11. gaia: «Koko gram-positiboak». o 13. gaia: «Koko gram-negatiboak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 12. kapitulua: «Staphylococcus generoa». o 13. kapitulua: «Streptococcus eta Enterococcus generoak». o 15. kapitulua: «Neisseria generoa». 41

42 9. FITXA. BAZILO GRAM-NEGATIBO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA Helburuak: Bazilo gram-negatiboak diren bakterio patogeno batzuk bereiztea. o Enterobacteriaceae familiako baziloak eta bazilo ez-hartzitzaileak bereiztea. o Enterobakterioen hainbat genero identifikatzea: Escherichia, Proteus, Morganella, Citrobacter eta Klebsiella. o Pseudomonas aeruginosa identifikatzea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Ereite-orratza Inkubagailua Tanta-kontagailua Tindagaiak Kristal-morea Lugola Alkohol-azetona Safranina Erreaktiboak Oxidasa-erreaktiboa Kovacs erreaktiboa Metilo-gorriaren erreaktiboa Voges erreaktiboa Hazkuntza-inguruak (kultura bakoitzeko) TSI agardun saiodi bat Triptofano saldadun saiodi bat MR-VP saldadun saiodi bat Müller-Hinton agardun kutxa bat Zitrato-agardun kutxa bat Kultura puruak Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Proteus mirabilis Morganella morganii Pseudomonas aeruginosa Gernu-laginetik bakartutako kultura purua Prozedura 42

43 Prozedura hasi aurretik kultura purua bazilo gram-negatiboa dela egiaztatzeko Gram tindaketa egin (5. fitxa). 1. MacConkey agarrean kultura puruaren kolonien itxura makroskopikoari behatu. MacConkey agarrak substantzia toxiko nahikoak ditu (behazun-gatzak eta kristal-morea) bakterio grampositiboen hazkuntza inhibitzeko. Horretaz gain, laktosa eta ph-aren adierazle bat (gorri neutroa) dauzka. MacConkey agarraren irakurketa. Agar horretan bakterio gram-negatiboak baino ez dira hazten. Horietatik laktosa hartzitzen dutenek azidoa sortzen dute, eta, ondorioz, kolonia arrosak eratzen dituzte (ph-aren adierazlearen biraketagatik). Laktosa hartzitzen ez duten bakterioen koloniak kolorerik gabe agertzen dira MacConkey agarrean. 9.1 irudia. MacConkey agarrean laktosa hartzitzen duen bazilo gram-negatibo baten hazkuntza. MacConkey agarra hazkuntza-inguru selektibo eta, aldi berean, bereizgarria da. Bazilo gramnegatiboak bakartzeko eta enterobakterioen artean laktosa hartzitzen dutenak bereizteko erabiltzen da. 2. Ereite-orratz esterila erabiliz, MacConkey agarrean dagoen kultura purutik kolonia bat hartu eta TSI agarrean erein. Ikus 9. BIDEOA: Horretarako, eskuineko atzamar txikiarekin saiodiaren tapoiari helduz, saiodia ireki eta orratza sartu agarraren hondoraino. Orratza ateratzean agarraren malda gainean marrak egin alde batetik bestera. Orratza atera, saiodia itxi, eta orratza esterilizatu. TSI agarraren hodia 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. TSI agarra. Agarra izan arren, saiodi batean sartzen da; nahita okertzen da, bi bizileku bereizteko, bata anaerobioa (agarraren hondoa) eta bestea aerobioa (agarraren malda). Energia-iturri gisa glukosa gutxi (1 gramo/litro) eta laktosa eta sakarosa asko (10 gr/litro) dauzka. ph-aren adierazle moduan fenol gorria du; adierazlea, ph-a neutroa denean, gorria da, eta, ph-a azidoa denean, horitu egiten da. Inguruan ere burdina dago sulfato ferroso moduan, sulfhidrikoaren ekoizpena hautemateko. TSI agarraren irakurketa: o Glukosaren hartzidura: TSI saiodiaren hondoa horia (beltza dagoenean ere positiboa da). o Laktosaren hartzidura: TSI saiodiaren malda horia. o Gasaren sorrera hartziduran: TSI saiodiaren hondoan burbuilak, pitzadurak edo desplazamenduak. 43

44 o SH 2 -aren ekoizpena: TSI saiodiaren edozein lekutan, baina bereziki orratzaren aztarnaren inguruan kolore beltza agertzea. Froga batzuk TSI agarrean irakurtzen dira. Beti hasten da glukosaren hartzidura irakurtzen, bazilo ez-hartzitzaileak eta Enterobacteriaceae familiako baziloak bereizteko. Azken horien generoak bereizteko informazio gehiago ematen du: laktosaren hartzidura, gasaren sorrera eta SH 2 -aren ekoizpena. Hodiaren maldan bakterio hartzitzaileak eta ez-hartzitzaileak haziko dira; azken horiek ez dute aldatuko hazkuntzaren inguruaren kolorea. o Hodiaren hondoan soilik azukreak hartzitzeko gai diren bakterioak haziko dira (enterobakterioak), eta hartzidurako produktu azidoek hazkuntza-ingurua horitu egingo dute. Glukosa soilik hartzitzen dutenek azido gutxi sortuko dute (substratu gutxi dutelako). Kasu horretan, hodiaren malda gorria da, proteinen metabolismo aerobikoan agertutako amina basikoak inguruaren azidotasuna neutralizatzeko gai direlako. 9.2 irudia. Hainbat bazilo gram-negatiboren kulturak TSI agarrean. o o o Laktosa ere hartzitzen duten espezieek askoz azido gehiago sortuko dute (substratu gehiago dutelako). Horrelako kasuetan aminen efektua ez da nahikoa inguruaren malda neutralizatzeko; beraz, hodiaren malda ere horiturik agertuko da. Hainbat hartzidura-bidetan gasa sortzen da, eta agarraren hondoan gatibu geratzen da; hala, burbuilak, agarraren desplazamenduak edo pitzadurak sortzen ditu. Enterobakterio batzuek zisteina aminoazidoaren metabolismoan SH 2 ekoizten dute. Produktu horrek inguruaren sulfato ferrosoarekin erreakzionatzen du, eta sulfuro ferroso beltza sortzen du. 3. Enterobakterio generoak guztiz bereizteko, IMViC frogak egin beharko dira: indola, metilo-gorria, Voges-Proskauer eta zitratoa. Horretarako TSI agarraren hazkuntzatik inokulua hartu, edo zuzenean MacConkey agarraren kultura purutik ereite-uztai esterila erabiliz: 44

45 37 ºC-an 3A. Zitrato-agar kutxa batean erein, alde batetik bestera marrak eginez. Kutxa 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 3B. Triptofano salda-hodi bat erein, eta 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 3C. MR-VP salda-hodi bat erein, eta 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Zitrato-agarrak karbono-iturri gisa zitratoa baino ez dauka, eta oso espezie gutxi dira zitratoa jateko gai. Irakurketa errazteko ph-aren adierazle bat du (bromotimol-urdina), berde kolorekoa ph neutroan eta urdina ph basikoan. 45

46 4 A. Zitrato-agarraren irakurketa. Inguru horretan hazkuntza dagoenean froga positiboa da. Horrek adierazten du bakartutako bakterioak zitratoa erabil dezakeela karbono-iturri moduan. Eskuarki, hazkuntzak produktu basikoak sortzen ditu, eta agarra urdin bihurtzen da. Indolaren ekoizpena. Indola triptofano aminoazidoaren degradazioaren produktu bat da. Triptofanasa entzima duten espezieek indola sortzen dute (Escherichia colik, adibidez), eta triptofanasa ez dutenek ez dute indolik sortzen (Klebsiellak, adibidez). 4 B. Indolaren ekoizpenaren irakurketa. Kovacs erreaktiboaren 5 tanta hazitako triptofano-saldari gehitu. Kovacs erreaktiboak p-dimetilaminobezaldehidoa dauka; horrek indol alkoholarekin erreakzionatzen du, eta produktu gorri bat sortzen da. Froga positiboa denean, berehala eraztun gorri bat eratuko da saldaren gainean. 4C. MR-VP salda inkubatu ondoren, bi saioditan banatu. Bati metilo-gorriaren erreaktiboaren 5 tanta eta besteari Voges erreaktiboa (% 5 α-naftola 0,6 ml eta % 40 KOH 0,2 ml) bota, eta eskuekin 5-10 minutuz astindu, ondo oxigenatzeko. Metilo-gorria. Inguruaren ph-ak 4,4 baino azidoagoa izan behar du, ph-aren adierazle hori gorri bihurtzeko. Beraz, metilo-gorriaren froga positiboak adierazten du azukreak hartzitzeko bidea azido mistoa izan dela (bide horretan laktiko, formiko eta beste azido indartsu asko sortzen dira). Metilo-gorriaren frogaren irakurketa. Froga positiboa denean berehala salda guztia gorrituko da. Voges-Proskauer. Froga horrek azetoinaren presentzia nabarmentzen du hazkuntza-inguruan. Azetoina pirubatoa hartzitzeko bide baten produktua da (butilen glikolikoaren bidekoa, hain zuzen), eta substantzia neutroa da. Eskuarki, Voges froga positiboa duten bakterioek metileno gorriaren froga negatiboa dute, eta alderantziz. Voges-Proskauer frogaren irakurketa. Azetoina, oxidatzen denean, KOH-arekin diazetilo gorri bihurtzen da. Beraz, froga positiboa denean, salda gorri bihurtzen da. 5. Bazilo gram-negatiboen kultura puruak identifikatu taularen gakoen arabera. 46

47 9.3 irudia. INViC frogak: goian, indol negatiboa eta positiboa, eta zitrato positiboa; behean, metilogorri negatiboa eta positiboa, eta Voges-Proskauer negatiboa eta positiboa. 47

48 37 ºC-an 3.B*. TSI agarrean glukosa hartzitzen ez duten bazilo gram-negatiboen kulturak Müller-Hinton agarrean erein, eta 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. Inkubatu ondoren, kutxan pigmentu fluoreszenterik dagoen behatu, eta, ereite-uztai esterila erabiliz, oxidasa-froga egin (8. fitxa) eta mugikortasuna aztertu (4. fitxa). Pseudomonas aeruginosa bazilo gram-negatibo mugikorra eta oxidasa-positiboa da. Müller-Hinton agarrean hazten bada, pigmentu fluoreszenteak kanporatzen ditu. *Bazilo ez-hartzitzaile patogenoak identifikatzeko, hainbat eskema daude, baina gidaliburu honetan Pseudomonas aeruginosa identifikatzeko frogak baino ez ditugu aipatuko. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 14. gaia: «Bazilo gram-negatibo enteropatogenoak I». o 16. gaia: «Gaixotasuna eragiten duten beste bazilo gram-negatibo batzuk». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 16. kapitulua: «Enterobacteriaceae familia». o 21. kapitulua: «Pseudomonas eta Acinetobacter generoak». 48

49 10. FITXA. ANTIBIOGRAMA-AGARREAN (BAUER-KIRBY FROGA) Helburua: Patogeno baten antibiotikoekiko sentikortasuna neurtzea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Torunda esterila Pintzak Erregela Inkubagailua Hazkuntza-inguruak NaCl soluzio esterildun saiodi bat Müller-Hinton agardun kutxa bat Erreaktiboak Iragazki-paperezko diskoetan jarritako 5 antibiotiko Prozedura 1. Antibiograma inokulatzeko 10 8 zelula/ml-ko bakterio-esekidura bat prestatu. Ikus 10. BIDEOA: Horretarako, ereite-uztai esterila erabiliz, bazilo gramnegatiboaren kultura puru batetik bakterioak NaCl soluzio esterilean eseki. Kontzentrazioa egokia dela egiaztatzeko, esekiduraren uhertasuna 0,5 Mc Farland estandarrarekin alderatu. 2. Müller-Hinton agarra duen kutxa batean kultura puruaren esekidura saskian erein. Hori lortzeko, torunda esteril bat bakterio-esekiduran busti, eta agarraren gainetik igurtzi, ezkerretik eskuinera marrak ahalik eta hurbilen eginez. Gainazal guztia bete ondoren, kutxa itxi, eta 60º biratu berriro zabaldu aurretik. Torunda berarekin eta aurretik egindako marrak gurutzatuz marrak egin beste norabidean. Kutxa itxi, eta 60º biratu, berriro zabaldu aurretik. Hirugarren aldiz torunda berarekin azkeneko marrak gurutzatuz marra berriak egin beste norabidean. Inokulua lehortzen utzi. 3. Iragazki-paperezko 4 edo 5 disko aukeratu, antibiotiko kantitate ezagunekoak, eta pintzaz agarraren gainean ezarri, elkarren artean ahalik eta urrunen kokaturik, kutxaren ertzetik urrun. Kutxa 37 ºC-an 18 orduz inkubatu. 49

50 Antibiograma. Bakterioaren kultura inkubatzen den bitartean, antibiotikoa iragazki-paperetik agarrera zabalduko da. Diskotik distantzia jakin batera egongo da hazkuntzaren inhibizioa eragiteko gutxieneko kontzentrazio-puntua. Puntu horretatik aurrera mikroorganismoa hazi egingo da. Beraz, inhibizio-eremu bat sortuko da disko bakoitzaren inguruan. Eremu baten diametroa proportzionala da, diskoak duen antibiotiko-kontzentrazioa eta horren eragina kontuan izanda. Baldintza guztiak estandar zehatz batzuetara ekarriz gero, antibiotikoak alderatzeko modua izango dugu, eta, hala, zehaztu ahal izango dugu zein den organismo bakoitzerako erabilgarria. 4. Antibiogramaren irakurketa. Erregela batekin eta kutxaren atzeko aldetik, inhibizio-eremuen diametroak milimetrotan neurtu. 50

51 10.1 irudia. Antibiograma agarrean. 5. Antibiograma interpretatu, antibiotiko bakoitzaren hazkuntzaren inhibizioa eragiteko gutxieneko kontzentrazio-puntuari dagokion diametroarekin alderatuz. Adibidez, zefotaximarako inhibizio-eremuaren diametroa 29 mm-koa bada, bakterioa zefotaximarekiko sentikorra da, National Committee for Clinical Laboratories Standards erakundeak argitaratutako informazioaren arabera. Antibiotikoa Erresistentea Bitartekoa Sentikorra Zefotaxima < >23 Ziprofloxazina < >21 Penizilina < >21 Gentamizina < >15 National Committee for Clinical Laboratories Standards Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 9. gaia: «Antimikrobianoen jardueraren oinarri biologikoak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 10. kapitulua: «Antibakterianoak». 51

52 11. FITXA: ONDDO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA Helburuak: Ohiko mikosien onddo espezie eragileak laborategian identifikatzea. o Orofaringeko laginetik Candida albicans onddo dimorfikoa bakartzea eta identifikatzea. o Aspergillus generoa, lizun oportunista, mikroskopioan bereiztea. o Onddo dermatofitoak (Microsporum, Trichophyton eta Epidermophyton generokoak) mikroskopioan bereiztea. Materialak Tresnak Ereite-uztaia Torunda Inkubagailua Tanta-kontagailua Porta Estalkia Mikroskopioa Murgiltze-olioa Hazkuntza-inguruak Sabouraud agardun kutxa Giza plasmadun saiodia Aurretik egindako prestakinak: Aspergillus spp. Microsporum spp. Epidermophyton spp Trichophyton spp. Kultura puruak Candida albicans Aspergillus sp. Microsporum sp. Prozedura 52

53 1. Ikasle bakoitzak bere ikaskideari, mihia depresorearekin zapalduz eta torunda esterila erabiliz, orofaringeko lagina hartu. Torunda erabiliz Sabouraud agar kutxa batean «saski» eran erein. Ikus 11. BIDEOA: Kutxa 25 ºC-an 48 orduz inkubatu. Sabouraud agarraren irakurketa: Inguru hori onddoak hautatzeko diseinatuta dago, ph azidoa eta hainbat antibakteriano dituelako bakterioen hazkuntza inhibitzeko. Beraz, Sabouraud agarrean hazten diren koloniak onddoenak baino ez dira. Kolonien itxura makroskopikoak Sabouraud agarrean legamiak eta lizunak bereizteko balio du. Legamien koloniak zuriak eta krematsuak dira. Lizunen koloniak, aldiz, hainbat koloretakoak izan daitezke (marroiak, urdinak, berdeak, zuriak edo beltzak), hazkuntza zentrokidea, eta, goiko aldetik ikusita, hauts edo kotoi itxura dute irudia. Sabouraud agarrean onddo mikroskopikoen koloniak: legamiak (ezkerrean) eta lizunak (eskuinean). 53

54 2 A. Sabouraud agarrean legamien itxurako koloniak agertzen badira, filamentazio-testa egin Candida albicans espezie patogenoa identifikatzeko. Horretarako, uztai esterila erabiliz zelula batzuk hartu, eta giza plasman erein. Saiodia 37 ºC-an 2 orduz inkubatu ondoren, plasma tanta bat hartu eta porta batean jarri. Estalki batekin zapaldu eta mikroskopioan aztertu hodi germinalen bila. Gure inguruan onddoek eragindako infekzio arruntena kandidiasia da. Nahiz eta Sabouraud agarrean legamia moduan hazi, Candida albicans onddo dimorfikoa da eta gizakia inbaditzen duenean harikara bihurtzen da irudia. Filamentazio-test positiboa (hodi germinala). Filamentazio-testaren irakurketa. Legamiaren batek ernamuinaren ordez hodi luze bat (hodi germinala) agertzen badu, froga positiboa da. Horrek esan nahi du bakartutako legamia Candida albicans dela. Filamentazio-testa negatiboa dela ziurtatzeko, porta osoa sistematikoki aztertu beharko da, eta hodi germinalik bat ere aurkitu ez. Horrela bada, bakartutako legamia Candida generoko beste espezie batekoa edo beste legamia genero batekoa da. Legamien espezieak bereizteko karbono-iturri gisa zer azukre mota erabil dezaketen ikertzen da. 2B. Lizunen espezieak bereizteko ugaltze-mizeliotik hartutako laginak, laktofenol urdinarekin tindatu ondoren, mikroskopioan aztertzen dira, makrokonidioen itxura bereizgarriari erreparatzeko. Aurretik 54

55 egindako prestakinak erabiliz eta gidan agertutako irudiekin alderatuz, Aspergillus, Microsporum, Trichophyton eta Epidermophyton generoak identifikatu irudia. Aspergillus generoko konidioak (ezkerrean) eta dermatofito bateko makrokonidioak (eskuinean). Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 30. gaia: «Onddoak eta mikosiak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 27. kapitulua: «Onddo patogenoen ezaugarri orokorrak». o 28. kapitulua: «Gainazaleko, larruazaleko eta larruazalpeko mikosiak». o 29. kapitulua: «Mikosi sistemikoak eta oportunistak». 55

56 12. FITXA: PROTOZOO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA Helburua: Protozoo espezie patogeno nagusien forma diagnostikoak bereiztea: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Toxoplasmaa gondii, Trypanosoma spp, Plasmodium spp. Materialeak Aurretik egindako prestakinak: Entamoeba histolyticaren kisteak Entamoeba histolyticaren trofozoitoak Giardia lambliaren kisteak Giardia lambliaren trofozoitoak Toxoplasma gondii Trypanosoma spp. Plasmodium spp Prozedura 1. Mikroskopioetan fokatuta dauden prestakinak aztertuz, protozoo patogenoen forma diagnostikoak bereiztea : o digestio-aparatukoak (Entamoeba eta Giardia) gorozki-laginen prestakinetan, o odolekoak (Trypanosoma eta Plasmodium) odol-frotisetan eta o ehunetakoa (Toxoplasma) gongoileko biopsiaren lagin batean. 56

57 12.1 irudia. Entamoeba histolyticaren trofozoitoa (ezkerrean) eta kistea (eskuinean) irudia. Giardia lambliaren trofozoitoa (ezkerrean) eta kistea (eskuinean) irudia. Odoleko Trypanosomaren trofozoitoak (ezkerrean) eta Plasmodiumaren trofozoitoak (eskuinean) irudia. Toxoplasma gondiiaren takizoitoak. 57

58 Kasu batzuetan bakartzea eta laborategian kultura puruak egiten badira ere (Leishmania kasuan, adibidez) protozooek eragindako infekzioen diagnostikoaren oinarria morfologia mikroskopikoa da. Nahiz eta protozoo patogeno asko gurean endemikoak ez izan, nazioarteko bidaietatik ekarritako kasuak garaiz diagnostikatzeko funtsezkoa da bakoitzaren bizi-zikloa eta banaketa geografikoa ondo ezagutzea. Horrela jakingo dugu zer lagin eskatu eta zer forma bilatu beharko ditugun (trofozoitoak, kistea) diagnostikoa egiteko. Lagin klinikoak odola, gorozkiak edo, gutxitan, biopsiak izaten dira. Ahal denean tindatu gabeko laginen behaketa zuzena egingo da protozooen mugimendua nabarmentzeko. Horretaz gain, prestakin iraunkorrak egingo dira, ezaugarri morfologiko zehatzak ikertzeko eta, hala, espezieen diagnostikoa egiteko. Odol-laginaren kasuan, odol-tanta lodiak eta frotisak Giemsa-rekin tindatu ondoren aztertuko dira. Biopsiak Giemsarekin edo antzeko tindagaiekin aztertzen dira, eta gorozkiak iodoarekin edo kromoarekin tindatuko dira. Bizitzan zehar protozoo patogenoak ostalari batean edo batean baino gehiagotan biziko dira, eta askotariko itxurak hartuko dituzte. Oro har, ugaltzen den eta metabolismo aktiboa duen formari trofozoito deritzo. Ostalarien arteko transmisioa zuzena denean, trofozoitoak baino ez daude, baina ostalari batetik bestera joateko ingurutik joaten diren protozooek erresistentzia formak eratzen dituzte, kiste deitutakoak. Kisteak ere infekziosoak dira, eta behin beste ostalariaren barruan daudenean trofozoito aktibo bihurtzen dira. Protozoo batzuen bizi-zikloak sinpleak dira eta gizakia haien ostalari bakarra da. Entamoeba histolyticak edo Trichomonas vaginalisak horrelako bizi-zikloak dituzte, eta, horregatik, gurean ez ezik, askotariko eragin-tasa izanik ere, munduko beste lurralde guztietan ere ageri dira. Beste espezie batzuk bi ostalari motatan ugaltzen dira: gizakian eta beste animalia batean, zeina askotan artropodo espezie transmisorea (bektorea) izaten baita. Orduan, banaketa geografikoa bektorearen banaketarekin bat dator. Plasmodium espezieentzako bektorea Anopheles generoko eltxo emea da. Fitxa honetan landutako kontzeptuak gaitegi teorikoan azaltzen dira: o 32. gaia: «Medikuntzan garrantzia duten protozooak». Bibliografia: Mikrobiologia medikoa. o 30. kapitulua: «Protozoo eta helminto patogenoak». o 31. kapitulua: «Hesteetako eta traktu genitaleko protozooak». o 32. kapitulua: «Odol eta ehunetako protozooak». 58

59 13. FITXA. HELMINTO PATOGENOEN IDENTIFIKAZIOA Helburua: Helminto espezie patogeno nagusien forma diagnostikoak bereiztea: Fasciola hepatica, Taenia spp, Echinococcus granulosus, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis. Materialak Aurretik egindako prestakinak: Nematodoak: Enterobius vermicularisaren har heldua Enterobius vermicularisaren arrautza Ascaris lumbricoidesaren har helduak Ascaris lumbricoidesaren arrautzak Trichinella spiralisaren har helduak Trichinella spiralisaren larbak Nahasitako giza helmintoen arrautzak Zestodoak edo teniak: Taenia soliumaren proglotideak eta eskolexak Taenia generoaren arrautzak Echinococcus granulosusaren har heldua Echinococcus granulosusaren larba hidatidea Tremadodoak edo duelak: Fasciola hepaticaren arrautza Fasciola hepaticaren larba mirazidioa Fasciola hepaticaren larba errediak Fasciola hepaticaren larba zerkaria Fasciola hepaticaren har heldua Prozedura Helmintoak zelula anitzeko eukariotoak dira eta hiru taldetan sailkatzen dira: 1) trematodoak, hosto itxurako har zapalak; 2) zestodoak, zatitan banatutako zinta itxurako har zapalak, eta 3) nematodoak, har zilindrikoak. Gutxi batzuk gizakiaren parasitoak dira eta batzuetan gaixotasunak eragiten dizkigute. Helmintoen bizi-zikloetan gizakia izan daiteke behin betiko ostalaria (helduak eta arrautzak dituenean) edo behin-behinekoa (larbak dituenean). Helmintiasi askotan eosinofilia seinale lagungarria da, baina, 59

60 nolanahi ere, laborategiko identifikazioa beharrezkoa da diagnostikoa egiteko. Diagnostiko morfologikoa, makroskopikoa eta batez ere mikroskopikoa dira parasitosien diagnostikoaren oinarria. Gure lurraldean, parasitoak hilgarri izan daitezke soilik diagnostikoa beranduegi heltzen denean. Helminto patogeno bakoitzaren bizi-zikloa eta banaketa geografikoa ondo ezagutzea funtsezkoa da. Horrela jakingo dugu zer lagin eskatu eta zer forma bilatu beharko dugun (arrautza ala larba), diagnostikoa egiteko. Lagin klinikoak odola, gorozkiak edo, gutxitan, biopsiak izaten dira. Gorozkiak batzuetan prozesatzen dira parasitoak kontzentratzeko eta, ondoren, iodoarekin edo kromoarekin tindatuko dira. 1. Mikroskopioetan helminto patogenoen forma diagnostikoak bereiztea: o Digestio-aparatuko helmintoen kasuan (Fasciola, Taenia, Enterobius eta Ascaris), arrautzak bereiztea gorozki-laginen prestakinetan. o Ehunetako helmintoen kasuan, Echinococcusaren eta Trichinellaren larbak bereiztea, kiste hidatidikoaren hondarretan eta muskuluaren biopsiaren laginetan, hurrenez hurren irudia. Digestio-aparatuko helmintoen arrautzak. Ascaris lumbricoides Fasciola hepatica Taenia spp. Enterobius vermicularis 13.2 irudia. Ezkerrean, Trichinellaren larbak muskulu-biopsian, eta, eskuinean, hondar hidatidikoa (Echinococcus granulosusaren larbak). 60